Nanoplataformas de Sílica Mesoporosa Oca com Capa de Quitosana Sensíveis a Enzimas para Liberação de Fármacos Direcionada ao Cólon

Materiais e Métodos

Materiais

Tetraetoxissilano (TEOS); cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC); quitosana (DAc ≥ 95%); brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB); 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES); 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT); ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico; brometo de potássio (pureza espectral, ≥ 99,5%); N-hidroxisuccinimida (NHS) e DOX foram adquiridos da Aladdin Chemical Inc. (Xangai, China). O ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico foi fornecido pela Inno-chem Technology Co. Ltd. (Pequim, China). Meios de cultura celular DMEM, penicilina-estreptomicina e soro fetal bovino (FBS) foram fornecidos pela GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, EUA). Todos os reagentes analíticos foram utilizados sem purificação adicional.

Preparação das HMSS–N=N–CS

Preparação das HMSS–NH₂

As nanopartículas de HMSS foram preparadas com base em trabalho publicado usando método de gravação seletiva. Primeiro, esferas de sílica sólida foram sintetizadas por um método Stober modificado. Brevemente, 6 mL de TEOS foram adicionados a uma mistura de 10 mL de água deionizada, 74 mL de etanol e 3 mL de NH₃·H₂O concentrado. A mistura foi agitada por 60 min para obter suspensões coloidais de sílica à temperatura ambiente. As esferas sólidas foram centrifugadas, lavadas e secas para uso posterior. Em seguida, a casca de sílica mesoporosa foi depositada sobre as esferas de sílica sólida. Trezentos miligramas de sílica sólida foram dispersos em 50 mL de água deionizada por ultrassom por 45 min. A suspensão de sílica foi adicionada a uma mistura de 60 mL de etanol, 450 mg de CTAB, 90 mL de água e 1,7 mL de NH₃·H₂O. Após agitação por 60 min, TEOS (0,75 mL) foi adicionado. Subsequentemente, as nanopartículas foram centrifugadas após agitação por 6 h para coletar as amostras e depois redispersas em 40 mL de água. Cerca de 1,2 g de Na₂CO₃ foi adicionado à suspensão aquosa com agitação vigorosa. Após a mistura ser mantida a 55 °C por 12 h, os produtos de nanopartículas de HMSS foram coletados e lavados com etanol anidro. O método de pós-grafting com razão HMSS/APTES de 4:1 (m/v) foi usado para preparar HMSS–NH₂ a 80 °C sob N₂ por 8 h, e o CTAB foi removido por refluxo.

Preparação das HMSS–N=N–COOH

O ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico (50 mg) foi adicionado em PBS pH 5,8. Em seguida, EDC (5 mg/mL) e NHS (3 mg/mL) foram adicionados para ativar o ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico a 30 °C por 1 h. Então, 10 mL de PBS contendo 15 mg/mL de HMSS–NH₂ foram adicionados e a mistura foi agitada por 24 h. O resultado HMSS–N=N–COOH foi separado por centrifugação e lavado com etanol.

Preparação das HMSS–N=N–CS

0,15 g de CS e 0,5 mL de ácido acético foram adicionados em 50 mL de água para preparar solução de CS. E 100 mg de HMSS–N=N–COOH foram dispersos em 25 mL de PBS pH 5,0 e ativados por EDC e NHS por 0,5 h. Em seguida, a solução de CS (10 mL) foi adicionada à suspensão com agitação contínua por 1 dia. Finalmente, as HMSS–N=N–CS sintetizadas foram centrifugadas e lavadas para coletar as amostras.

Extração da Mistura Enzimática Colônica da Microflora

A microflora colônica foi coletada segundo trabalho publicado. Em seguida, a cultura foi inoculada para obter a mistura enzimática secretada pela microflora colônica a 37 °C. O meio colônico simulado contendo a mistura enzimática foi filtrado através de filtro de 0,22 µm para remover todos os detritos celulares do fluido de cultura. Subsequentemente, o filtrado foi liofilizado para obter a mistura enzimática em forma de pó, que foi usada no estudo posterior.

Processo de Carregamento do Fármaco e Liberação Responsiva a Enzimas

Vinte e cinco miligramas de DOX foram dissolvidos em 5 mL de solução de HCl pH 3,5. E 100 mg de HMSS–N=N–CS foram adicionados à solução de DOX e agitados à temperatura ambiente por 12 h. Subsequentemente, solução de NaOH 0,2 M foi usada para ajustar o pH da mistura para 7,0, e a suspensão foi agitada por mais 12 h. Então, as HMSS–N=N–CS carregadas com DOX (referidas como HMSS–N=N–CS/DOX) foram centrifugadas e lavadas para remover a DOX adsorvida na superfície. O sobrenadante foi coletado em cada etapa para medir a eficiência de carregamento (LE) de DOX a 480 nm por espectrofotometria UV-Vis. A massa total de DOX carregada nas HMSS–N=N–CS foi calculada subtraindo a DOX não carregada após os processos de carregamento da massa inicial de DOX adicionada. As HMSS/DOX foram preparadas como controle usando HMSS como carreador inicial. A LE de DOX foi calculada segundo a equação:

LE (%) = (m_A - m_B) / (m_A - m_B + m_C) × 100

Onde m_A foi a massa adicionada de DOX, m_B a massa de DOX no sobrenadante, e m_C a massa total de HMSS–N=N–CS.

