Investigação sobre as características físico-químicas de um sistema baseado em nanolipossomas para administração dupla de medicamentos

Resumo

Os efeitos sinérgicos de múltiplas drogas com diferentes modos de ação são utilizados para quimioterapia combinatória de cânceres intratáveis. A tradução dos efeitos sinérgicos in vitro na clínica pode ser realizada usando um sistema de entrega eficiente dos medicamentos. Apesar de alguns estudos em lipossomas de tamanho nanométrico contendo erlotinib (ERL) e doxorrubicina (DOX) em uma única vesícula de lipossoma, métodos de preparação confiáveis ​​e reprodutíveis, bem como características físico-químicas de um nanolipossoma não PEGuilado co-encapsulado com ERL e DOX não foram já foi elucidado. Neste estudo, nanolipossomas encapsulados em ERL foram preparados usando o método de hidratação de filme lipídico. Por ultra-som usando um sonicador de sonda, o diâmetro do lipossoma foi reduzido para menos de 200 nm. DOX foi carregado nos nanolipossomos encapsulados em ERL usando sulfato de amônio (AS) -gradient ou método de gradiente de pH. Os efeitos das condições de carregamento de DOX na eficiência de encapsulação (EE) do DOX foram investigados para determinar um método de carregamento de droga eficiente. No EE de DOX, o método AS-gradiente foi mais eficaz do que o pH gradiente. Os nanolipossomos encapsulados por fármaco duplo tinham mais de 90% EE de DOX e 30% EE de ERL, respectivamente. A microscopia eletrônica de transmissão e as análises de difração de elétrons de área selecionada dos nanolipossomas encapsulados com droga dupla verificaram os cristais de sulfato de DOX altamente orientados dentro do lipossoma, bem como os pequenos cristais menos orientados de ERL na região mais externa do nanolipossoma. Os nanolipossomos foram estáveis ​​em diferentes temperaturas sem aumento do diâmetro dos nanolipossomos. Os nanolipossomos encapsulados com drogas duplas mostraram uma liberação de ERL e DOX com diferencial de tempo, implicando em liberações sequenciais adequadas para seu sinergismo. Os métodos de preparação e as características físico-químicas do sistema de liberação dupla de drogas contribuem para o desenvolvimento do processo ideal e de sistemas mais avançados para pesquisas translacionais.

Histórico

Os cânceres intratáveis, como os cânceres de mama triplo-negativos, têm limites para o tratamento com terapias padrão devido à resposta ao dano ao DNA altamente interconectada com várias redes de sinalização [1,2,3]. Estratégias terapêuticas que aumentam a quimiossensibilidade inicial de tais tumores recalcitrantes têm sido estudadas para desafiar os limites [4, 5]. Um estudo recente suprimindo vias de sinalização oncogênica durante o uso de um agente de dano ao DNA é uma das estratégias terapêuticas combinatórias [6,7,8]. O estudo sugeriu que o pré-tratamento de um inibidor do fator de crescimento para células cancerígenas resistentes sinergia sua resposta apoptótica a uma droga genotóxica [9, 10]. Há uma necessidade clínica altamente importante de estratégias terapêuticas para atingir várias vias de sobrevivência específicas de células cancerosas para aumentar a extensão da morte de células tumorais e a redução potencial da exposição total à droga durante o tratamento [11, 12]. Enquanto isso, a fim de traduzir os efeitos sinérgicos in vitro de dois tipos de drogas na clínica, um sistema de entrega que pode entregar os dois medicamentos e liberá-los de maneira diferencial no tempo é essencial devido à diferença entre as propriedades farmacocinéticas (PK) do drogas e a dificuldade em atingir as mesmas células cancerosas na sequência temporal adequada [13,14,15,16].

