Entrega de Ácido Oleanólico por Micelas Poliméricas: Solubilidade Aumentada e Eficácia Anti-Rugas Comprovada

Resumo

O ácido oleanólico tem sido usado apenas como agente subsidiário em produtos cosméticos. O objetivo do estudo é mostrar o efeito do ácido oleanólico como ingrediente ativo para alívio de rugas em humanos e desenvolver uma formulação de micelas poliméricas que permita o ácido oleanólico pouco solúvel ser usado como ingrediente principal em produtos cosméticos para redução de rugas. A solubilidade do ácido oleanólico foi avaliada em solubilizantes, surfactantes e polímeros. Os tamanhos e formas das partículas de micelas poliméricas contendo ácido oleanólico foram avaliados por espectrofotômetro de espalhamento de luz eletroforético e microscopia eletrônica de varredura criogênica. Eficiência de encapsulamento e permeação cutânea foram medidas por HPLC. A estabilidade das micelas poliméricas armazenadas a 40 °C por 3 meses foi avaliada por observação visual, medição de tamanho de partícula e medição de teor de ácido oleanólico. Micelas poliméricas na forma final de ampola foram aplicadas ao redor dos olhos de 23 voluntárias do sexo feminino por 8 semanas. Cinco parâmetros de pele foram avaliados por profilometria óptica a cada 4 semanas por 8 semanas. Além disso, profissionais fizeram observações visuais da pele e um estudo de irritação cutânea humana foi conduzido. Micelas poliméricas de ácido oleanólico com tamanho de partícula inferior a 100 nm foram preparadas usando Capryol 90® e poloxâmero. A taxa de permeação cutânea do ácido oleanólico nas micelas poliméricas foi maior que a das outras soluções feitas de ácido oleanólico disperso em 2 surfactantes diferentes. Nenhuma mudança significativa no tamanho de partícula, cor ou teor de ácido oleanólico foi observada, e as micelas poliméricas armazenadas a 40 °C por 3 meses não sofreram separação de fase. Após 8 semanas de aplicação, irritação cutânea não se desenvolveu e todos os cinco parâmetros avaliados por profilometria óptica, bem como as pontuações de avaliação visual, foram significativamente melhorados. Este estudo mostrou que as micelas poliméricas de ácido oleanólico preparadas neste estudo foram estáveis e eficazes no alívio de rugas em humanos como ingrediente ativo principal. Baseado nestes achados, espera-se que as micelas poliméricas de ácido oleanólico possam ser amplamente usadas em aplicações cosméticas.

Introdução

O envelhecimento da pele inclui flacidez, afinamento e rugas. Pode ser acelerado por infecção, tabagismo, luz UV, trauma, desequilíbrio hormonal, estresse e/ou pró-oxidantes como hidrolases incluindo elastase ou colagenase. Espécies reativas de oxigênio ou radicais livres gerados pelas causas mencionadas acima danificam células vizinhas e resultam em redução da elasticidade da pele e afinamento. Especialmente, a luz UV é conhecida por desencadear a geração de espécies reativas de oxigênio, que danificam lipídios de membrana, proteínas celulares e DNA, e assim aceleram o desenvolvimento de rugas de expressão, sardas e melasma. O ácido oleanólico é um componente efetivo de origem vegetal natural extraído de várias espécies de plantas e usado como ingrediente médico e cosmético principal. Também é encontrado em frutas como maçãs ou peras. Como um tipo de terpeno pentacíclico hidroxilado, o ácido oleanólico foi primeiro isolado de folhas de oliveira (Olea europaea) e é amplamente encontrado em plantas incluindo swertia do Leste Asiático (Eugenia jambos) e genciana amarela (Gentiana lutea). Promove funções anti-envelhecimento via síntese não apenas de pró-colágeno, importante para síntese de colágeno, mas também de ceramidas e filagrina, e também inibindo a atividade de MMP-1, uma enzima que quebra proteínas como colágeno. Baseado nestes achados, pode-se assumir que o ácido oleanólico tem um duplo efeito anti-envelhecimento não apenas promovendo a produção de colágeno mas também prevenindo a degradação do colágeno. Como resultado, o ácido oleanólico é um ingrediente anti-envelhecimento muito promissor para produtos cosméticos. No entanto, o uso do ácido oleanólico em produtos cosméticos como ingrediente principal é limitado por sua pobre solubilidade aquosa; assim, apenas pequenas quantidades de ácido oleanólico como parte de uma formulação emulsionada têm sido usadas como ingrediente subsidiário em produtos cosméticos. Suas propriedades físico-químicas relacionadas à absorção cutânea incluem seu ponto de fusão, peso molecular, coeficiente de partição e hidrofilicidade. Seu ponto de fusão é superior a 300 °C, indicando que é um material altamente cristalino. Materiais altamente cristalinos requerem maior energia para dissolução, mostram pobre biodisponibilidade devido à sua solubilidade limitada e portanto são mal absorvidos. Além disso, compostos altamente hidrofílicos ou lipofílicos, ou compostos de alto peso molecular são conhecidos por não permear facilmente a pele. O método mais frequentemente usado para melhorar a permeação cutânea de tais moléculas é a síntese de precursores ou o uso de carreadores coloidais de fármacos. A este respeito, lipossomos, emulsões e micelas poliméricas têm sido ativamente estudados.