A liberação in vitro responsiva a enzimas de DOX das HMSS–N=N–CS/DOX foi avaliada da seguinte forma. Dois miligramas de HMSS–N=N–CS/DOX e nanopartículas HMSS/DOX foram dispersos em PBS pH 7,4 sob agitação a 125 rpm com diferentes concentrações de mistura enzimática colônica (0 mg/mL, 0,3 mg/mL e 1 mg/mL). Em intervalos de tempo específicos, 1 mL do meio de liberação foi retirado para medir a absorbância. A liberação de DOX foi medida a 480 nm. HMSS/DOX foi usado como controle.

Adsorção de BSA

A quantidade de adsorção de BSA foi avaliada baseada em trabalhos publicados. BSA foi adicionado em PBS pH 7,4 (0,5 mg/mL). Cinco miligramas de HMSS, HMSS–NH₂ e HMSS–N=N–CS foram adicionados em 2,5 mL de PBS (pH 7,4). Volume igual de solução de BSA foi fornecido, e a suspensão foi colocada em agitador a 100 rpm. Após 6 h, centrifugação foi usada para coletar a solução superior. Por fim, a concentração de BSA foi medida a 595 nm após coloração com solução de azul de Coomassie brilhante.

Caracterização

A estrutura da rede mesoporosa e a morfologia das nanopartículas de HMSS foram avaliadas por imagens de TEM (EM–208S, CSIS, EUA). A área superficial e a distribuição do tamanho dos poros foram caracterizadas usando analisador de adsorção de nitrogênio (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China). Os potenciais ξ e tamanhos de partícula foram caracterizados em um Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Reino Unido). Análise TGA foi medida em equipamento TGA-50 (Shimadzu, Kyoto, Japão) com taxa de aquecimento de 10 °C/min sob fluxo de nitrogênio. Espectros de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) foram medidos usando espectrômetro FT-IR (Bruker Tensor27, Suíça). A faixa foi realizada de 400 a 4000 cm⁻¹ usando técnica de pastilha de KBr. XRD de pó foi realizado em um difratômetro de raios X Siemens D5005 (Karlsruhe, Alemanha) com radiação Cu-Kα (λ = 1,5418 Å).

Cultura Celular e Experimento de Captação Celular

Células Caco-2 foram cultivadas em meio suplementado com 10% FBS, 1% aminoácidos não essenciais, 1% (v/v) piruvato de sódio e 1% estreptomicina. Células NIH-3T3 foram cultivadas em DMEM com 1% estreptomicina e 10% FBS. A captação dos nanocarreadores por células Caco-2 foi caracterizada usando FCM e CLSM. Células Caco-2 foram semeadas em placas de 24 poços. Após cultivo durante a noite, DOX livre, HMSS–N=N–CS/DOX e HMSS–N=N–CS/DOX pré-incubadas com nanopartículas de enzima colônica (equivalente à concentração de 5 µg/mL DOX) foram adicionados aos poços correspondentes. Após incubação contínua por 2 h, o meio celular foi removido e lavado minuciosamente com PBS. Em seguida, as células foram fixadas com formaldeído a 4% e coradas com Hoechst 33258 para observação por CLSM. FCM foi usado para obter avaliação quantitativa da captação celular. Células Caco-2 foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas por 24 h. Após lavagem com PBS, as células Caco-2 foram incubadas com DOX livre, HMSS–N=N–CS/DOX e HMSS–N=N–CS/DOX pré-incubadas com nanopartículas de enzima colônica (equivalente à concentração de 5 µg/mL DOX) em DMEM livre de soro por 2 h. Então, as células Caco-2 foram enxaguadas com PBS frio, tripsinizadas e ressuspensas em 0,5 mL PBS. A fluorescência de DOX nas células foi medida usando citômetro de fluxo FACS Canto (Becton, Dickinson, EUA).

