Nanoplataformas de sílica mesoporosa oca responsivas à enzima protegidas por quitosana para entrega de drogas específicas do cólon

Resumo

Um sistema de entrega específico do cólon responsivo à enzima foi desenvolvido com base em esferas ocas de sílica mesoporosa (HMSS) às quais a quitosana biodegradável (CS) foi anexada através de ligações azo cliváveis (HMSS-N =N-CS). A doxorrubicina (DOX) foi encapsulada em um estado não cristalino na cavidade oca e mesoporos de HMSS com a alta quantidade de carga de 35,2%. A liberação do fármaco in vitro provou que o HMSS – N =N – CS / DOX realizou a liberação do fármaco com resposta enzimática. O SC enxertado pode aumentar a biocompatibilidade e estabilidade e reduzir a adsorção de proteínas no HMSS. Os resultados de irritação da mucosa gastrointestinal e citotoxicidade celular indicaram a boa biocompatibilidade de HMSS e HMSS – N =N – CS. Os resultados de captação celular indicaram que a captação de DOX foi obviamente aumentada depois que HMSS – N =N – CS / DOX foi pré-incubado com uma mistura de enzimas do cólon. HMSS – N =N – CS / DOX incubado com enzimas do cólon mostrou citotoxicidade aumentada e seu IC ₅₀ o valor foi três vezes menor do que o do grupo HMSS – N =N – CS / DOX sem enzimas do cólon. O presente trabalho estabelece as bases para pesquisas subsequentes sobre portadores mesoporosos para administração oral de drogas específicas ao cólon.

Introdução

Recentemente, os sistemas de entrega de drogas responsivos a estímulos (DDSs) têm atraído muita atenção para o carregamento eficiente e liberação seletiva de drogas em tecidos doentes alvo [1]. Os sistemas responsivos a estímulos projetados podem ser entregues a locais doentes e realizar a liberação de drogas sob demanda para melhorar os efeitos terapêuticos e impedir os efeitos colaterais induzidos por vazamento prematuro. Todos os estímulos internos e externos, como potencial redox [2], pH [1], enzimas [3] e temperatura e luz [4, 5], foram usados para projetar DDSs responsivos a estímulos. Dentre esses estímulos, as enzimas, como estímulos internos, têm ganhado grande atenção devido às suas distintas concentrações em diferentes tecidos [6].

Nas últimas duas décadas, as esferas de sílica mesoporosa (MSSs) com mesoporos variando de 2 a 50 nm de tamanho foram estabelecidas como portadores de drogas responsivos a estímulos [7, 8], uma vez que os MSSs têm um volume de poro notavelmente grande e alta área de superfície para alta capacidade de carga de drogas, estrutura de poros bem organizada, superfície facilmente funcionalizada e boa biocompatibilidade [9]. Além disso, as nanopartículas de esfera de sílica mesoporosa oca (HMSS) com uma estrutura de concha mesoporosa e uma cavidade oca são superiores aos MSSs convencionais porque a estrutura oca pode conter com eficiência mais drogas com uma capacidade de armazenamento superior do que os portadores de MSSs [10, 11]. Todos os tipos de nanocarreadores responsivos a estímulos baseados em MSSs foram desenvolvidos para hospedar moléculas de drogas usando vários gatekeepers, como polímeros [12], nanopartículas inorgânicas [13], dendrímeros, biomacromoléculas [14], compostos macrocíclicos, peptídeos [15] e lipídeos [ 16]. Embora vários DDSs baseados em MSSs com capeamento funcional possam realizar a liberação em resposta a vários estímulos externos ou internos, poucos deles foram usados na distribuição de drogas direcionadas específicas ao cólon.

É bem sabido que a administração oral de medicamentos é a forma preferida e simples de administrar medicamentos. A administração de drogas específicas para o cólon é muito fascinante para o tratamento de doenças do cólon, incluindo a doença de Crohn, câncer colorretal e colite ulcerosa. No entanto, a administração de drogas específicas ao cólon pode encontrar vários problemas, incluindo menor teor de água e relativamente menos superfície para adsorção oral do que em outros locais do trato gastrointestinal (GI) [17,18,19]. Além disso, os DDSs orais também encontram um forte ambiente ácido no estômago, o que pode acelerar a degradação de drogas carregadas no trato gastrointestinal, removendo assim a capacidade de realizar a entrega direcionada ao cólon [19]. Por esta razão, vários DDSs dependentes de pH foram projetados para realizar a liberação de droga desencadeada por pH em valores de pH quase neutros (6–7) do trato GI, resistindo às condições altamente ácidas na região do estômago [20,21,22 , 23]. Existe apenas uma ligeira diferença na acidez entre as regiões intestinal (pH 6,8) e colônica (pH 7,4); portanto, tais DDSs responsivos ao pH têm dificuldade em realizar a liberação específica do cólon.