Micelas poliméricas são agregados nano-escalados auto-montados formando estruturas núcleo-casca em solução aquosa. Micelas poliméricas são frequentemente feitas de copolímeros di-bloco ou tri-bloco que podem formar um núcleo interno hidrofóbico e uma casca externa hidrofílica. Micelas poliméricas são consideradas mais fisicamente estáveis que micelas de surfactante pois as propriedades das micelas poliméricas variam dependendo do tipo e proporção de monômeros poliméricos em um copolímero de bloco e têm concentrações micelares críticas relativamente baixas.

Neste estudo, preparamos micelas poliméricas de ácido oleanólico e avaliamos seu tamanho e forma de partícula, e a resultante eficiência de encapsulamento e taxa de permeação cutânea do ácido oleanólico. A estabilidade física do ácido oleanólico nesta forma também foi avaliada por 3 meses. O efeito anti-rugas humano do ácido oleanólico em formulação real de produto cosmético também foi investigado.

Materiais e Métodos

Materiais

Ácido oleanólico, Tween 80, Tween 20 e Tween 60 foram adquiridos da TCI (Tóquio, Japão). PEG 400, Pluronic F127 e Pluronic F68 foram obtidos da BASF (Ludwigshafen, Alemanha). Propilenoglicol, PEG 300 e PEG 200 foram obtidos da JUNSEI (Tóquio, Japão). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 e Capryol™ PGMC foram comprados da Gattefossé (Lyon, França). EDTA dissódico (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Coreia), alantoína (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EUA), dipropilenoglicol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Coreia), propanodiol (DuPont Tate & Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, EUA), carbômero (The Lubrizol Corporation, Ohio, EUA), PEG/PPG/polibutilenoglicol-8/5/3 glicerina (NOF Corporation, Tóquio, Japão), hialuronato de sódio (TCI, Tóquio, Japão), beta-glucana (SK Bioland, Cheonan, Coreia), fenoxietanol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Coreia), caprililglicol (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Coreia) e etilhexilglicerina (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Coreia) foram usados para preparar o produto cosmético contendo ácido oleanólico. Acetonitrila grau HPLC foi obtida da Burdick & Jackson (Muskegon, MI, EUA). Água triplamente destilada foi usada, e outros solventes e reagentes foram grau EP e GR. Camundongos fêmeas sem pelo Crlori:SKH1-hr foram comprados da OrientBio (Seongnam, Coreia).

