Lipossomas PEGuilados Carregados com Bufalina:Eficácia Antitumoral, Toxicidade Aguda e Distribuição nos Tecidos

Resumo

Bufalin, derivado de Venenum Bufonis , exerce efeitos antitumorais, mas tem baixa biodisponibilidade e efeitos adversos quando administrado como um único agente. O objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades físicas e químicas, eficácia antitumoral, farmacologia geral, toxicidade aguda e perfil de distribuição nos tecidos de lipossomas PEGuilados carregados com bufalina (BF / PEG-LP), que foram preparados em um estudo anterior. Para avaliar a segurança da preparação, foi realizado um teste de hemólise de glóbulos vermelhos, que indicou que a taxa de hemólise de BF / PEG-LP foi significativamente menor do que a de bufalina sozinho. O ensaio de viabilidade celular revelou que os lipossomas em branco não eram tóxicos. Em um experimento in vitro, BF / PEG-LP induziu de forma dependente da dose a apoptose de células cancerosas HepG2, HCT116, A549 e U251, com metade da concentração inibitória máxima (IC ₅₀ ) valores de 21,40 ± 2,39, 21,00 ± 3,34, 43,39 ± 6,43 e 31,14 ± 2,58 ng / mL, respectivamente, às 24 h. Experimentos de xenoenxerto de tumor em camundongos nus mostraram que BF / PEG-LP inibiu significativamente o crescimento de células U251. A avaliação farmacológica revelou que o BF / PEG-LP impactou o comportamento geral, atividades independentes e coordenação dos camundongos após uma semana de administração em comparação com os dos camundongos do grupo de controle. Em um teste de toxicidade aguda, a concentração letal média (LD ₅₀ ) de BF e BF / PEG-LP em camundongos foi de 0,156 e 3,03 mg / kg, respectivamente. Os perfis de distribuição nos tecidos mostraram que a concentração de BF no tecido cerebral foi 20% maior, enquanto que no tecido cardíaco foi 30% menor quando o BF / PEG-LP foi administrado a camundongos em comparação com o BF. Assim, BF / PEG-LP exibiu hemólise e citotoxicidade mais baixas e propriedades farmacocinéticas e antitumorais melhoradas em comparação com a bufalina sozinha, indicando seu potencial para futura aplicação farmacológica, particularmente para tratamento de glioma.

Introdução

Bufalina (BF; 3β, 14-dihidroxi-5β, 20 (22) -bufadienolida, 5β, 20 (22) -bufadienolida-3β, 14-diol), extraída de Venenum Bufonis , tem atividades antiinflamatórias, cardiotônicas, antivirais, acesódinas e antitumorais [1, 2]. Nosso grupo também revelou que o BF tem efeitos terapêuticos no hepatoma, melanoma, carcinoma do cólon, glioma e carcinoma epitelial do ovário, que podem ser atribuídos à sua inibição da proliferação celular e indução da apoptose celular [3,4,5,6,7] .

Lan et al. [8] estabeleceu anteriormente um modelo de xenoenxerto de glioma em camundongos nus, ao qual BF foi administrado diariamente por via intraperitoneal (i.p . ) injeção. No grupo tratado com BF, quase nenhum grão binuclear e mitose foram observados; além disso, os nucléolos eram menores e a morfologia celular era mais regular do que no grupo controle. Embora o BF tenha muitos efeitos farmacológicos potenciais e os resultados obtidos até o momento sejam promissores, o BF como agente único ainda está longe de ter aplicação clínica. Além disso, o tratamento com BF está associado a efeitos colaterais e adversos indesejáveis, como imunorreação, lesão de tecidos normais e alta toxicidade [9].