Quitosana (CS), um polissacarídeo catiônico e biodegradável naturalmente presente, é constituído por unidades de glucosamina ligada a β- (1-4) e N-acetil-D-glucosamina [24]. A SC tem recebido grande atenção na medicina biológica devido às suas propriedades fascinantes, incluindo biodegradabilidade, biocompatibilidade, mucoadesividade e atividade antibacteriana [25,26,27,28,29]. Comparado com polímeros, polieletrólitos e supramoléculas sintetizados por meio de processos complicados, CS é relativamente barato e prontamente disponível pela desacetilação exaustiva da quitina [30,31,32]. Além disso, foi relatado que o CS pode abrir junções herméticas entre as células, aumentando assim a absorção do fármaco [33]. Portanto, o polímero CS foi selecionado como agente de cobertura devido à sua boa biocompatibilidade e tamanho adequado para cobrir os mesoporos de HMSS para bloquear a liberação do fármaco.

Em nosso trabalho, um DDS responsivo à enzima específico do cólon com base em um material HMSS (HMSS-N =N-CS) foi projetado pela primeira vez como exibido no Esquema 1. Neste sistema, os portadores de HMSS foram preparados por meio de um estratégia de gravação. O polímero CS foi ligado à superfície do HMSS por ligações azo para atuar como um porteiro para bloquear as aberturas do HMSS. As ligações azo entre HMSS e CS podem ser clivadas por enzimas em locais do cólon [34, 35], resultando na separação de CS das aberturas de HMSS. O DOX foi usado como o fármaco modelo a ser incorporado na cavidade do HMSS, e experimentos de liberação do fármaco in vitro foram conduzidos para avaliar a liberação responsiva à enzima na presença de enzimas do cólon. Microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) e citometria de fluxo (FCM) foram utilizadas para investigar a captação celular pelas células Caco-2. Finalmente, a citotoxicidade de HMSS – N =N – CS / DOX em relação às células Caco-2 foi medida.

Ilustração esquemática de a processo de preparação de HMSS – N =N – CS e b a carga de droga e liberação enzimática de HMSS – N =N – CS / DOX em resposta à enzima do cólon

Materiais e métodos

Materiais

Tetraetoxissilano (TEOS); Cloridrato de N- (3-dimetilaminopropil) -N-etilcarbodiimida (EDC); quitosana (DAC ≥ 95%); brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB); 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES); Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT); ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico; brometo de potássio (pureza espectral, ≥ 99,5%); N-hidroxisuccinimida (NHS) e DOX foram adquiridos de Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China). O ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico foi fornecido pela Inno-chem Technology Co. Ltd. (Pequim, China). Os meios de cultura de células DMEM, penicilina-estreptomicina e soro fetal bovino (FBS) foram fornecidos por GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, EUA). Todos os reagentes analíticos não foram mais purificados antes do uso.

Preparação de HMSS – N =N – CS

Preparação de HMSS – NH ₂

As nanopartículas de HMSS foram preparadas com base no trabalho publicado usando um método de corrosão seletiva [36]. As esferas de sílica sólida foram inicialmente sintetizadas por um método de Stober modificado. Resumidamente, 6 mL de TEOS foram vertidos na mistura de 10 mL de água desionizada, 74 mL de etanol e 3 mL de NH concentrado ₃ · H ₂ O. Subsequentemente, a mistura foi agitada durante 60 min para obter suspensões de sílica coloidal à temperatura ambiente. As esferas sólidas foram centrifugadas, lavadas e secas para uso posterior. Em seguida, a concha de sílica mesoporosa foi coberta com esferas de sílica sólida. Trezentos miligramas de sílica sólida foram dispersos em 50 mL de água desionizada por ultra-sonicação por 45 min. E as suspensões de sílica foram vertidas em uma mistura de 60 mL de etanol, 450 mg de CTAB, 90 mL de água e 1,7 mL de NH ₃ · H ₂ O. Após a mistura ser agitada durante 60 min, foi adicionado TEOS (0,75 mL). Posteriormente, as nanopartículas foram centrifugadas após agitação por 6 h para coletar as amostras e, em seguida, redispersas em 40 mL de água. Cerca de 1,2 g de Na ₂ CO ₃ foi adicionado à suspensão de água com agitação vigorosa. Após a mistura ser mantida a 55 ° C por 12 h, os produtos das nanopartículas de HMSS foram coletados e lavados com etanol anidro. O método de pós-enxerto com a proporção de HMSS e APTES sendo 4:1 (m / v) para preparar HMSS – NH ₂ a 80 ° C sob N ₂ condição por 8 h, ao CTAB foi removido por refluxo [3].