Análise por HPLC

O ácido oleanólico foi analisado usando HPLC Shimadzu série LC-30 (Shimadzu Corporation, Quioto, Japão). Uma coluna analítica Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 μm (Teknokroma, Barcelona, Espanha) foi usada a temperatura ambiente. A fase móvel consistiu de acetonitrila e água (85:15, v/v), a vazão foi 1 mL/min, e o volume de injeção 10 μL. O ácido oleanólico foi analisado em UV λ = 210 nm. Todas as medições foram realizadas a temperatura ambiente.

Estudo de Solubilidade e Otimização de Formulação

Uma quantidade medida de ácido oleanólico foi adicionada a um solubilizante, agitada a 60 °C por 48 h, e sonicada por 5 min usando um limpador ultrassônico. A suspensão foi centrifugada a 2000 rpm usando uma centrífuga Universal 320R (Hettich, Tuttlingen, Alemanha), e o sobrenadante foi então coletado. Então o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de membrana PVDF de 0,45 μm (Whatman, Kent, Reino Unido). A solubilidade do ácido oleanólico no solubilizante correspondente foi estimada subtraindo o peso dos sólidos remanescentes da soma dos pesos iniciais do ácido oleanólico e do solubilizante (Tabela 1).

O estudo de otimização de formulação foi conduzido usando poloxâmero 188, poloxâmero 407, Tween 60 e Tween 80. Várias proporções de polímeros anfifílicos e surfactantes foram testadas como resumido na Tabela 2. Cada um do ácido oleanólico e Capryol® 90 foi pesado, aquecido e agitado a mais de 60 °C até que soluções claras fossem observadas. Os polímeros/surfactantes mostrados na Tabela 2 foram então adicionados à solução clara e agitados a mais de 60 °C até que soluções claras fossem observadas. As soluções foram então dispersas em água destilada (Fig. 1). A solução resultante foi deixada por aproximadamente 48 h, e uma inspeção visual foi então feita para selecionar a formulação ótima. Os resultados das inspeções visuais de cada formulação na Tabela 2, incluindo observações de precipitação, separação de fase, transparência e gelificação, são resumidos na Tabela 3.

Preparação das Micelas Poliméricas de Ácido Oleanólico

Micelas poliméricas de ácido oleanólico (PMO) foram preparadas usando as formulações G e H na Tabela 2 usando o método mostrado na Fig. 1. PMO-G e PMO-H foram usados para experimentos subsequentes e PMO-H nos produtos cosméticos para os ensaios clínicos.

Teste de Coloração

A micelização polimérica quando a formulação G ou H era dispersa em água foi confirmada por observação visual, ou seja, transparência. A formação de PMO (PMO-G ou PMO-H) também foi confirmada por teste de coloração. Azul de metileno foi adicionado às misturas de água e Capryol® 90, água, Capryol® 90, PMO-G e PMO-H e a cor das soluções foi observada visualmente e fotografada.

Medição de Tamanho de Partícula

A técnica ELS (espalhamento de luz eletroforético) mede a flutuação de intensidade de espalhamento das partículas como função do tempo quando as partículas exibem tanto movimento browniano aleatório quanto movimento eletroforético orientado em um campo elétrico bem definido. A mobilidade eletroforética da partícula é medida pela técnica ELS e permitiu que o tamanho de partícula de ambos PMO-G e PMO-H fosse avaliado usando um espectrofotômetro de espalhamento de luz eletroforético (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Japão).

Análise de Microscopia Eletrônica de Varredura Criogênica (Cryo-SEM)

Microscopia eletrônica de varredura criogênica ou microscopia eletrônica de varredura criogênica (cryo-SEM) é uma técnica poderosa para visualizar o estado da microestrutura ou nanoestrutura de suspensões ou dispersões de polímeros coloidais após terem sido imobilizadas por congelamento rápido e fraturadas para imagem. A fratura é feita e examinada a −196 °C, o ponto de ebulição normal do nitrogênio líquido e muito abaixo da temperatura de transição vítrea de partículas tanto em massa quanto totalmente coalescidas. Imagens de Cryo-SEM revelam uma gama de respostas de partículas a fraturas que se propagam através do gelo. Microscopia eletrônica de varredura criogênica (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Sample Preparation System) foi usada para observar a forma dos PMOs.