Vários sistemas de liberação de drogas, como emulsões lipídicas, nanopartículas e lipossomas, têm sido empregados para promover a solubilidade, a atividade farmacológica e a biodisponibilidade do BF [10, 11]. Além disso, as automontagens poliméricas funcionais ativas por emissão induzida por agregação (AIE) têm mostrado grande potencial para várias aplicações biomédicas, incluindo imagens biológicas e entrega intracelular de drogas [12, 13]. Entre estes sistemas de entrega de drogas, as preparações lipossomais têm várias vantagens para uso como sistemas de entrega intravenosa (i.v.). As preparações lipossomais podem não apenas melhorar a solubilidade em água e reduzir os efeitos colaterais dos agentes carregados [14], mas também transportar os agentes através da barreira hematoencefálica (BBB) ​​de modo a tratar o tumor cerebral de forma mais eficaz e eficiente [15] . A BBB é composta de células endoteliais capilares cerebrais e as junções estreitas entre elas, células em forma de estrela, células gliais e a membrana basal, que permitem que apenas drogas altamente solúveis em lipídios passem e se dispersem no tecido cerebral [16]. No entanto, as preparações de lipossomas têm algumas deficiências. A absorção pelas proteínas plasmáticas e o reconhecimento pelo sistema fagocítico mononuclear causam uma rápida eliminação do sangue do fármaco carregado. No entanto, a modificação da superfície dos lipossomas com PEG poderia resolver esses problemas [17].

Em pesquisas anteriores, preparamos lipossomas PEGuilados carregados com bufalina (BF / PEG-LP) e caracterizamos os mesmos, incluindo sua citotoxicidade e perfis farmacocinéticos, na tentativa de superar os desafios mencionados acima, aumentar a eficácia da entrega do medicamento e diminuir a toxicidade. Para estender essa pesquisa, avaliamos ainda as propriedades físicas e químicas, eficácia antitumoral, toxicidade aguda e perfis de distribuição de tecido de BF / PEG-LP.

Materiais e métodos

Produtos Químicos e Reagentes

BF e cinobufagina (CBG) foram adquiridos de BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (BaoJi, China; pureza de 98%, identificada por HPLC) e dissolvidos em DMSO para armazenamento a -20 ° C como soluções estoque. CBG foi usado como o padrão interno (IS). A doxorrubicina (DOX) foi adquirida de Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. (Beijing, China; pureza de 98%, identificada por HPLC) e dissolvida em DMSO para armazenamento a -20 ° C como soluções estoque. BF / PEG-LP foram preparados em nosso laboratório (tamanho de partícula, 155,0 ± 8,46 nm; potencial zeta, - 18,5 ± 4,49 mV; eficiência de aprisionamento, 76,31% ± 4,23%, detectada por HPLC) [6]. O ácido fórmico de grau HPLC foi adquirido na Tedia Company Inc. (Fairfield, OH, EUA). O kit 8 de contagem de células (CCK-8) foi adquirido em Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japão). O acetato de etilo de grau HPLC foi adquirido em Tianjin Kermel Chemical Reagents Development Center (Tianjin, China). O acetonitrilo de grau HPLC foi adquirido à Merck (Darmstadt, Alemanha). Todos os outros reagentes foram de grau analítico.

Animais

Ratos Sprague-Dawley machos, pesando aproximadamente 230–250 g; Camundongos Kunming, pesando 18–22 g; e camundongos Balb / c nus de 6 semanas de idade foram fornecidos pelo Experimental Animal Research Center, Fourth Military Medical University (Xi'an, China). Os animais foram mantidos separadamente em um sistema de gaiola ventilada individualmente (CIV) e alimentados com ração padrão de laboratório e água ad libitum por 5 dias. Todos os animais jejuaram (exceto água) durante a noite antes dos experimentos. Os procedimentos experimentais envolvendo animais foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da Quarta Universidade Médica Militar (Aprovação 2017-0603-R).

Preparação de amostras padrão

As curvas de calibração foram preparadas adicionando 100 μL de homogenato de tecido com 20 μL de cada uma das soluções de trabalho para produzir amostras contendo 20, 50, 200, 500 e 2000 ng / mL de BF. As amostras de homogenato padrão enriquecidas foram preparadas com antecedência e avaliadas com cada lote analítico de amostras desconhecidas.