Ensaio de Proliferação Celular In Vitro

A citotoxicidade dos carreadores vazios HMSS e HMSS–N=N–CS para células NIH-3T3 e Caco-2 foi testada pelo ensaio MTT. Brevemente, células Caco-2 e NIH-3T3 foram semeadas separadamente em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. O meio celular antigo foi substituído por meio livre de soro contendo diferentes concentrações de nanopartículas. Após incubação por 2 dias, 50 µL de solução de MTT (2 mg/mL) foi adicionado e incubado por 4 h para medir células vivas. Então, a solução de MTT foi removida, e 150 µL de DMSO foi adicionado para dissolver o formazano. Subsequentemente, a absorbância foi medida em leitor de microplacas (Tecan, Männedorf, Suíça) a 570 nm. A citotoxicidade de DOX livre, HMSS–N=N–CS/DOX e HMSS–N=N–CS/DOX pré-incubadas com misturas enzimáticas extraídas da microflora colônica foi medida usando células Caco-2 com concentrações correspondentes de DOX de (0,1, 1, 5, 10 e 20 µg/mL). O tempo de incubação foi 48 h, e os demais processos experimentais foram os mesmos descritos acima.

Estudos de Toxicidade

Testes de irritação da mucosa gastrointestinal são vitais para avaliar a biossegurança in vivo de sistemas de liberação oral. Ratos Sprague-Dawley machos (180 ± 10 g) foram divididos aleatoriamente em três grupos (três ratos por grupo). Ratos foram administrados com soro fisiológico, HMSS e nanopartículas HMSS–N=N–CS com dose de 100 mg/kg por dia. Após 7 dias, todos os ratos foram sacrificados, e os tecidos foram coletados e examinados por exame histopatológico (H&E). Para avaliar a biosegurança das nanopartículas HMSS e HMSS–N=N–CS, os pesos corporais de camundongos BALB/c (18–20 g) foram registrados após administração oral a dose de 100 mg/kg a cada dois dias. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade Médica de Qiqihar e aprovados pelo Comitê de Ética da mesma universidade.

Estatística

Dados estatísticos foram analisados com software SPSS usando teste t de Student bicaudal. Barras de erro apresentadas neste estudo são DP. Um valor p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados e Discussão

Preparação e Caracterização das HMSS–N=N–CS

As HMSS foram preparadas baseadas em trabalhos anteriores com pequenas alterações. Primeiro, nanoesferas de SiO₂ sólidas foram preparadas, e uma casca mesoporosa foi depositada na superfície das nanoesferas de sílica sólida contendo o modelo CTAB. Em seguida, Na₂CO₃ foi usado para gravar seletivamente as nanoesferas de SiO₂ sólidas enquanto a casca mesoporosa era protegida pelo modelo CTAB. A preparação das HMSS–N=N–CS com CS ligada como "gatekeeper" por uma ligação azo é descrita na Fig. 1a. Primeiro, as superfícies das nanopartículas de HMSS foram modificadas com APTES como reagente de acoplamento alquílico para tornarse HMSS amino-funcionalizadas (HMSS–NH₂) por um método de pós-modificação. Subsequentemente, HMSS–N=N–COOH foi preparado por uma reação de amidation entre os grupos amino das HMSS–NH₂ e os grupos carboxila do ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico. Então, o polímero CS foi covalentemente modificado na superfície das nanopartículas de HMSS por uma reação de amidation entre os grupos carboxila das HMSS–N=N–COOH e os grupos amino na CS.

Como mostrado na imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) na Fig. 1a, o diâmetro médio das HMSS foi 280 nm, e as HMSS apresentavam estrutura oca uniforme e casca mesoporosa altamente ordenada. A espessura média da casca mesoporosa foi de aproximadamente 90 nm. Comparada à superfície lisa das HMSS, a superfície do polímero enxertado HMSS–N=N–CS (Fig. 1b) era rugosa, indicando que a CS cobria o carreador HMSS.

As áreas superficiais e distribuições de poros de materiais mesoporosos desempenham papel crucial no carregamento e entrega de moléculas hospedeiras para liberação controlada. Curvas de distribuição do tamanho dos poros e isotermas foram medidas por análise de adsorção e dessorção de N₂ (Fig. 2). Parâmetros detalhados (área superficial BET (S_BET), volume total de poros (V_P) e distribuição do tamanho dos poros (D_P)) são mostrados na Tabela 1. O S_BET e V_P das HMSS puras foram 810,7 m²/g e 0,969 cm³/g, respectivamente, e o D_P foi aproximadamente 3,8 nm. O D_P das HMSS–NH₂ foi quase o mesmo que o das HMSS após aminação, indicando que os mesoporos não foram bloqueados após a funcionalização amino. O S_BET e V_P das HMSS–N=N–CS diminuíram marcadamente após modificação pelo composto azo e revestimento de CS, indicando que a CS cobriu a superfície das HMSS.