Eficiência de Encapsulamento

A eficiência de encapsulamento das micelas poliméricas de ácido oleanólico foi avaliada. PMO foi centrifugado a 2000 rpm por 15 min, e o sobrenadante foi coletado e analisado por HPLC. A eficiência de encapsulamento foi calculada como a quantidade de ácido oleanólico nas micelas poliméricas dividida pela quantidade de ácido oleanólico inicialmente adicionada (mg) durante a preparação do PMO.

Estabilidade do PMO-H

A estabilidade física do PMO-H foi avaliada armazenando-o a 40 °C por 3 meses. Mudanças de cor, separação de fase, presença de precipitados e mudanças de turbidez foram avaliadas visualmente. Amostras de PMO-H coletadas em intervalos regulares foram analisadas por HPLC para determinar as quantidades de ácido oleanólico remanescentes e por um ELS-Z para determinar o tamanho de partícula do PMO-H. Os resultados são apresentados na Fig. 9.

Teste de Permeação Cutânea In Vitro

Um estudo de permeação cutânea in vitro foi realizado usando uma célula de difusão de Franz para investigar a melhoria na permeação cutânea do ácido oleanólico. O teste foi realizado em PMO-G, PMO-H, a mistura de ácido oleanólico e Tween 80 dispersa em água destilada, e a mistura de ácido oleanólico e propilenoglicol dispersa em água destilada. A pele de uma camundonga fêmea sem pelo de 6 semanas foi cortada em pedaços do tamanho requerido. Células de Franz verticais foram usadas, e a pele foi fixada entre as duas câmaras com seu estrato córneo voltado para cima. 330 μl da formulação selecionada foi aplicado na pele e as células de Franz foram cobertas com parafilm. O receptor foi preenchido com solução PBS (pH 7,4) e etanol na proporção 9:1 (v/v). A solução do receptor foi reposta com solução PBS fresca a cada tempo de amostragem. Amostras foram retiradas a 2, 4, 6, 8, 10, 20 e 24 h e analisadas por HPLC. Após 24 h, o excesso de formulação remanescente na pele foi removido com Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Austrália). A pele usada no estudo de permeação foi limpa com solução PBS e o ácido oleanólico remanescente na pele foi medido por HPLC. Todos os experimentos de permeação foram realizados em triplicata.

Estatísticas do Estudo

Os experimentos foram realizados em três repetições independentes, e os resultados deste estudo foram relatados como média ± DP. A análise estatística foi verificada por teste t independente, e o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Preparação de Ampola com PMO-H

Para o teste clínico, PMO-H foi usado como produto de teste. PMO-H, água purificada, EDTA dissódico, alantoína, dipropilenoglicol, propanodiol, carbômero e PEG/PPG/polibutilenoglicol-8/5/3 glicerina foram adicionados e agitados por 10-15 min usando um agitador magnético, e então hidróxido de potássio foi adicionado e a mistura agitada por mais 5-10 min. Uma vez que os ingredientes foram homogeneamente misturados, hialuronato de sódio e beta-glucana foram adicionados e agitados por mais 2-5 min, e então fenoxietanol, propanodiol, caprililglicol e etilhexilglicerina foram adicionados e agitados por 2-5 min. A fórmula final foi adicionada a uma ampola como produto de teste. As bolhas de ar da ampola foram removidas usando um forno de secagem a vácuo antes do uso do teste. Um controle foi preparado seguindo o mesmo método para o produto de teste exceto que o ácido oleanólico foi excluído.

Testes de Aplicação Humana

Estudo de Irritação Cutânea Humana

Um teste de patch do produto cosmético, que continha PMO-H em uma ampola, foi realizado em 25 voluntários do sexo masculino e feminino com idade de 22 a 56 anos que concordaram em participar de um teste de irritação cutânea humana. Cada substância de teste foi gotejada na parte superior do braço e fixada com um patch. O patch foi anexado por 24 h e o grau de estimulação foi observado por 2 profissionais 30 min, 24 h e 48 h após a remoção do patch de acordo com os critérios do Grupo Internacional de Pesquisa em Dermatite de Contato (ICDRG).