Segurança dos lipossomas

Teste de hemólise de hemácias

Oito mililitros de sangue foram coletados de ratos e posteriormente heparinizados e diluídos em 10 mL de solução salina 0,9% normal. As amostras de sangue total foram então misturadas com 100 μL de solução de BF ou 1 mL de suspensão de BF / PEG-LP. Após 40 min de imersão em banho-maria mantido a 37 ° C, as amostras foram centrifugadas a 750 g por 5 min para remover os RBCs e seus fragmentos. O sobrenadante foi precipitado em 2 mL de solução de etanol / ácido clorídrico (39:1; 99% de etanol ( v / v ):37% de ácido clorídrico ( w / v )). O sobrenadante foi centrifugado a 750 g por 5 min, após o qual a absorbância foi medida a 398 nm por um espectrofotômetro de UV. Um controle positivo consistindo de água destilada e um controle negativo consistindo de solução salina 0,9% foram preparados e medidos da mesma maneira.

A taxa de hemólise (HR%) da suspensão de nanopartículas foi calculada da seguinte forma:
$$ \ mathrm {HR} \% =\ left ({\ mathrm {A}} _ {\ mathrm {sample}} - {\ mathrm {A}} _ {\ mathrm {negativo}} \ right) / \ left ({\ mathrm {A}} _ {\ mathrm {positivo}} - {\ mathrm {A}} _ {\ mathrm {negativo}} \ certo) \ times 100 \% $$
onde A _amostra é a absorbância da amostra, A _negativo é a absorbância do controle negativo, e A _positivo é a absorbância do controle positivo.

Citotoxicidade dos lipossomas em branco

O CCK-8 foi usado para detectar a citotoxicidade de lipossomas em branco em células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano e células HCT116 de câncer de cólon humano. Células HepG2 suspensas e células HCT116 (1 × 10 ⁴ células / poço) foram inoculados em uma placa de 96 poços e cultivados por meio de cultura RPMI-1640 até a fase logarítmica. Diferentes concentrações de lipossomas em branco foram adicionadas ao meio de cultura. Seis poços replicados foram preparados para cada concentração. Após incubação por 24 h, o meio foi descartado e 100 μL de solução de trabalho CCK-8 (CCK-8:meio de cultura RPMI-1640, 10:100) foram adicionados. Após 2 h de incubação, a absorbância foi detectada e quantificada a 450 nm por um leitor de microplacas (Bio-Rad 680, Hercules, CA, EUA).

Efeito do pH ambiental na estabilidade dos lipossomas

BF / PEG-LP foram preparados por hidratação com solução salina tamponada com fosfato (PBS) em pH 7,4 e pH 5,0, respectivamente. Os lipossomas foram armazenados a 4 ° C no escuro. A absorvância das amostras a 296 nm foi medida a 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min.

Experiência In Vitro

A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de proliferação CCK-8. As células HepG2, HCT116, A549 e U251 foram semeadas individualmente a uma densidade de 1 × 10 ⁴ células / poço em placas de 96 poços a 37 ° C com 5% ( v / v ) CO ₂ . Após 24 h, diferentes concentrações de BF / PEG-LP foram adicionadas aos poços. Após mais 24 horas de incubação, o meio celular foi descartado e 100 μL de solução de trabalho CCK-8 foram adicionados. Após 2 h de incubação, a absorbância foi detectada e quantificada a 450 nm por um leitor de microplacas (Bio-Rad 680). A porcentagem de células viáveis ​​e IC ₅₀ os valores foram estimados a partir de uma curva dose-resposta. Os valores de cada amostra e controle foram determinados pela média de seis poços replicados.

Experiência de xenoenxerto de tumor

Células U251 (1 × 10 ⁷ ) em 0,15 mL de PBS foram inoculados por via subcutânea em camundongos nus e deixados crescer por 7 dias para atingir um tamanho de tumor de mais de 50 mm ³ . Em seguida, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos com seis ratos cada. No grupo de tratamento, 0,5, 1,0 ou 2,0 mg / kg / dia de BF ou BF / PEG-LP foi i.p. injetado por 21 dias consecutivos. PBS contendo 0,1% de DMSO foi injetado no grupo de controle do veículo, enquanto 2 mg / kg de cisplatina (DPP) foram injetados no grupo de controle positivo.