Um sistema de entrega nanoliposomal é um dos sistemas de entrega de fármaco duplo que pode ser aplicado à terapia de combinação. Os componentes principais dos lipossomas são, em geral, fosfolípidos semelhantes aos das membranas celulares. Os fosfolipídios formam uma esfera concêntrica de duas camadas com um compartimento interno e membranas de duas camadas [17]. Os nanolipossomas podem permitir que os fármacos com diferentes propriedades físico-químicas sejam carregados no compartimento interno e na membrana de bicamada dos lipossomas e, em seguida, administrados na lesão. Assim, o efeito sinérgico in vivo dos dois medicamentos administrados usando o sistema nanolipossômico pode ser alcançado por meio da co-localização aprimorada dos medicamentos para as células cancerosas, não apenas pela reconciliação das propriedades PK de cada medicamento, mas também pela chamada permeabilidade e retenção aumentadas ( EPR) efeito do tecido tumoral. Além da encapsulação de fármacos no compartimento interno, o nanolipossoma pode solubilizar fármacos hidrofóbicos, aumentar sua estabilidade, modular suas propriedades de circulação sanguínea e, assim, induzir seu acúmulo nos tecidos tumorais [18].

Apesar dos estudos recentes sobre sistemas de entrega de quimioterapia de combinação à base de nanolipossoma, os processos de preparação dos sistemas precisam ser otimizados para fabricação confiável e reprodutível, e as características físico-químicas deles devem ser elucidadas para o desenvolvimento de sistemas mais avançados [13, 19]. Em nosso estudo, um sistema de entrega nanoliposomal co-encapsulado com elrotinibe (ERL; ERL base livre, log _P =3.3) e doxorrubicina (DOX; DOX HCl, log _P =1,27) em uma única vesícula de lipossoma foi preparado como um sistema de nanolipossoma modelo de acordo com um relatório anterior, exceto para uma formulação de lipossoma chamada não PEGuilada [13], e as características físico-químicas do sistema foram estudadas. Estudos de liberação de drogas in vitro foram realizados para investigar uma liberação diferencial de tempo das drogas. Entre vários métodos, como extrusão, sonicação e homogeneização de alta pressão [20,21,22], a ultra-sonicação com sonicador foi utilizada para reduzir o diâmetro do lipossoma devido à sua processabilidade mais eficiente. Um estudo comparativo sobre os efeitos das tecnologias de carregamento de drogas, como o método de gradiente de pH ou sulfato de amônio na eficiência de encapsulação (EE) da droga, foi realizado para otimizar o encapsulamento da droga. Além disso, o processo mais eficaz para o encapsulamento do medicamento foi determinado através da investigação dos efeitos das condições do processo na EE do medicamento. As condições de preparação para o sistema nanolipossômico de liberação de fármaco duplo encapsulado com ERL e DOX e liberação dos fármacos em uma sequência adequada foram otimizadas. Os métodos de preparação otimizados e as características do sistema de entrega dupla de drogas sugerem uma plataforma de processos de preparação confiáveis ​​e reproduzíveis e um sistema de entrega mais avançado para estudos translacionais.

Métodos

Materiais

1,2-distearoil- sn -glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfo- (1′- rac -glicerol) (sal de sódio) (POPG) foram fornecidos pela Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Al, EUA). O colesterol era da Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, EUA). O cloridrato de doxorrubicina (DOX) e a base livre de erlotinibe (ERL) foram adquiridos na Boryung Co., Ltd. (Seul, Coréia) e na Shanghai Send Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China), respectivamente. Sulfato de amônio (AS) e ácido cítrico (CA) anidro foram fornecidos por Daejung Chemicals &Metals Co., Ltd. (Siheung-si, Coréia). Todos os outros reagentes eram do tipo reagente e fornecidos pela Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, EUA).

Preparação de nanolipossomas encapsulados com fármaco duplo

Os processos gerais para a preparação dos nanolipossomas encapsulados com ERL e DOX são descritos na Fig. 1. Em resumo, os lipossomas encapsulados com ERL foram preparados usando o denominado método de hidratação por película lipídica fina [23]. ERL foi adicionado à mistura lipídica formando o filme lipídico fino de modo a encapsular o fármaco na membrana de bicamada lipídica dos lipossomas. O diâmetro do lipossoma foi reduzido por ultrassonicação com sonicador (Vibra Cell; Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, EUA). DOX foi encapsulado no compartimento aquoso interno de nanolipossomas encapsulados em ERL usando um gradiente de concentração de íons transmembrana dos nanolipossomas. Os métodos experimentais e analíticos detalhados do processo são sugeridos nas seções a seguir.