Ensaio Clínico para Melhora de Rugas

Micelas poliméricas contendo ácido oleanólico em uma ampola como forma de produto final foram aplicadas ao redor dos olhos de 23 voluntárias do sexo feminino com idade de 30 a 65 anos que concordaram em participar do teste de melhora de rugas. Os voluntários atenderam aos critérios de inclusão e nenhum dos critérios de exclusão e concordaram em participar do teste de aplicação humana. O método duplo-cego foi seguido por ambos pesquisadores e voluntários. O teste foi conduzido por 8 semanas, e a avaliação foi realizada a cada 4 semanas. O método duplo-cego e alocação aleatória foram usados. O produto de teste e o controle foram aplicados separadamente de forma aleatória no lado esquerdo ou direito da face do mesmo voluntário. Cinco parâmetros foram avaliados por profilometria óptica usando Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Colônia, Alemanha) a cada 4 semanas por 8 semanas—rugosidade média (R3) foi o endpoint primário, e os quatro parâmetros de rugosidade da pele (R1), rugosidade máxima (R2), profundidade de suavidade (R4) e rugosidade média aritmética (R5) foram os endpoints secundários. Aumentos ou diminuições dos cinco parâmetros na mesma área do voluntário foram medidos ao longo do tempo, e os valores médios de aumento ou diminuição dos cinco parâmetros foram calculados e comparados entre tratamentos de controle e produto de teste. Além disso, uma observação visual da pele foi feita por profissionais. Fotografias de rugas nos olhos foram tiradas usando Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Coreia). Os critérios usados para determinar as pontuações de avaliação visual são mostrados na Fig. S1, e os resultados visuais são apresentados na Fig. 13. Os parâmetros foram comparados e analisados usando um teste t de amostras pareadas com confiabilidade de 95%.

Resultados e Discussão

Determinação de Solubilizante, Surfactante e Polímero

A solubilidade do ácido oleanólico em solubilizantes biocompatíveis, especificamente surfactantes e polímeros, é mostrada na Tabela 1. O ácido oleanólico tende a ser solúvel em óleos hidrofóbicos com baixo balanço hidrofílico-lipofílico (HLB). Capryol® 90 tem um valor HLB ligeiramente maior comparado a óleos gerais. No entanto, o ácido oleanólico mostra solubilidade relativamente alta em Capryol® 90. Além disso, Capryol® 90 pode ser facilmente estabilizado como núcleo interno de micelas. Após selecionar Capryol® 90, vários tipos de surfactantes ou poloxâmeros foram testados para a parte da casca das micelas de ácido oleanólico. As composições de micelas de ácido oleanólico mostradas na Tabela 2 são as que foram transparentes imediatamente após serem diluídas com água destilada. No entanto, algumas composições foram instáveis e sofreram precipitação, separação de fase ou gelificação dentro de 24 h. Imagens representativas de estados de precipitação, separação de fase, líquido transparente e gel são mostradas na Fig. 2. O estado final de cada fórmula é resumido na Tabela 3. Composições G e H permaneceram transparentes mesmo após 24 h. Embora a composição I permanecesse clara, era um gel em vez de líquido. Composições A a D tornaram-se opacas com precipitação após 24 h. Dados estes resultados, composições G e H foram selecionadas para desenvolvimento posterior.

Características das Micelas Poliméricas de Ácido Oleanólico

As estruturas das micelas poliméricas de ácido oleanólico foram investigadas por teste de coloração. A Figura 3 mostra as imagens da mistura de Capryol® 90 e água destilada, Capryol® 90, água destilada, e as micelas poliméricas da composição G (PMO-G) e da composição H (PMO-H), após adição de azul de metileno à solução. Separação de fase clara ocorreu para a mistura de Capryol® 90 e água destilada. Precipitação de azul de metileno foi observada no caso de Capryol® 90. Água destilada tornou-se azul escura após adição de azul de metileno. PMO-G e PMO-H também tornaram-se azuis indicando que as micelas poliméricas consistiam de um núcleo interno de fase oleosa e casca externa de fase aquosa. Em outras palavras, um polímero anfifílico, poloxâmero 407 nas composições G e H, serve como casca externa e ajuda a formar com sucesso micelas poliméricas de ácido oleanólico encapsulando o núcleo interno de Capryol® 90 contendo ácido oleanólico.