Preparação de HMSS – N =N – COOH

O ácido azobenzeno-3,3'-dicarboxílico (50 mg) foi adicionado em pH 5,8 PBS. Em seguida, (5 mg / mL), EDC e (3 mg / mL) NHS foram adicionados para ativar o ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico a 30 ° C durante 1 h. E 10 mL de PBS contendo 15 mg / mL de HMSS – NH ₂ foi adicionado, e a mistura foi agitada durante 24 h. E o HMSS – N =N – COOH resultante foi separado por centrifugação e lavado com etanol.

Preparação de HMSS – N =N – CS

0,15 g de CS e 0,5 mL de ácido acético foram adicionados em 50 mL de água para preparar a solução de CS. E 100 mg de HMSS – N =N – COOH foram dispersos em 25 mL de pH 5,0 PBS e ativados por EDC e NHS por 0,5 h. Em seguida, a solução de CS (10 mL) foi vertida na suspensão com agitação contínua durante 1 dia. Finalmente, o HMSS – N =N – CS sintetizado foi centrifugado e lavado para coletar as amostras.

Extração da mistura de enzimas do cólon da microflora

A microflora colônica foi coletada de acordo com um trabalho publicado [37]. Em seguida, a cultura foi inoculada para obtenção da mistura enzimática secretada pela microflora colônica a 37 ° C. O meio do cólon simulado contendo a mistura de enzimas foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm para remover todos os resíduos celulares do fluido de cultura. Posteriormente, o filtrado foi liofilizado para obtenção da mistura enzimática em pó, a qual foi utilizada no estudo posterior.

Processo de carregamento de drogas e liberação responsiva a enzimas

Vinte e cinco miligramas de DOX foram dissolvidos em 5 mL de solução de HCl de pH 3,5. E 100 mg de HMSS – N =N – CS foram adicionados à solução de DOX e agitados em temperatura ambiente por 12 h. Posteriormente, uma solução de NaOH 0,2 M foi usada para ajustar o pH da mistura para 7,0, e a suspensão foi agitada por mais 12 h. Em seguida, o HMSS – N =N – CS carregado com DOX (referido como HMSS – N =N – CS / DOX) foi centrifugado e lavado para remover o DOX adsorvido na superfície do HMSS – N =N – CS. O sobrenadante foi coletado em cada etapa para medir a eficiência de carregamento DOX (LE) em 480 nm por espectrofotometria UV-Vis. A massa total de DOX carregada em HMSS – N =N – CS foi calculada subtraindo-se a DOX descarregada após os processos de carregamento de drogas da massa inicial de DOX adicionada. O HMSS / DOX foi preparado como um controle usando HMSS como o portador inicial. O LE do DOX foi calculado de acordo com a equação:
$$ \ mathrm {LE} \ \ left (\% \ right) =\ frac {m_A- {m} _B} {m_A- {m} _B + {m} _C} \ times 100 $$
Em que m _A foi a massa adicionada de DOX, m _B era a massa de DOX no sobrenadante, e m _C foi a massa total de HMSS – N =N – CS.

A liberação enzimática in vitro de DOX de HMSS – N =N – CS / DOX foi avaliada como segue. Dois miligramas de nanopartículas de HMSS – N =N – CS / DOX e HMSS / DOX foram dispersos em PBS de pH 7,4 agitando a 125 rpm com diferentes concentrações de mistura de enzimas do cólon (0 mg / mL, 0,3 mg / mL e 1 mg / mL) . Em intervalos de tempo especificados, 1 mL de meio de liberação foi retirado para medir a absorbância. A liberação de DOX foi medida em 480 nm. HMSS / DOX foi usado como um controle.