Processos para preparação e caracterização de nanolipossomos encapsulados por fármaco duplo

Lipossomas encapsulados em ERL

Uma mistura de lipídios composta por DSPC, colesterol e POPG na proporção de 27:20:3 ( w / w / w ) foi misturado com base livre ERL a uma proporção em peso do fármaco para o lípido total, 3:50. Essas misturas foram dissolvidas em 9 mL de um solvente misto de clorofórmio:metanol =2:1 ( v / v ) A solução lipídica foi colocada em um frasco de fundo redondo e, para formar uma membrana lipídica, o solvente foi removido usando um evaporador rotativo (Rotavapor R-210; BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Suíça) sob vácuo a 40 ° C. A membrana foi seca em vácuo durante a noite para remover todo o solvente residual. Nestes processos, as moléculas ERL são inseridas na membrana lipídica através de atracções hidrofóbicas e depois encapsuladas espontaneamente na membrana da bicamada lipídica dos lipossomas, que são formados pelo seguinte processo de hidratação.

A fim de hidratar a membrana lipídica contendo ERL, 8 mL de 250-400 mM AS ou tampão de ácido cítrico 300 mM (pH 3,9) foram adicionados à membrana formada na superfície interna do frasco de fundo redondo. Após incubação da membrana a 65 ° C por 30 min por rotação do frasco, a suspensão de lipossomas foi sonicada usando um sonicador de banho (Branson 3510E-DTH; Branson, Danbury, CT, EUA). Para reduzir o diâmetro do lipossoma, a suspensão de lipossoma foi sonicada usando o sonicador em condições como um pulso de 5 s ligado e 2 s desligado, uma amplitude de 20% e uma energia de 36 J por pulso em um banho de água gelada , ou um banho de água sob agitação magnética. Para remover AS que foi descarregado nos nanolipossomos, a diálise dos nanolipossomos foi realizada durante a noite em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) com uma membrana de celulose de tubo de diálise (corte de peso molecular de 14.000 (MWCO); Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EUA). No caso da suspensão de nanolipossoma preparada usando o tampão de ácido cítrico, o pH da solução foi ajustado para cerca de 6,5 usando tampão de bicarbonato de sódio 300 mM para fazer um gradiente entre o interior e o exterior dos nanolipossomas.

Carregamento de DOX em nanolipossomas encapsulados em ERL

Para encapsular DOX em nanolipossomas encapsulados em ERL, o cloridrato de DOX foi primeiro dissolvido em solução aquosa de NaCl a 0,9% a 65 ° C. Em geral, 2 mL de 1,5 mg / mL de solução DOX foram adicionados a 8 mL da suspensão de nanolipossoma encapsulada em AS e ERL ou encapsulada em ácido cítrico e ERL. Os processos de carregamento de drogas da suspensão de nanolipossoma adicionado de DOX foram compostos por incubação, sonicação usando o sonicador de banho, equilíbrio à temperatura ambiente (RT) e diálise contra PBS (pH 7,4) usando a membrana de celulose do tubo de diálise para remover DOX não encapsulado do suspensão de nanolipossoma. Os efeitos das condições de carregamento de DOX na EE de DOX foram investigados usando quatro grupos experimentais. O Grupo 1 foi a mistura da solução DOX e os lipossomas, que foi tratada na sequência de uma incubação a 65 ° C durante 30 min, uma sonicação a 65 ° C durante 5 min e uma diálise durante a noite. O Grupo 2 foi incubado a 65 ° C por 30 min, sonicado a 65 ° C por 5 min, equilibrado por 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, dialisado durante a noite. O Grupo 3 foi incubado a 65 ° C durante 30 min, sonicado a 65 ° C durante 15 min e, em seguida, dialisado durante a noite. O Grupo 4 foi incubado a 65 ° C por 30 min, sonicado a 65 ° C por 15 min, equilibrado por 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, dialisado durante a noite.