Tamanho de partícula, distribuição de tamanho e forma podem ser bons indicadores para prever a estabilidade física de formulações de micelas. O tamanho médio de partícula de PMO-G foi 80,4 nm, e o de PMO-H foi 57 nm (Fig. 4). Os histogramas de PMO-A, G e H são mostrados na Fig. 5 para comparar as distribuições de tamanho afetadas pelo estado de fase. Como mostrado na Tabela 3, PMO-A é opaco devido a precipitação, e PMO-G e H são transparentes. O tamanho de partícula de PMO-A é mais de 100 nm, e PMO-A mostra uma distribuição de tamanho mais ampla que PMO-G e H (Fig. 5). PMO-H mostra uma distribuição de tamanho de partícula mais estreita que PMO-G e exibe fluidez adequada para produtos cosméticos.

A eficiência de encapsulamento para tanto PMO-G quanto PMO-H foi 99 a 100%, indicando que quase 100% do ácido oleanólico foi encapsulado no núcleo interno do PMO (Fig. 6).

A forma de PMO-G e PMO-H foi investigada por microscopia eletrônica de varredura criogênica (Cryo-SEM). Cryo-SEM mostrou que tanto PMO-G quanto PMO-H eram micelas poliméricas de forma esférica. No entanto, as micelas poliméricas PMO-H eram mais consistentes em tamanho e forma que as micelas poliméricas PMO-G (Fig. 7).

Estudo de Permeação Cutânea In Vitro do PMO

A quantidade total de ácido oleanólico remanescente na pele, e a quantidade total de ácido oleanólico permeado através da pele como função do tempo foram medidas usando a pele de uma camundonga fêmea sem pelo de 6 semanas. Quatro formulações diferentes, PMO-G, PMO-H, a mistura de ácido oleanólico e Tween 80 dispersa em água destilada (OTw), e a mistura de ácido oleanólico e propilenoglicol dispersa em água destilada (OPG) foram comparadas em termos de eficiência de permeação cutânea do ácido oleanólico. As quantidades totais de ácido oleanólico permeado através da pele após 24 h foram 29,49 ± 4,00% para PMO-H, 21,39 ± 5,91% para PMO-G, 13,66 ± 0,81% para OTw, e 5,90 ± 2,47% para OPG. Como mostrado na Fig. 7, a primeira detecção de ácido oleanólico no caso de tanto PMO-G quanto PMO-H foi possível a 8 h, enquanto a primeira detecção de ácido oleanólico em OTw foi possível a 10 h, e OPG a 20 h. As proporções de ácido oleanólico deixadas na pele foram 56,22 ± 13,50% para PMO-H, 36,74 ± 0,72% para PMO-G, 27,44 ± 7,02% para OTw, e 26,28 ± 5,42% para OPG. PMO-H mostrou a maior quantidade tanto de ácido oleanólico permeado através da pele quanto de ácido oleanólico remanescente na pele (Fig. 8). Estes resultados indicam que PMOs podem permear mais rápido e mais que formulações que não formam micelas.