Adsorção BSA

A quantidade de adsorção de BSA foi avaliada com base nos trabalhos publicados [38, 39]. BSA foi adicionado em pH 7,4 PBS (0,5 mg / mL). Cinco miligramas de HMSS e HMSS – NH ₂ e HMSS – N =N – CS foram adicionados a 2,5 mL de PBS (pH 7,4). E a solução de BSA de volume igual foi fornecida, e a suspensão foi colocada em um agitador a 100 rpm. Após 6 h, centrifugação foi usada para coletar a solução superior. Por fim, a concentração de BSA foi medida a 595 nm após a coloração com solução de azul brilhante de Coomassie.

Caracterização

A estrutura da rede mesoporosa e a morfologia das nanopartículas de HMSS foram avaliadas por imagens TEM (EM – 208S, CSIS, EUA). A área de superfície e distribuição de tamanho de poro das nanopartículas foram caracterizadas usando analisador de análise de adsorção de nitrogênio (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China). Os potenciais ξ e tamanhos de partícula foram caracterizados em um Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK). A análise de TGA foi medida em um equipamento TGA-50 (Shimadzu, Kyoto, Japão) com uma taxa de aquecimento de 10 ° C / min sob fluxo de nitrogênio. Os espectros espectrofotométricos de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) foram medidos usando um espectrômetro FT-IR (Bruker Tensor27, Suíça). O intervalo foi realizado de 400 a 4000 cm ⁻¹ usando a técnica de pelotas de KBr. O Power XRD foi realizado em um difratômetro de raios-X Siemens D5005 (Karlsruhe, Alemanha) com radiação Cu-Kα ( λ =1,5418 Å).

Cultura de células e experimento de captação de células

As células Caco-2 foram cultivadas em um meio suplementado com 10% de FBS, 1% de aminoácido não essencial, 1% (v / v) de ácido pirúvico de sódio e 1% de estreptomicina. As células NIH-3T3 foram cultivadas em DMEM com estreptomicina a 1% e FBS a 10%. A captação das células Caco-2 dos nanocarreadores foi caracterizada usando FCM e CLSM. As células Caco-2 foram semeadas em placas de 24 poços. Após a cultura durante a noite, DOX livre, HMSS – N =N – CS / DOX e HMSS – N =N – CS / DOX pré-incubados com nanopartículas de enzimas do cólon (igual à concentração de 5 μg / mL DOX) foram adicionados aos poços correspondentes . Após incubação contínua por 2 h, o meio celular foi removido e lavado completamente com PBS. Em seguida, as células foram fixadas em formaldeído a 4% e coradas por Hoechst 33258 para observação CLSM. O FCM foi usado para obter uma avaliação quantitativa da captação celular. As células Caco-2 foram semeadas em placas de 6 poços e posteriormente incubadas por 24 h. Após a lavagem com PBS, as células Caco-2 foram incubadas com DOX livre, HMSS – N =N – CS / DOX e HMSS – N =N – CS / DOX pré-incubado com nanopartículas de enzimas do cólon (igual à concentração de 5 μg / mL DOX) em DMEM sem soro por 2 h. Em seguida, as células Caco-2 foram enxaguadas com PBS frio, tripsinizadas e ressuspensas em 0,5 mL de PBS. A fluorescência DOX nas células foi medida usando um citômetro de fluxo FACS Canto (Becton, Dickinson, EUA).

Ensaio de proliferação celular in vitro

A citotoxicidade de HMSS e HMSS – N =N – CS em branco carreadores para células NIH-3T3 e Caco – 2 foi testificada por ensaio MTT [40, 41]. Resumidamente, as células Caco – 2 e as células NIH-3T3 foram semeadas separadamente em placas de 96 poços e posteriormente incubadas durante a noite. O antigo meio celular foi substituído por um meio sem soro contendo diferentes concentrações de nanopartículas. Após incubação por 2 dias, 50 μL de solução de MTT (2 mg mL ^–1 ) foi adicionado e incubado por 4 h para medir as células vivas. Em seguida, a solução de MTT foi removida e 150 μL de DMSO foram adicionados para dissolver o formazan. Posteriormente, a absorbância foi medida em um leitor de microplacas (Tecan, Männedorf, Suíça) a 570 nm. A citotoxicidade de DOX livre, HMSS – N =N – CS / DOX e HMSS – N =N – CS / DOX pré-incubados com misturas de enzimas extraídas da microflora colônica foi medida usando células Caco-2 com as concentrações de DOX correspondentes de (0,1, 1, 5, 10 e 20 μg / mL). O tempo de incubação foi de 48 h, e os outros processos do experimento foram iguais aos descritos acima.