Diâmetro, morfologia e estabilidade física de nanolipossomas encapsulados por fármaco duplo

O diâmetro dos nanolipossomos encapsulados com o fármaco foi medido a 25 ° C usando um analisador de tamanho de partícula (ELS-Z; Otsuka Electonics Co., Ltd., Osaka, Japão). A morfologia e o diâmetro médio dos nanolipossomos encapsulados com droga única ou dupla foram observados usando um microscópio eletrônico de transmissão de emissão de campo (FE-TEM) (JEM 2100F; JEOL Ltd., Tóquio, Japão, instalado no Korea Basic Science Institute) a 200 kV. A fim de preparar a amostra, a suspensão de nanolipossoma foi fundida por gota em uma grade de cobre revestida com carbono, e a grade foi seca ao ar à temperatura ambiente antes de ser vista ao microscópio. A estabilidade física dos nanolipossomas encapsulados com fármaco duplo incubados em PBS (pH 7,4) a diferentes temperaturas de 4, 25 e 37 ° C foi investigada monitorando uma alteração no diâmetro do lipossoma em função do tempo. O diâmetro do lipossoma foi medido usando um analisador de tamanho de partícula (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Limited, Worcestershire, UK).

EE de Drogas

A eficiência de encapsulação (EE) de DOX ou ERL nos nanolipossomas encapsulados com fármaco duplo foi determinada através da seguinte Eq. (1).
$$ \ mathrm {EE} \ \ left (\% \ right) ={C} _f / {C} _i \ times 100 $$ (1)
onde C _f é a quantidade encapsulada de ERL ou DOX nos nanolipossomas medida após a destruição dos nanolipossomos com Triton-X 100 a 10% para uma liberação completa de ERL ou DOX deles. A absorbância de ERL foi medida usando um espectrômetro UV-Vis (espectrofotômetro DU-800; Backman Coulter Inc., Fullerton, CA, EUA) a 345 nm e a intensidade de fluorescência de DOX usando um espectrofluorômetro (SFM-25; Tegimenta AG, Rotkreuz , Suíça) a 495 e 590 nm de comprimentos de onda de excitação e emissão, respectivamente. A quantidade de ERL ou DOX foi calculada usando a curva de calibração de ERL ou DOX preparada com antecedência. C _i é a quantidade de ERL ou DOX adicionada à mistura de lipídios ou nanolipossomas encapsulados em ERL. As quantidades foram determinadas medindo a absorbância ou intensidade de fluorescência de cada droga nos comprimentos de onda correspondentes.

Liberação de drogas

Um cassete de diálise (10.000 MWCO, Slide-A-Lyser Dialysis Cassette G2; Thermo Scientific Corp., Rockford, IL, EUA) foi preenchido com a suspensão de nanolipossomas encapsulados com DOX e ERL. A cassete foi colocada em PBS (pH 7,4) e os meios de teste de libertação foram agitados continuamente a 37 ° C. Em pontos de tempo predeterminados, alíquotas da amostra foram retiradas do cassete para determinar a concentração de cada droga e, em seguida, a liberação da droga foi calculada através da seguinte Eq. (2)
$$ \ mathrm {Drug} \ \ mathrm {release} \ \ left (\% \ right) =\ left ({D} _i- {D} _t \ right) / {D} _i \ times 100 $$ (2 )
onde D _t é a concentração de DOX ou ERL remanescente nos nanolipossomos em um determinado momento durante o período de teste de liberação e D _i é a concentração de DOX ou ERL encapsulada nos nanolipossomos antes do experimento de liberação do fármaco. A concentração de DOX foi determinada medindo a intensidade de fluorescência da amostra com o espectrômetro de fluorescência a 495 e 590 nm de excitação e comprimentos de onda de emissão, respectivamente. A concentração de ERL foi determinada medindo a absorbância da amostra a 345 nm com o espectrômetro UV-Visível.

Análise estatística

Os resultados são apresentados como média ± SEM, a menos que indicado de outra forma.