O peso corporal dos ratos foi medido a cada 2 dias. Todos os camundongos tratados com BF e BF / PEG-LP foram observados cuidadosamente quanto às condições da pele e do cabelo, volume de alimento e ingestão de água, características fecais e mudanças comportamentais. No final dos experimentos, os camundongos foram sacrificados e os xenoenxertos de tumor foram removidos e pesados. Os tumores transplantados foram então fixados em solução de paraformaldeído 4% e incluídos em parafina. Cortes de cinco mícrons de espessura foram preparados e corados com hematoxilina e eosina (H&E). O crescimento e a necrose das células tumorais e a infiltração dos tecidos circundantes foram observados à microscopia óptica.

Avaliação Farmacológica

Comportamento geral e atividades independentes

Cinquenta ratos Kunming foram divididos aleatoriamente em cinco grupos ( n =10 por grupo) que foram i.p. administrado o seguinte em uma dose única:solução salina no volume administrado ao grupo de controle, 20 mg / kg de pentobarbital sódico como o grupo de controle positivo e 1,0, 1,5 e 2,0 mg / kg como o baixo, médio e alto -dose de grupos BF / PEG-LP. O comportamento geral, postura, marcha, salivação, miofibrilação, nistagmo e secreções dos camundongos foram então observados. Após 1 hora de administração, os camundongos foram colocados em uma caixa de campo aberto. O número de camundongos que se moviam na caixa foi contado por 10 min após os camundongos terem se adaptado por 1 min.

Testes de exercício coordenado

Os ratos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos ( n =10 por grupo, metade masculino e metade feminino) que eram i.p. administrou o seguinte:soro fisiológico no volume administrado ao grupo de controle em branco, 2,5 mg / kg de cloridrato de clorpromazina como o grupo de controle positivo; e 1,0, 1,5 e 2,0 mg / kg de BF / PEG-LP como os grupos de BF / PEG-LP de baixa, média e alta dose, respectivamente.

Uma haste metálica lisa (diâmetro 1,27 cm, comprimento 80 cm) foi colocada perpendicularmente ao solo e fixada na parte inferior para mantê-la em pé. Após 1 semana de tratamento, o teste de escalada foi realizado por 30, 60 e 120 min, respectivamente. Os ratos foram colocados no topo da haste de metal e deixados rastejar para baixo naturalmente. A coordenação dos camundongos conforme eles desciam pela haste de metal foi observada e pontuada. Os critérios de pontuação foram os seguintes:0 pontos, descida passo a passo; 1 ponto, descida deslizante; 2 pontos, incapacidade de descer; e 3 pontos, nenhum reflexo observado.

Toxicidade Aguda

A concentração letal média (LD ₅₀ ) de BF e BF / PEG-LP foi calculado para avaliar a toxicidade aguda. Um total de 110 camundongos Kunming (metade machos e metade fêmeas) foram divididos aleatoriamente em 11 grupos ( n =10). Cinco grupos receberam um único i.v. dose de BF a 1,0, 0,37, 0,14, 0,05 ou 0,02 mg / kg, e cinco grupos receberam um único i.v . dose de BF / PEG-LP a 4,0, 2,83, 2,0, 1,41 ou 1,0 mg / kg. O volume de injeção foi de 0,2 mL. O BF foi dissolvido primeiro em solução salina normal com 1% de DMSO; BF e BF / PEG-LP foram então diluídos com solução salina normal para obter a concentração desejada. O grupo controle recebeu solução salina normal contendo 1% de DMSO. Após o tratamento, o comportamento geral dos camundongos foi observado por 14 dias e a taxa de mortalidade foi registrada. As mudanças patológicas nos ratos após i.v . administração foram observadas por microscopia óptica (NIKON Eclipse ci, Tóquio, Japão).