Estabilidade de Micelas Poliméricas Líquidas de Ácido Oleanólico

Baseado nos estudos de caracterização e permeação in vitro, PMO-H foi finalmente selecionado para preparação de ampola. Antes da preparação da ampola, a estabilidade de ONM-H foi avaliada. Para o estudo de estabilidade, PMO-H foi armazenado em frascos sob condições de estudo de estabilidade acelerada a 40 °C/75% UR por 3 meses. Precipitação, separação de fase, mudanças de cor e transparência foram então avaliadas visualmente. A proporção de ácido oleanólico foi então medida usando HPLC, e mudanças no tamanho de partícula também foram verificadas. A estabilidade foi verificada ao longo do tempo. PMO-H permaneceu transparente sem precipitação ou separação de fase, e sua cor não mudou por 3 meses sob condições de estabilidade acelerada. A proporção de ácido oleanólico medida por HPLC e as mudanças no tamanho de partícula ao longo do tempo são mostradas na Fig. 9. A proporção de ácido oleanólico permaneceu acima de 98%, e o tamanho de partícula de 49,6 ± 5 nm permaneceu quase constante durante o período de 3 meses do estudo de estabilidade. Estes resultados mostram que PMO-H é fisicamente e quimicamente estável por 3 meses sob condições de estabilidade acelerada.

Teste Clínico

Teste de Irritação Humana

Antes do ensaio clínico, um teste de irritação humana foi conduzido em 25 voluntários saudáveis do sexo feminino e masculino com idade de 22-56 anos. O produto de teste foi aplicado no braço superior dos voluntários por 24 h, e o índice de irritação cutânea foi medido 30 min, 24 h e 48 h após a remoção do patch. Irritação não foi observada com a fórmula cosmética de ampola contendo PMO-H a 1 h ou 48 h após a remoção do patch.

Ensaio Clínico

O ensaio clínico foi conduzido em 23 voluntárias do sexo feminino, com idade de 30-65 anos com rugas ao redor dos olhos; excluindo os 3 desistentes, 20 voluntárias completaram o ensaio aplicando separadamente tanto o produto de teste, a ampola PMO-H, quanto o controle no lado esquerdo ou direito de suas faces por 8 semanas. Mudanças na pele foram avaliadas de acordo com cinco parâmetros—rugosidade média (R3) como endpoint primário, e quatro parâmetros adicionais como endpoints secundários, nomeadamente rugosidade da pele (R1), rugosidade máxima (R2), profundidade de suavidade (R4) e rugosidade média aritmética (R5). A pontuação de avaliação visual adicionou um outro endpoint secundário. Resultados são resumidos na Tabela 4.

O endpoint primário R3 diminuiu 0,673% após 4 semanas de uso do produto de teste e estatisticamente significativamente 7,835% após 8 semanas de uso (p = 0,006). Com a aplicação do controle, R3 aumentou 5,127% após 4 semanas de uso e estatisticamente significativamente 9,971% após 8 semanas de uso (p = 0,010). A diferença no valor de R3 entre as áreas tratadas pelo produto de teste e aquelas tratadas pelo controle foi estatisticamente significativa após 8 semanas de uso (p = 0,000) mas não estatisticamente significativa após 4 semanas de uso, talvez devido à variação inter-individual (Fig. 10).

A análise do endpoint secundário R1 mostrou que o valor diminuiu 4,629% após 4 semanas de uso do produto de teste e estatisticamente significativamente 9,973% após 8 semanas de uso (p = 0,017). Com aplicação do controle, R1 aumentou 8,037% após 4 semanas de uso e 4,799% após 8 semanas de uso. A diferença nos valores de R1 entre as áreas usando o produto de teste e o controle não foi estatisticamente significativa após 4 semanas de uso mas foi após 8 semanas de uso (p = 0,024). O endpoint secundário R2 diminuiu 1,048% após 4 semanas de uso do produto de teste e 5,803% após 8 semanas. Com aplicação do controle, aumentou 7,261% após 4 semanas e 9,536% após 8 semanas. A diferença no valor de R2 entre as áreas tratadas pelo produto de teste e aquelas tratadas pelo controle foi estatisticamente significativa após 8 semanas de uso (p = 0,016) mas não após 4 semanas de uso. O endpoint secundário R4 diminuiu significativamente 8,594% (p = 0,039) após 4 semanas de uso do produto de teste e 9,747% após 8 semanas de uso. Com o controle, R4 aumentou 10,764% após 4 semanas de uso e 3,491% após 8 semanas de uso. Curiosamente, a diferença no valor de R4 entre as áreas usando o produto de teste e o controle foi estatisticamente significativa após 4 semanas de uso (p = 0,008) mas não após 8 semanas. O endpoint secundário R5 diminuiu 6,333% após 4 semanas de uso do produto de teste e 8,556% após 8 semanas de uso. A diferença no valor de R5 entre as áreas de uso do produto de teste e o controle não foi estatisticamente significativa nem após 4 semanas nem após 8 semanas de uso.