Resultados e discussão

Efeito dos processos de preparação nas características dos nanolipossomas

Os nanolipossomas encapsulados com fármaco duplo foram preparados encapsulando ERL na membrana de bicamada lipídica e DOX no compartimento interno dos nanolipossomas. Os lipossomas encapsulados apenas com ERL foram preparados hidratando a membrana lipídica incorporada em ERL com uma solução aquosa de AS. Durante esses processos, as moléculas ERL são incorporadas na membrana lipídica por meio de atrações hidrofóbicas e, em seguida, espontaneamente encapsuladas na membrana de bicamada lipídica dos lipossomas. Após a hidratação, a suspensão de lipossomas foi submetida a ultra-sons usando o sonicador de sonda tipo chifre para reduzir o diâmetro do lipossoma. Para investigar os efeitos dos métodos de ultra-som e resfriamento no diâmetro do lipossoma, os lipossomas foram tratados com um aumento do tempo de sonicação sob diferentes condições de resfriamento e os resultados são mostrados na Fig. 2. A Figura 2a representa o efeito do tempo de ultra-som no diâmetro e índice de polidispersidade (PDI) dos lipossomas tratados sob a condição de resfriamento de um banho de água gelada. O diâmetro dos lipossomas encapsulados em ERL não tratados pela ultrassonicação foi de 759 ± 44 nm. No entanto, até 10 min de ultrassom, o diâmetro do lipossoma diminuiu notavelmente para 222 ± 40 nm, e após 10 min, não houve alteração significativa do diâmetro com o aumento do tempo de ultrassom. Estes resultados indicam que os lipossomas encapsulados em ERL formados pela hidratação são principalmente vesículas multilamelares (MLVs). A alta energia fornecida aos lipossomas do tipo MLV por meio da ultrassonicação esfolia as multicamadas de MLVs e desmonta os lipossomas grandes. Em solução aquosa, os lipídios separados dos MLVs são auto-montados por atrações hidrofóbicas e, portanto, transformados em grandes vesículas unilamelares (LUV) –– ou pequenos nanolipossomas do tipo UV (SUV). À medida que esses fenômenos se repetem, o diâmetro médio do nanolipossoma diminui gradualmente [24,25,26]. Conforme mostrado na Fig. 2a, o diâmetro dos lipossomas foi notavelmente reduzido em um curto período de ultrassom. Pensa-se que durante este período, a maioria dos lipossomas do tipo MLV foram convertidos em lipossomas do tipo LUV ou SUV [27]. A ultrassonicação com duração superior a 10 min ocasionou leve diminuição do diâmetro do lipossoma, indicando menor transformação do tipo vesicular com o tempo de ultrassom. O PDI do diâmetro do lipossoma diminuiu com o aumento do tempo de ultrassonicação, sugerindo que o diâmetro do lipossoma tornou-se uniforme com o tempo, apesar de um leve aumento do PDI após 20 min. A Figura 2b representa o efeito do tempo de ultrassom no diâmetro e PDI dos lipossomas tratados sob condição de resfriamento de um banho de água. O diâmetro dos lipossomas não tratados pela ultrassonicação foi de 1433 ± 143 nm. O diâmetro do lipossoma diminuiu significativamente para 337 ± 67 nm até 5 min da ultrassonicação e, após 5 min, houve uma diminuição gradual do diâmetro até 15 min, seguida de pequena mudança no diâmetro. O PDI do diâmetro do lipossoma variou com o tempo de ultrassonicação até 15 min e atingiu um platô a partir daí. Na condição de banho de água, o tempo gasto para reduzir o diâmetro do lipossoma para menos de 30% do diâmetro dos lipossomas não tratados foi menor do que o tempo gasto na condição de banho de água gelada. Pensa-se que a redução do diâmetro do lipossoma foi feita pela transferência da energia térmica gerada pela ultrassonicação para lipossomas do tipo MLV. Em comparação com a condição do banho de água gelada, a temperatura da suspensão de lipossoma sonicada sob a condição de banho de água foi elevada demais, implicando que o calor da suspensão de lipossoma que ocorreu devido a um aquecimento em massa por cavitação ultrassônica foi menos eficientemente liberado. Para proteger a suspensão de lipossomas de efeitos colaterais, como evaporação do meio e possível deterioração das moléculas de lipídios induzida pelo superaquecimento, o banho de água gelada foi escolhido como a condição de resfriamento para a ultrassonicação. Por outro lado, os lipossomas ultra-sônicos foram dialisados ​​para remover AS não encapsulado. Os nanolipossomos encapsulados em ERL e AS preparados usando a ultrassonicação e a diálise tinham cerca de 140 nm do diâmetro médio dos nanolipossomos, sugerindo uma ligeira diminuição do diâmetro dos nanolipossomos durante a diálise. Os nanolipossomos encapsulados em ERL e AS foram utilizados para encapsulação de DOX no compartimento interno dos nanolipossomos usando o método de gradiente AS.