Estudos de toxicidade

Os testes de irritação da mucosa gastrointestinal são vitais para a avaliação da biossegurança da administração oral de fármacos in vivo. Ratos Sprague-Dawley machos (180 ± 10 g) foram divididos aleatoriamente em três grupos (três ratos para cada grupo). Os ratos receberam soro fisiológico, HMSS e nanopartículas de HMSS – N =N – CS com uma dose de 100 mg / kg para cada dia. Após 7 dias, todos os ratos foram sacrificados e os tecidos coletados e examinados por exame histopatológico (H&E). Para avaliar a biossegurança de nanopartículas de HMSS e HMSS – N =N – CS, os pesos corporais de camundongos BALB / c (18–20 g) foram registrados após a administração oral de uma dose de 100 mg / kg a cada dois dias. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório da Qiqihar Medical University e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Qiqihar Medical University.

Estatísticas

Os dados estatísticos foram analisados com um software SPSS usando Student’s t bicaudas -teste. As barras de erro apresentadas neste estudo são SD. A p <0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados e discussão

Preparação e caracterização de HMSS – N =N – CS

O HMSS foi preparado com base em trabalhos anteriores com pequenas alterações [36]. Primeiro, SiO sólido ₂ nanoesferas foram preparadas, e um invólucro mesoporoso foi revestido na superfície das nanoesferas de sílica sólida contendo o modelo CTAB. Então, Na ₂ CO ₃ foi usado para gravar seletivamente o SiO sólido ₂ nanoesferas enquanto a concha mesoporosa foi protegida pelo modelo CTAB. A preparação de HMSS – N =N – CS com CS anexado como um “gatekeeper” por uma ligação azo é descrita na Fig. 1a. Primeiro, as superfícies das nanopartículas de HMSS foram modificadas com APTES como um reagente de acoplamento alquil para se tornar HMSS amino funcionalizado (HMSS – NH ₂ ) por um método de pós-modificação. Posteriormente, HMSS – N =N – COOH foi preparado por uma reação de amidação entre os grupos amino de HMSS – NH ₂ e os grupos carboxila do ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico. Em seguida, CS foi covalentemente modificado na superfície de nanopartículas de HMSS por uma reação de amidação entre os grupos carboxila de HMSS – N =N – COOH e os grupos amino em CS.

TEM de a HMSS e b HMSS – N =N – CS

Conforme exibido na imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) na Fig. 1a, o diâmetro médio de HMSS era 280 nm, e os HMSSs tinham uma estrutura oca uniforme e concha mesoporosa altamente ordenada. A espessura média da casca mesoporosa era de aproximadamente 90 nm. Em comparação com a superfície lisa do HMSS, a superfície do polímero enxertado HMSS – N =N – CS (Fig. 1b) era áspera, indicando que o CS cobriu o transportador HMSS.

As áreas de superfície e distribuições de poros de materiais mesoporosos desempenharam um papel crucial no carregamento e distribuição de moléculas hospedeiras para liberação controlada. Curvas de distribuição de tamanho de poros e isotérmicas foram medidas por N ₂ análise de adsorção e dessorção (Fig. 2). Parâmetros detalhados (a área de superfície de Brunauer – Emmett – Teller (BET) ( S _APOSTA ), volume total do poro ( V _P ), e distribuição de tamanho de poro ( D _P )) são exibidos na Tabela 1. O S _APOSTA e V _P de HMSS puro eram 810,7 m ² / ge 0,969 cm ³ / g, respectivamente, e o D _P foi de aproximadamente 3,8 nm. O D _P de HMSS – NH ₂ foi quase igual ao do HMSS após a aminação, indicando que os mesoporos não foram bloqueados após a funcionalização do amino. O S _APOSTA e V _P de HMSS – N =N – CS foram marcadamente diminuídos após a modificação pelo composto azo e revestimento de CS, indicando que CS havia revestido a superfície do HMSS [1].

a As isotermas de adsorção / dessorção de nitrogênio e b distribuições de tamanho de poro de HMSS, HMSS – NH ₂ , e HMSS – N =N – CS