A análise do outro endpoint secundário, a avaliação visual de rugas, mostrou que a pontuação de avaliação visual diminuiu 2,917% após 4 semanas de uso do produto de teste e estatisticamente significativamente diminuiu 8,333% após 8 semanas de uso (p = 0,034). Com aplicação do controle, a pontuação de avaliação visual aumentou 1,667% após 4 semanas e 4,167% após 8 semanas. A diferença da pontuação de avaliação visual entre as áreas tratadas pelo produto de teste e pelo controle foi estatisticamente significativa após 8 semanas de uso (p = 0,046) mas não após 4.

Em resumo, a análise da área enrugada ao redor dos olhos mostrou que a diferença no valor do endpoint primário R3 entre as áreas tratadas pelo produto de teste e pelo controle foi estatisticamente significativa após 8 semanas de uso. Em termos dos endpoints secundários, todos os valores diminuíram após uso do produto de teste e aumentaram após uso do controle. A diferença nos valores de R4 entre as áreas tratadas pelo produto de teste e aquelas tratadas pelo controle foi estatisticamente significativa após 4 semanas de uso, mas a diferença dos valores de R1 e R2 foram estatisticamente significativas apenas após 8 semanas de uso (Fig. 11). A pontuação de avaliação visual por profissionais mostrou que todas as pontuações médias de avaliação visual para rugas diminuíram após 4 semanas e 8 semanas de tratamento com produto de teste comparado ao controle (Tabela 5). A diferença na pontuação de avaliação visual entre as áreas tratadas pelo produto de teste e pelo controle foi estatisticamente significativa após 8 semanas de uso (Fig. 12). No geral, de acordo com todos os endpoints, a fórmula cosmética contendo PMO-H como ingrediente principal foi encontrada para ajudar a melhorar rugas após 8 semanas de uso (Fig. 13).

Conclusões

Surfactantes são excipientes comumente usados em produtos cosméticos para melhorar a solubilidade de materiais pouco solúveis. Uma ressalva seria a quantidade incluída no produto. Surfactantes devem ser adicionados em quantidade suficiente para dissolver materiais pouco solúveis sem precipitação. Apenas uma quantidade mínima deve ser adicionada por razões de segurança. Formulação de micelas poderia ser a solução para este problema. Micelas poliméricas de ácido oleanólico desenvolvidas neste estudo melhoram a solubilidade do ácido oleanólico com uma quantidade mínima de surfactantes e aumentam a permeação do ácido oleanólico através da pele. Micelas poliméricas estáveis de ácido oleanólico foram desenvolvidas usando Capryol 90 e poloxâmero. As micelas poliméricas de ácido oleanólico desenvolvidas neste estudo foram estáveis, ou seja, não mostraram nenhuma precipitação, separação de fase ou degradação a 40 °C após 3 meses. O ensaio clínico mostrou que, como ingrediente ativo principal, o ácido oleanólico na formulação de micelas poliméricas é eficaz para aliviar rugas humanas. Baseado nestes achados, pode-se concluir que o ácido oleanólico, que é pouco solúvel em água e portanto inutilizável em forma nativa como ingrediente principal para aliviar rugas cutâneas, pode ser formulado em micelas poliméricas aplicáveis. Além disso, espera-se que as micelas poliméricas de ácido oleanólico desenvolvidas neste estudo se provem muito úteis para aliviar rugas humanas e se provem amplamente aplicáveis a aplicações cosméticas.