Efeitos do tempo de sonicação da sonda no diâmetro e índice de polidispersidade de nanolipossomos encapsulados em ERL:um banho de água gelada ( a ) ou banho-maria ( b ) resfriamento da suspensão de lipossomas em um recipiente durante a ultrassonicação ( n =3, os dados são apresentados como média ± SEM)

A Figura 3 mostra o diâmetro de nanolipossomos encapsulados em DOX e ERL de acordo com o tempo de ultrassonicação usando um sonicador de banho durante um processo de carregamento de DOX. Baixas variações do diâmetro foram semelhantes àquelas após 10 min de ultrassonicação de nanolipossomas encapsulados em ERL, como mostrado na Fig. 2a. Apesar do aumento do tempo de ultrassom, o diâmetro do nanolipossoma não mudou significativamente até 45 min de ultrassom. Esses resultados podem ser atribuídos ao fato de que os nanolipossomos encapsulados em DOX e ERL são LUVs ou SUVs [27]. Já quando o tempo de ultrassonicação ultrapassou 45 min, ocorreu o aumento da MEV do diâmetro médio dos nanolipossomas, indicando aumento das diferenças entre as amostras de lipossomas. O PDI do diâmetro diminuiu com o aumento do tempo de ultrassom. Esses resultados sugerem que a uniformidade do diâmetro do lipossoma aumentou com o tempo de ultrassom, apesar de um leve aumento do PDI após 60 min de ultrassom. Resumindo, a mudança no diâmetro do nanolipossoma por ultrassonicação foi a maior no estágio de transformação onde os lipossomas seriam convertidos de MLVs para LUVs ou SUVs. Portanto, a ultrassonicação para redução do diâmetro do lipossoma foi mais eficaz quando o tratamento foi realizado entre a hidratação da membrana lipídica e a encapsulação de DOX no compartimento interno de nanolipossomas encapsulados em ERL por um período relativamente curto.

Efeitos do tempo de sonicação do banho no diâmetro e índice de polidispersidade de nanolipossomas encapsulados em DOX e ERL ( n =3, os dados são apresentados como média ± SEM)

Efeito do método de carregamento de drogas na EE

Os nanolipossomos encapsulados por fármaco duplo foram preparados usando DOX-loading em nanolipossomas encapsulados em ERL com aproximadamente 30% EE de ERL e 140 nm de diâmetro do nanolipossoma. A quantidade de DOX ou ERL encapsulado nos lipossomas foi medida após a destruição dos lipossomas com um surfactante para liberações completas dos fármacos dos lipossomas. A intensidade de fluorescência de DOX e a absorbância de ERL foram medidas por espectrofluorometria e espectrometria de UV-Vis, respectivamente. Para investigar os efeitos dos métodos de carregamento de DOX sobre EE de DOX em nanolipossomas encapsulados em ERL e DOX, o método de carregamento ativo, como gradiente de pH ou método de gradiente AS, foi utilizado para encapsulamento de DOX nos lipossomas. A diferença em EE entre os dois métodos de carregamento de droga foi investigada e os resultados são mostrados na Fig. 4. Os EEs de DOX usando o método de gradiente AS foram 90% ou mais, e o EE usando gradiente de pH foi de cerca 17%, indicando que o método AS-gradiente foi muito mais eficaz no encapsulamento DOX do que o método pH-gradiente [28].

Eficiência de encapsulação de DOX em nanolipossomos encapsulados por fármaco duplo de acordo com métodos de carregamento de DOX e concentrações de sulfato de amônio (AS):ácido cítrico CA ( n =3, os dados são apresentados como média ± SEM)

Quando as mudanças nos EEs de DOX de acordo com as concentrações de AS foram comparadas, o EE foi o mais alto e o SEM do EE foi o mais baixo com AS 350 mM. O método de gradiente AS ou gradiente de pH utiliza um mecanismo de translocação de drogas, que induz as drogas fora dos nanolipossomas a migrar para o compartimento interno dos nanolipossomos por causa de uma força motriz gerada a partir de um gradiente de concentração de íons transmembrana dos nanolipossomos [29, 30]. O EE do DOX pelo método AS-gradiente foi, entretanto, bastante maior do que o método do pH-gradiente. Esses resultados podem ser atribuídos ao fato de que o método AS-gradiente é mais eficaz no desenvolvimento de complexos cristalinos do que o método do pH-gradiente devido à maior cristalização entre o DOX ionizado e os contra-íons dentro dos nanolipossomas [31, 32].