O enxerto bem-sucedido de HMSS – N =N – CS foi verificado por vários métodos. O potencial ξ de HMSS – NH ₂ sofreu grande alteração após a funcionalização, variando de - 27,9 a + 31,4 mV, conforme mostrado na Fig. 3a, que foi atribuída à adição dos grupos amina à superfície do HMSS. Após HMSS – NH ₂ reagiu com ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico para formar HMSS – N =N – COOH, o potencial ξ diminuiu ainda mais para - 2,0 mV por causa dos grupos carboxila na superfície do HMSS. Depois que o polímero CS foi posteriormente enxertado na superfície do HMSS para formar HMSS – N =N – CS, o potencial ξ reverteu para + 32,4 mV. O resultado foi atribuído ao revestimento CS carregado positivamente com abundância de amino na superfície do HMSS [1]. Curvas de análise termogravimétrica (TGA) de HMSS, HMSS – NH ₂ , As espécies HMSS – N =N – COOH e HMSS – N =N – CS são mostradas na Fig. 3b. Comparado com HMSS – N =N – COOH, HMSS – N =N – CS perdeu um peso adicional de aproximadamente 19%, que foi devido à remoção das cadeias de CS. O enxerto de ligações azo na superfície de HMSS também foi confirmado por uma mudança de cor durante a preparação de HMSS – N =N – COOH, como mostrado no inset na Fig. 3b. O reagente HMSS – NH ₂ é branco, enquanto o produto HMSS – N =N – COOH era marrom-amarelado após o ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico reagir com os grupos amino do HMSS. O diâmetro hidrodinâmico ( D _H ) e valores de índice de polidispersidade (PDI) de HMSS, HMSS – NH ₂ , e HMSS – N =N – CS foram determinados em água destilada, como mostrado na Fig. 3c. O HMSS tinha um diâmetro de 309 nm e um PDI de 0,190. Após a adição de grupos amina nas superfícies de HMSS para formar HMSS – NH ₂ , o D _H aumentou para 324 nm. O diâmetro do HMSS – N =N – CS era de 342 nm, que era maior do que o do HMSS – NH ₂ devido às cadeias CS enxertadas. O PDI de HMSS – N =N – CS (0,177) era menor do que o de HMSS – NH ₂ , indicando que os tamanhos médios das partículas tornaram-se ainda maiores após o enxerto de CS. Em comparação com os diâmetros obtidos a partir de TEM, os diâmetros de HMSS e HMSS – N =N – CS medidos por DLS foram maiores. O D _H das nanopartículas foi medido em um ambiente de água com uma camada de hidratação, enquanto o tamanho das nanopartículas fornecido por TEM foi obtido a partir de nanopartículas secas [3]. Espectros FT-IR de HMSS – NH ₂ , HMSS – N =N – COOH, HMSS – N =N – CS e CS são mostrados na Fig. 4d. Comparado com os picos para HMSN – NH ₂ , um aumento nos picos de adsorção em 2853 e 2925 cm ⁻¹ foi atribuído à vibração de - CH ₂ no enxerto de ligações azo carboxi-terminais. Depois que CS foi adicionado à superfície de HMSS – N =N – COOH, houve aumentos nos picos de adsorção em 1660 cm ⁻¹ e 3435 cm ⁻¹ , que foram atribuídos a υ _{(C =O)} na banda amida e a vibração de N – H no CS. Todos os resultados comprovaram a preparação bem-sucedida de HMSS – N =N – CS.

a Os potenciais ξ correspondentes de HMSS, HMSS – NH ₂ , HMSS – N =N – COOH e HMSS – N =N – CS; b As curvas TGA de HMSS – NH ₂ , HMSS – N =N – COOH e HMSS – N =N – CS (a inserção:a fotografia de ( a ) HMSS – N =N – COOH e ( b ) HMSS – NH ₂ ); c Distribuição de tamanho de HMSS, HMSS – NH ₂ , e HMSS – N =N – CS inserção:os valores PDI correspondentes das nanopartículas; e d Espectros FT-IR de HMSS – NH ₂ , HMSS – N =N – COOH, HMSS – N =N – CS e CS