Estudo de distribuição de tecidos usando HPLC

Ratos Sprague-Dawley foram atribuídos aleatoriamente a duas seções (quatro grupos em cada seção, n =6 por grupo). Essas duas seções foram i.p . administrado 0,5 mg / kg de BF e BF / PEG-LP, respectivamente. Amostras dos principais tecidos, incluindo coração, fígado, baço, pulmão, rim e cérebro, foram coletadas 5, 15, 45 e 90 minutos após a administração. As amostras de tecido foram rapidamente enxaguadas com solução salina (0,9%), retirando-se o sangue e o conteúdo conforme apropriado. Após a limpeza, papel de filtro foi usado para secar as amostras. As amostras foram pesadas e depois homogeneizadas em solução salina 0,9% (amostra de tecido para solução salina, 1:2, w / w ) Os homogenatos obtidos foram armazenados a -80 ° C até a análise.

Os compostos alvo foram extraídos, e a interferência da proteína endógena foi eliminada por um método de preparação líquido-líquido [18]. Descobrimos que o acetato de etila melhorou a recuperação da extração e minimizou a interferência endógena, resultando em maior sensibilidade e seletividade na detecção de BF. Consequentemente, o acetato de etila foi utilizado como o solvente ideal para a preparação da amostra. Vinte microlitros da solução de trabalho IS foram adicionados a uma alíquota de 100 μL de homogenato de tecido. Em seguida, as amostras foram misturadas em vórtice por 30 se extraídas com 2,5 mL de acetato de etila por 2 min. Após centrifugação a 3500 g durante 10 min, a camada orgânica superior foi transferida para outro tubo e evaporada a 45 ° C sob uma corrente suave de azoto. O resíduo foi reconstituído em 100 μL de fase móvel (acetonitrila:solução de ácido fórmico / água 0,1%, 65:35, v / v ) por meio de mistura de vórtice por 5 min e centrifugação a 12000 g por 10 min. Em seguida, uma alíquota de 10 μL do sobrenadante foi injetada no sistema de HPLC (Waters 2995/2996, Waters Corporation, Milford, MA, EUA). As condições cromatográficas otimizadas para detecção de BF e IS foram apresentadas anteriormente [6].

Análise estatística

Todos os resultados foram expressos como média ± DP ( n =3), e as diferenças entre as formulações foram comparadas por análise de variância unilateral (ANOVA), usando o software GraphPad Prism 5. P <0,05 denota significância em todos os casos.

Resultados e discussão

Propriedades físicas e químicas do BF / PEG-LP

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) revelou que o BF / PEG-LP tinha uma forma esférica uniforme, conforme mostrado no Arquivo adicional 1:Figura S1A. A estrutura do BF / PEG-LP foi identificada por FT-IR. Conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S1B, os picos característicos em 3495 cm ⁻¹ e 3436 cm ⁻¹ representou a vibração de alongamento N – H da ligação amida, enquanto o pico em 1079 cm ⁻¹ representou a vibração de alongamento C – O – C da ligação éter em BF / PEG-LP. Para avaliar a segurança das formulações in vitro, a taxa de hemólise de lipossomas em branco, BF e BF / PEG-LP foi determinada por um teste de hemólise de RBC, e a viabilidade celular de células HepG2 e HCT116 tratadas com lipossomas em branco foi medida por CCK Ensaio -8. O grupo BF exibiu hemólise óbvia; no entanto, a taxa de hemólise do grupo BF / PEG-LP foi significativamente menor na mesma concentração ( P <0,01). Quando a concentração de BF / PEG-LP foi aumentada para 200 μg / mL, a taxa de hemólise foi obviamente maior do que a dos lipossomas em branco ( P <0,01, Fig. 1a). Os resultados do ensaio CCK-8 mostraram que os lipossomas em branco não eram tóxicos nas células HepG2 e HCT116 (Fig. 1b).

Propriedades físicas e químicas do BF / PEG-LP. a Taxa de hemólise de glóbulos vermelhos de lipossomas em branco, BF e BF / PEG-LP. Os dados são apresentados como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =3). ** P <0,01 vs . Grupo BF / PEG-LP na mesma concentração. b Citotoxicidade de lipossomas em branco em células HepG2 e HCT116. Os dados são apresentados como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). c Estabilidade do BF / PEG-LP em diferentes condições de pH. Os dados são apresentados como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). ** P <0,01 vs . grupo de pH 7,4 no mesmo ponto de tempo. Abreviaturas:BF, bufalin; BF / PEG-LP, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina

O efeito do pH ambiental na estabilidade do BF / PEG-LP foi avaliado por espectrofotometria de UV. A Figura 1c mostra que a absorbância da amostra do grupo de pH 5,0 aumentou com o tempo de armazenamento, indicando que BF / PEG-LP era mais estável em PBS a pH 7,4 ( P <0,01).