Efeito das condições de carregamento de drogas na EE

Para investigar o efeito das condições de tratamento para uma mistura de solução de DOX e nanolipossomos encapsulados em ERL no EE de DOX durante o processo de carregamento de DOX, quatro grupos experimentais mostrados na Fig. 5a foram projetados e experimentados de acordo com as diferentes condições de tratamento. O Grupo 1 foi a mistura tratada na sequência de uma incubação, uma sonicação e uma diálise durante a noite. No grupo 2, para investigar o efeito de um equilíbrio da mistura sonicada no EE, a mistura foi incubada, sonicada, equilibrada por 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, dialisada durante a noite. Como um grupo para investigar o efeito de uma sonicação de longo prazo no EE, o grupo 3 foi a mistura incubada, sonicada a 65 ° C por 15 min, e então dialisada durante a noite. Além disso, como um grupo para investigar os efeitos de uma sonicação de longo prazo e um equilíbrio no EE, o grupo 4 foi a mistura incubada, sonicada a 65 ° C por 15 min, equilibrada por 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, dialisada durante a noite. Em todos os grupos, o carregamento de DOX foi realizado usando o método AS-gradiente. Conforme mostrado na Fig. 5b, os EEs de DOX dos grupos 1, 2, 3 e 4 foram 93 ± 7,8, 98 ± 2,5, 83 ± 4,9 e 59 ± 4,2%, respectivamente. Em comparação com o EE do grupo 3, o EE do grupo 1 foi maior, indicando que uma menor duração da sonicação do banho é um tratamento mais eficaz para aumentar o EE nos nanolipossomos. Quando comparado com o EE do grupo 1, o grupo 2 apresentou maior EE de DOX. O EE do grupo 4 foi o menor entre todos os grupos experimentados. Em contraste com o realce de EE pelo equilíbrio após uma sonicação de curto prazo aplicada ao grupo 2, o equilíbrio após uma sonicação de longo prazo aplicada ao grupo 4 não foi eficaz para o realce de EE. Esses resultados podem ser devido à quantidade excessiva de energia fornecida à suspensão, o que poderia interromper os nanolipossomos durante a sonicação do banho descrita acima. Além disso, acredita-se que por sonicação de banho de longo prazo nos grupos 3 e 4, o EE foi reduzido por causa de uma diminuição do conteúdo de AS nos nanolipossomas. Uma vez que a temperatura da suspensão de nanolipossoma aumentou muito além da temperatura de transição de fase ( T _c ) pela sonicação do banho de longo prazo, a fluidez da bicamada lipídica aumentou e, portanto, induziu a liberação de AS dos lipossomas. As amostras de nanolipossomas do grupo 3 foram dialisadas imediatamente após a sonicação do banho, sugerindo um rápido resfriamento das amostras. Em contraste, as amostras de nanolipossomas do grupo 4 foram tratadas pelo banho de sonicação de longo prazo seguido pelo equilíbrio, que pode sustentar a liberação de AS, aumentar a formação do complexo DOX-sulfato fora dos lipossomas e, portanto, diminuir o EE. Embora o equilíbrio após a sonicação de longo prazo não tenha sido eficaz, esses resultados sugerem que o processo de carregamento de DOX, como um tratamento sequencial da mistura da solução de DOX e os nanolipossomas encapsulados em ERL - uma incubação acima de T _c de fosfolipídeo, um banho de sonicação, um equilíbrio abaixo do T _c , por exemplo, em RT e uma diálise durante a noite - é um método mais eficaz para aumentar o EE do que outros processos sem o tratamento de equilíbrio [33,34,35].