Padrões de XRD de DOX, HMSS – N =N – CS, HMSS – N =N – CS / DOX e PM

Estado de droga e eficiência de carregamento

O DOX foi escolhido para investigar os comportamentos de carregamento e liberação de HMSS – N =N – CS. Quando o valor de pH da suspensão de nanopartículas de HMSS – N =N – CS foi ajustado para pH 3,5, o biopolímero CS tornou-se positivamente carregado (o pK _a de CS foi de 6,3) devido aos grupos amino protonados no ambiente ácido [24]. O polímero CS tornou-se carregado positivamente e inchou, levando à abertura de mesoporos de HMSS atribuídos à interação repulsiva entre as cargas CS. Assim, DOX ganhou acesso aos mesoporos de HMSS – N =N – CS por difusão. No entanto, depois que a mistura carregada com a droga foi ajustada para 7,4, as cadeias CS desprotonaram e entraram em colapso para impedir a liberação prematura de DOX.

O LE de HMSS – N =N – CS / DOX foi de 35,2%, que era muito maior do que o de outros sistemas de entrega de sílica mesoporosa carregados com DOX [3, 16]. O alto LE de DOX em nanocarreadores de HMSS foi atribuído à cavidade oca, grande área de superfície e rede mesoporosa, que poderia ser usada como reservatório de drogas. O estado físico de DOX em HMSS – N =N – CS / DOX foi avaliado por difração de raios-X de potência (XRD). Conforme mostrado nos perfis de XRD (Fig. 4), o DOX bruto exibiu picos de difração cristalina de fármaco intensos e característicos. A mistura física (PM) de HMSS – N =N – CS e DOX também mostrou picos de difração cristalinos óbvios. No entanto, nenhum pico cristalino distinto foi exibido por HMSS – N =N – CS / DOX, o que provou que o estado físico de DOX em HMSS – N =N – CS / DOX era não cristalino devido às restrições da estrutura mesoporosa de HMSS.

Liberação responsiva a enzimas in vitro em ambiente colônico simulado

Para investigar a liberação de HMSS – N =N – CS, HMSS – N =N – CS / DOX e HMSS / DOX, nanopartículas foram adicionadas a pH 7,4 PBS com diferentes concentrações de mistura de enzimas do cólon. Conforme exibido na Fig. 5a, HMSS – N =N – CS / DOX exibiu a liberação lenta de DOX em PBS em pH 7,4, e a porcentagem de liberação cumulativa foi de apenas aproximadamente 10% em 24 h, indicando uma boa capacidade de capeamento do CS polímeros e ligações azo. Como esperado, no caso da enzima diluída em PBS em pH 7,4, a liberação cumulativa de DOX foi melhorada para mais de 20% no mesmo período. Além disso, a quantidade de liberação de DOX foi dramaticamente aumentada para quase 40% na presença de enzima concentrada. Em comparação com a liberação responsiva à enzima de HMSS – N =N – CS / DOX, a liberação de DOX de HMSS / DOX teve tendências semelhantes na presença ou ausência de enzima concentrada. A porcentagem de liberação de droga relativamente baixa foi devido à interação eletrostática entre o HMSS carregado negativamente e o DOX carregado positivamente [42]. Os resultados acima provaram que a liberação de DOX de HMSS – N =N – CS / DOX foi acentuadamente acelerada por enzimas extraídas da microflora nas regiões do cólon. O mecanismo de liberação responsivo à enzima pode ser que as ligações azo em HMSS – N =N – CS são degradadas pela enzima, causando o desprendimento de CS da superfície de HMSS e a liberação rápida de HMSS. Foi relatado que ligações azo são clivadas por enzimas secretadas pela microflora colônica [34, 35].

a Perfis de liberação cumulativa de HMSS / DOX e HMSS – N =N – CS / DOX em PBS de pH 7,4 na presença de mistura concentrada e diluída de enzimas do cólon; e b Comportamentos de liberação in vitro responsivos ao pH de DOX de HMSS – N =N – CS na mídia de liberação de diferentes valores de pH