Apoptose de células tumorais in vitro

A apoptose em células HepG2, HCT116, A549 e U251 induzida por BF / PEG-LP foi determinada pelo ensaio CCK-8. O IC ₅₀ os valores de BF / PEG-LP para todas as células testadas são apresentados na Tabela 1. BF / PEG-LP diminuiu significativamente a viabilidade de todos os tipos de células de uma maneira dependente da dose (Fig. 2). O efeito inibitório do BF / PEG-LP foi semelhante ao do DOX (controle positivo, 50 μg / mL) em concentrações superiores a 40 ng / mL. Além disso, com base no IC ₅₀ valores, a sensibilidade das células a BF / PEG-LP foi classificada da seguinte forma:HCT116> HepG2> U251> A549.

Citotoxicidade de BF / PEG-LP em HepG2 ( a ), HCT116 ( b ), A549 ( c ), e U251 ( d ) células. Os dados são apresentados como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). * P <0,05, ** P <0,01 vs . grupo de controle para cada linha celular. Abreviaturas:BF / PEG-LP, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina; DOX, doxorrubicina

Avaliação Farmacológica Geral

Após a administração de BF / PEG-LP, o comportamento geral dos camundongos foi diferente daquele do grupo branco. Em particular, os camundongos no grupo BF / PEG-LP de alta dose exibiram tremores e salivação. Após a administração, os camundongos permaneceram na caixa de campo aberto por 10 min, e o número de grades ativas foi registrado. No grupo de controle positivo (pentobarbital), o número de grades ativas foi de apenas 342 ± 35, o que foi significativamente menor do que no grupo de controle (725 ± 127, P <0,05). Como mostrado na Fig. 3a, o número de grades ativas no grupo de BF / PEG-LP de dose média e alta foram significativamente diferentes do grupo de controle. O teste de escalada com haste mostrou que BF / PEG-LP teve um certo efeito de promoção no movimento coordenado de camundongos após uma semana de administração em comparação com o do grupo de controle ( P <0,01), enquanto a clorpromazina teve um efeito de promoção significativo no grupo de controle positivo ( P <0,05), como mostrado na Fig. 3b.

Efeito farmacológico de BF / PEG-LP na atividade locomotora ( a ) e exercício coordenado ( b ) Em ratos. Os dados são apresentados como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =10). * P <0,05, * ^* P <0,01 vs . grupo controle em cada momento; ^# P <0,05 vs. grupo BF / PEG-LP de baixa dose. Abreviaturas:BF / PEG-LP, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina

Experiência de xenoenxerto de tumor

Com a administração prolongada, os camundongos dos grupos controle positivo, BF e BF / PEG-LP apresentaram retardo mental, redução da ingestão de alimentos, reação lenta e pêlo opaco. A morte de camundongos ocorreu em ambos os grupos BF e BF / PEG-LP. A taxa antitumoral do grupo de controle positivo foi de 36,5%; o do grupo de alta dose de amamentação foi de 27,6%; e a dos grupos de BF / PEG-LP de dose baixa, média e alta foi de 11,4%, 28,9% e 38,7%, respectivamente. Exceto para o grupo de BF de baixa dose, houve uma diferença significativa entre as taxas antitumorais dos grupos tratados com drogas e do grupo de controle negativo ( P <0,05), como mostrado na Fig. 4a. Em comparação com o grupo de BF de baixa dose, a taxa de inibição do tumor do grupo de BF / PEG-LP de alta dose foi significativamente maior ( P <0,01), como mostrado na Fig. 4b.