Eficiência de encapsulamento de DOX em nanolipossomos encapsulados por fármaco duplo de acordo com várias condições de carga de fármaco:condições de carga de fármaco para cada grupo experimental ( a ) e eficiências de encapsulação de drogas dos grupos experimentais ( b ) ( n =3, os dados são apresentados como média ± SEM)

Morfologia e estabilidade física de nanolipossomas encapsulados por fármacos duplos

A Figura 6 mostra a morfologia dos nanolipossomos observados por TEM. As amostras para observação de TEM foram preparadas usando drop-casting dos nanolipossomos co-encapsulados com ERL e DOX em uma grade de cobre revestida com carbono e secagem ao ar em temperatura ambiente. A fim de comparar as características dos lipossomas encapsulados com fármaco duplo com os lipossomas encapsulados com fármaco único, a morfologia dos nanolipossomas encapsulados em ERL ou encapsulados em DOX foi observada por TEM. Como mostrado na Fig. 6a, o diâmetro dos nanolipossomas encapsulados com fármaco duplo era inferior a 200 nm e a forma era quase esférica. O diâmetro do lipossoma observado através da análise TEM foi coincidente com o valor medido usando um analisador de tamanho de partícula utilizando espalhamento de luz dinâmico. A Figura 6b mostra a imagem de um único nanolipossoma contendo complexos de DOX-sulfato dentro do lipossoma. Os complexos foram assumidos como sendo os cristais formados pela atração entre os cátions DOX protonados e os ânions sulfato divalente [36]. A Figura 6c mostra uma imagem TEM de alta resolução (HR-), que exibiu os cristais da droga na região mais externa do nanolipossoma presente na Fig. 6b. A imagem revelou que uma rede altamente cristalina no compartimento interno do nanolipossoma e um domínio menos cristalino estão tendo um domínio amorfo próximo ao carbono na grade [37]. O domínio amorfo na região mais externa do nanolipossoma pode ser devido à instabilidade da bicamada lipídica após a exposição ao feixe de elétrons com alta energia. O padrão de difração de elétrons de área selecionada (SAED) presente na Fig. 6d exibiu uma regularidade de pontos de difração brilhantes, indicando que os cristais mostrados na Fig. 6c têm uma rede cristalina altamente ordenada [38]. Para comparar os resultados da análise de TEM dos nanolipossomos encapsulados com fármaco duplo com os dos nanolipossomos encapsulados com fármaco único, o nanolipossoma encapsulado com ERL foi observado por TEM e a imagem é mostrada na Fig. 6e. A região mais externa do nanolipossoma presente na Fig. 6e foi observada por HR-TEM, e o resultado é mostrado na Fig. 6f. From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T _c of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T _c and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T _c (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n  = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.

Conclusões

As a dual drug delivery system, a nanoliposomal delivery system encapsulating both ERL and DOX was prepared and characterized. The liposome diameter was controllable by ultrasonication, and the sonication for diameter reduction was effective when carried out after the film-hydration and before DOX encapsulation. The nanoliposome diameter decreased remarkably during an initial period of ultrasonication. DOX was loaded into ERL-encapsulated nanoliposomes through pH- or AS-gradient method. AS-gradient method showed higher EE of DOX than pH-gradient, and the AS concentration for higher EE of DOX was determined. Equilibration of a mixture of DOX solution and ERL-encapsulated nanoliposomes in DOX-loading process was advantageous for EE increase of DOX. By HR-TEM and SAED analyses of the dual drug-encapsulated nanoliposomes, not only the highly oriented crystals formed between protonated DOX cations and divalent sulfate anions inside the liposome but also the less oriented small crystals of ERL in the outermost layer of the nanoliposome were identified. ERL and DOX co-encapsulated in the nanoliposomes showed a time-differential release, indicating much faster release of ERL than that of DOX from the liposomes. The elucidated preparation methods of the nanoliposomal dual drug delivery system can contribute to development of advanced dual drug delivery systems and translational researches of the combination therapies exhibiting synergistic effects via sequential actions of the drugs.

Abreviações

DOX:

Doxorubicin

DSPC:

1,2-Distearoyl-sn -glycero-3-phosphocholine

EE:

Encapsulation efficiency

EPR:

Enhanced permeability and retention

ERL:

Erlotinib

PK:

Pharmacokinetic

POPG:

1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-phospho-(1′-rac -glycerol) (sodium salt)

SAED:

Selected area electron diffraction

SEM:

Standard error of mean

T _c :

Phase-transition temperature

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

Efeito de campo ferroelétrico Efeito de comutação assimétrica resistiva induzida em BaTiO3 / Nb:SrTiO3 Heterojunções epitaxiais Geração de espécies reativas de oxigênio em soluções aquosas contendo nanopartículas de GdVO4:Eu3 + e seus complexos com azul de metileno