Além disso, para avaliar ainda mais a liberação responsiva à enzima de HMSS – N =N – CS / DOX no ambiente GIT mimético, as nanoplataformas HMSS – N =N – CS / DOX foram inicialmente dispersas em SGF por 2 h e, em seguida, ainda mais dispersas em SIF por 6 h e, finalmente, os transportadores foram adicionados a PBS com pH 7,4 contendo 1 mg / mL de enzima extraída. Conforme mostrado na Fig. 5b, no suco gástrico simulado, a liberação de DOX foi relativamente rápida e a quantidade cumulativa atingiu 15% em 2 h. A liberação relativamente rápida foi devido à interação mais fraca entre HMSS – N =N – CS e DOX em condições ácidas do que em condições neutras [1]. Em seguida, a liberação de DOX foi desacelerada em SIF por 2–8 h. No entanto, depois que o HMSS – N =N – CS / DOX foi incubado com enzimas extraídas em pH 7,4 PBS, a liberação de DOX continuou a aumentar acentuadamente e a quantidade de liberação cumulativa atingiu mais de 50% em 24 h. A liberação incompleta de DOX do HMSS – N =N – CS / DOX foi devido à forte interação entre o DOX carregado positivamente e o HMSS carregado negativamente.

A adsorção de proteínas e estabilidade de HMSS – N =N – CS

Para administração oral, as propriedades de superfície dos nanocarreadores afetarão inevitavelmente os comportamentos de liberação do fármaco e a bioadsorção [43]. Um ensaio de adsorção de proteína na superfície foi usado para avaliar o efeito do CS enxertado na superfície do HMSS. Conforme exibido na Fig. 6a, os nanocarreadores de HMSS nus tiveram uma adsorção de BSA dramática de até 16,5%, que foi atribuída à grande área de superfície e cavidade oca de HMSS, forte capacidade de adsorção e interações não específicas entre grupos de silanol de HMSS e BSA [ 38, 39]. Além disso, HMSS – NH ₂ de forma semelhante, tinha uma quantidade de BSA adsorvida relativamente alta de 10,2%. No entanto, a porcentagem de BSA adsorvida na superfície diminuiu marcadamente para 2,5% após o polímero CS ser adicionado como uma cobertura, diminuindo dramaticamente o efeito no comportamento in vivo de HMSS – N =N – CS. Para observar ainda mais a estabilidade das amostras de HMSS – N =N – CS e HMSS, 20 mg de HMSS – N =N – CS e HMSS foram adicionados a PBS de pH 7,4 e água desionizada. Conforme exibido na Fig. 6b, embora HMSS – N =N – CS e HMSS fossem relativamente estáveis em água, HMSS floculou rapidamente em pH 7,4 PBS. By contrast, the dispersity of HMSS–N=N–CS was obviously enhanced after the polymer CS was grafted onto the surfaces of HMSS. Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.

a BSA adsorbance amounts of HMSS and HMSS–NH₂ and HMSS–N=N–CS (n =3, *p <0,05). b Photograph images of HMSS–N=N–CS and HMSS dispersed in water and PBS with a concentration of 4 mg/mL

Cellular Uptake

Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.

a CLSM of Caco-2 cells incubated with different samples. b The MFI of DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX treated by enzyme measured by FCM in Caco-2 cells (n =3, ***p <0,001)

In Vitro Cell Viability Evaluation

To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.

Effect of HMSS and HMSS–N=N–CS on cell proliferation of a Caco–2 cells and b NIH-3T3 cells for 48 h by MTT assay. c Cytotoxicity of free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX with enzyme against Caco-2 cells with different concentrations for 48 h

The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. O IC ₅₀ value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. O IC ₅₀ value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC₅₀ value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.

Toxicity Studies

The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.

a Gastrointestinal mucosa irritation assay after oral administration of HMSS and HMSS–N=N–CS with the dose of 50 mg/kg for 7 days. b The weight changes of mice after oral administration for a week. Data were means ± SD (n =3)

Conclusions

In summary, biodegradable CS was attached through azo bonds to gate the openings of HMSS to achieve enzyme-responsive colon-specific drug delivery. DOX was loaded in the hollow cavity and mesopores of HMSS in a noncrystalline state with a high loading efficiency of 35.2%. Stability and BSA adsorption results illustrated that the CS gates could increase the biocompatibility and stability of HMSS. In vitro release results proved that HMSS–N=N–CS/DOX exhibited enzyme-responsive drug release behavior in the presence of colonic enzymes. CLSM uptake and FCM results indicated that the cellular uptake of DOX was obviously increased after HMSS–N=N–CS/DOX was incubated with the colonic enzyme mixture. Cell viability results indicated that HMSS–N=N–CS/DOX incubated with colonic enzymes showed increased cytotoxicity, and the IC₅₀ value obviously decreased from 32.22 μg/mL for HMSS–N=N–CS/DOX to 9.41 μg/mL upon incubation.