Efeito inibidor de BF e BF / PEG-LP no crescimento de xenoenxertos de glioma em camundongos nus. Comparação do peso do tumor ( a ) e taxa de inibição do tumor ( b ) em cada grupo. Os dados são apresentados como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =10). * P <0,05, ** P <0,01 vs. grupo de controle; ^# P <0,05, ^## P <0,01 vs . grupo BF / PEG-LP de alta dose. c Coloração H&E de tecidos tumorais de camundongos com tumor. Abreviaturas:BF, bufalin; BF / PEG-LP, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina; DPP, cisplatina; H&E, hematoxilina e eosina

Os xenoenxertos nos camundongos com tumor eram de forma nodular. A coloração de H&E mostrou que no grupo de controle, os núcleos das células tumorais eram grandes, o citoplasma era pequeno e o crescimento das células era vigoroso; no grupo de alta dose de BF / PEG-LP, foi observada uma grande área de tecido tumoral necrótico e o grau de necrose era dependente da dose, conforme mostrado na Fig. 4c.

Toxicidade Aguda

A toxicidade aguda de um único i.v . dose das formulações em camundongos Kunming. O LD ₅₀ os valores de BF e BF / PEG-LP foram 0,156 e 3,03 mg / kg, respectivamente. Em comparação com a do BF, a toxicidade aguda do BF / PEG-LP foi significativamente menor ( P <0,01); esse efeito foi atribuído à formulação lipossomal, que controlava a liberação de BF no sangue.

As mudanças patológicas nos ratos após i.v . administração foram observadas por microscopia óptica (Fig. 5). Alterações patológicas foram observadas em vários órgãos, como coração, fígado e rim. A dissolução da fibra miocárdica do coração e a fratura com sangramento eram óbvias. Necrose foi observada em hepatócitos e endotelócitos pulmonares.

Alterações patológicas observadas em camundongos mortos após administração intravenosa de 1,0 mg / kg de BF e 4,0 mg / kg de BF / PEG-LP. As secções de tecido foram coradas com H&E e observadas por microscopia óptica. Notas:Microscópio óptico:NIKON Eclipse ci; Sistema de imagem:NIKON Digital Sight DS-FI2 (Tóquio, Japão); Ampliação:× 200. Abreviaturas:BF, bufalin; BF / PEG-LP, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina; H&E, hematoxilina e eosina

Estudo de distribuição de tecidos

A comparação dos cromatogramas do homogenato de tecido em branco e homogenato enriquecido, que indicou que não houve interferência significativa nos tempos de retenção de BF e CBG (IS), foi usada para avaliar a seletividade do método, conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S2. As curvas de calibração foram construídas a partir das razões de área de pico de BF para IS (Y) versus concentrações de homogenato de tecido variando de 20 a 2.000 ng / mL, com um coeficiente de correlação R ² > 0,9977 (Tabela 2). Os experimentos de precisão, exatidão e recuperação de BF em amostras biológicas foram mostrados no arquivo Adicional 1:Tabela S1, enquanto os resultados do experimento de estabilidade foram mostrados no Arquivo Adicional 1:Tabela S2.

Os dados brutos dos experimentos de distribuição de tecido são mostrados no arquivo adicional 1:Tabela S3. Depois de i.v . injeção de BF / PEG-LP, a distribuição do mesmo nos tecidos é influenciada por diversas variáveis, como composição, tamanho de partícula e potencial zeta [19]. A concentração de BF em vários tecidos, incluindo o coração, fígado, baço, pulmão, rim e cérebro, foi quantificada em 5, 15, 45 e 90 min, conforme mostrado na Fig. 6. Aos 45 min após iv . Na administração, a concentração de BF em ambos os grupos foi muito baixa em alguns tecidos, como coração, fígado, baço, pulmão e rim, indicando que a distribuição e eliminação do BF ocorreram rapidamente. A concentração de BF no cérebro, embora não em outros tecidos, ainda pode ser detectada 90 min após i.v . administração em ambos os grupos, indicando que a distribuição e eliminação do BF foram relativamente mais lentas no cérebro do que em outros tecidos.

Distribuição tecidual de BF em órgãos de ratos. A Fórmulas moleculares de bufalin ( a ) e cinobufagina ( b , É). B Perfis de distribuição tecidual de BF em ratos após uma única dose intravenosa de BF / PEG-LP ou BF a 0,5 mg / kg. Os dados são apresentados como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). Abreviaturas:BF, bufalin; BF / PEG-LP, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina; IS, padrão interno

Enquanto isso, BF 1,20 vezes maior (333 ± 92,5 ng / g em 5 min) foi detectado nos tecidos cerebrais do grupo BF / PEG-LP em comparação com o do grupo BF. Além disso, uma concentração mais alta de BF foi encontrada no fígado, baço e tecidos cerebrais no grupo BF / PEG-LP. Acúmulo significativo de BF foi detectado no fígado, com concentrações de 187 ± 31,0 ng / g no grupo BF / PEG-LP e 163 ± 35,0 ng / g no grupo BF ( P <0,01). Um fenômeno semelhante, que é causado principalmente por um aumento dramático no BF no sangue antes do metabolismo e excreção, foi observado em estudos anteriores [20, 21].

De acordo com os resultados dos experimentos de distribuição nos tecidos, o próprio BF poderia atravessar a BBB, possivelmente devido à sua alta lipossolubilidade, baixo peso molecular (386,52 g / mol) e estrutura química, que é semelhante à do colesterol, com a qual compartilha a mesma estrutura nuclear mãe. No entanto, a aplicação clínica do BF é limitada devido à sua alta solubilidade em lipídios e baixa solubilidade em água. A biodisponibilidade do BF é baixa se não for administrado de uma forma alternativa. Em um estudo anterior [6], mostramos que a formulação BF / PEG-LP poderia melhorar a solubilidade em água, estender a duração da circulação sanguínea, prolongar a meia-vida e expandir o escopo de aplicação do BF, incluindo para i.v. quimioterapia. No estudo atual, a administração de BF / PEG-LP resultou em um aumento da concentração de BF no cérebro, que foi mantida por um período mais longo (90 min). Além disso, houve uma diferença significativa na concentração de BF entre os grupos BF e BF / PEG-LP em 45 min (167,59 ± 54,52 vs. 71,52 ± 48,35 ng / g, P <0,01).

Em um estudo anterior, o BF demonstrou exercer um efeito semelhante ao da digital no coração, aumentando a freqüência cardíaca e a força de contração miocárdica em ratos [22]. Portanto, a cardiotoxicidade do BF em grandes doses pode ser causada por seu acúmulo no coração. O experimento de biodistribuição neste estudo mostrou que o acúmulo de BF no coração foi menor no grupo BF / PEG-LP do que no grupo BF (95,0 ± 18,5 vs . 134 ± 17,8 ng / g em 5 min, P <0,01; 15,32 ± 5,56 vs. 63,79 ± 28,21 ng / g a 15 min, P <0,01). Whether cardiac toxicity can be attenuated with a lower dose of BF requires further verification. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC₅₀ values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.

Conclusion

In the present study, we evaluated hemolysis induced by BF/PEG-LP and the cytotoxicity of blank liposomes to verify the safety thereof. Moreover, the effect of environmental pH on the release of BF from liposomes was investigated to assess the stability of BF/PEG-LP. BF encapsulation in a liposomal suspension might affect its antitumor activity in vitro and in vivo and general behavior, acute toxicity, and tissue distribution in vivo. Nonetheless, we believe that the development of the liposomal formulation described in this study has laid a foundation for the future clinical application of BF. Intensive investigation of the relevance of the ABC phenomenon to BF/PEG-LP is warranted in the future.

Disponibilidade de dados e materiais

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

Abreviações

ABC:

Accelerated blood clearance

AIE:

The aggregation-induced emission

BBB:

Blood-brain barrier

BF:

Bufalin

BF/PEG-LP:

Bufalin-loaded PEGylated liposomes

CBG:

Cinobufagin

CCK-8:

Cell counting kit-8

IC₅₀ :

Half-maximal inhibitory concentration

i.p.:

Intraperitoneally

IS:

Internal standard

i.v. :

Intravenously

LD₅₀ :

Median lethal concentration

PBS:

Phosphate-buffered saline

RBC:

Red blood cell

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