A enxertia bem-sucedida das HMSS–N=N–CS foi verificada por vários métodos. O potencial ξ das HMSS–NH₂ sofreu grande mudança após funcionalização, variando de −27,9 a +31,4 mV, como mostrado na Fig. 3a, o que foi atribuído à adição de grupos amino na superfície das HMSS. Após as HMSS–NH₂ reagirem com ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico para formar HMSS–N=N–COOH, o potencial ξ diminuiu para −2,0 mV devido aos grupos carboxila na superfície das HMSS. Após o polímero CS ser enxertado na superfície das HMSS para formar HMSS–N=N–CS, o potencial ξ voltou a +32,4 mV. O resultado foi atribuído ao revestimento de CS abundantemente amino e positivamente carregado na superfície das HMSS. Curvas de análise termogravimétrica (TGA) de HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH e HMSS–N=N–CS são mostradas na Fig. 3b. Comparadas com HMSS–N=N–COOH, as HMSS–N=N–CS perderam peso adicional de aproximadamente 19%, devido à remoção das cadeias de CS. A enxertia de ligações azo na superfície das HMSS também foi confirmada por mudança de cor durante a preparação das HMSS–N=N–COOH, como mostrado no inseto da Fig. 3b. O reagente HMSS–NH₂ é branco, enquanto o produto HMSS–N=N–COOH ficou amarelado-marrom após o ácido azobenzeno-3,3′-dicarboxílico reagir com os grupos amino das HMSS. O diâmetro hidrodinâmico (D_H) e valores do índice de polidispersidade (PDI) de HMSS, HMSS–NH₂ e HMSS–N=N–CS foram determinados em água destilada, como mostrado na Fig. 3c. As HMSS tiveram diâmetro de 309 nm e PDI de 0,190. Após a adição de grupos amino nas superfícies das HMSS para formar HMSS–NH₂, o D_H aumentou para 324 nm. O diâmetro das HMSS–N=N–CS foi 342 nm, maior que o das HMSS–NH₂ devido às cadeias de CS enxertadas. O PDI das HMSS–N=N–CS (0,177) foi menor que o das HMSS–NH₂, indicando que os tamanhos médios de partícula tornaram-se mais uniformes após a enxertia de CS. Comparados com os diâmetros obtidos por TEM, os diâmetros de HMSS e HMSS–N=N–CS medidos por DLS foram maiores. O D_H das nanopartículas foi medido em ambiente aquoso com camada de hidratação, enquanto o tamanho das nanopartículas fornecido por TEM foi obtido de nanopartículas secas. Espectros de FT-IR de HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS e CS são mostrados na Fig. 4d. Comparados com os picos para HMSS–NH₂, um aumento nos picos de adsorção a 2853 e 2925 cm⁻¹ foi atribuído à vibração de −CH₂ na enxertia de ligações azo carboxi-terminais. Após a CS ser adicionada à superfície das HMSS–N=N–COOH, houve aumentos nos picos de adsorção a 1660 cm⁻¹ e 3435 cm⁻¹, atribuídos a υ_(C=O) na banda de amida e vibração de N–H na CS. Todos os resultados provaram a preparação bem-sucedida das HMSS–N=N–CS.

Estado do Fármaco e Eficiência de Carregamento

A DOX foi escolhida para investigar os comportamentos de carregamento e liberação das HMSS–N=N–CS. Quando o pH da suspensão de nanopartículas HMSS–N=N–CS foi ajustado para 3,5, o biopolímero CS tornou-se positivamente carregado (o pK_a da CS é 6,3) devido aos grupos amino protonados no ambiente ácido. O polímero CS tornou-se positivamente carregado e inchou, levando à abertura dos mesoporos das HMSS–N=N–CS atribuída à interação repulsiva entre cargas da CS. Assim, a DOX teve acesso aos mesoporos das HMSS–N=N–CS por difusão. No entanto, após a mistura carregada com fármaco ser ajustada para 7,4, as cadeias de CS desprotonaram e colapsaram para impedir a liberação prematura de DOX.

A LE das HMSS–N=N–CS/DOX foi 35,2%, muito maior que a de outros sistemas de liberação de DOX baseados em sílica mesoporosa. A alta LE de DOX nos nanocarreadores HMSS foi atribuída à cavidade oca, grande área superficial e rede mesoporosa, que poderiam ser usadas como reservatório de fármaco. O estado físico da DOX nas HMSS–N=N–CS/DOX foi avaliado por difração de raios X de pó (XRD). Como mostrado nos perfis de XRD (Fig. 4), a DOX bruta exibiu picos de difração cristalinos característicos e intensos. A mistura física (PM) de HMSS–N=N–CS e DOX também mostrou picos de difração cristalinos óbvios. No entanto, nenhum pico cristalino distinto foi exibido pelas HMSS–N=N–CS/DOX, o que provou que o estado físico da DOX nas HMSS–N=N–CS/DOX era não cristalino devido às restrições da estrutura mesoporosa das HMSS.

Liberação In Vitro Responsiva a Enzimas em Ambiente Colônico Simulado

Para investigar a liberação responsiva a enzimas das HMSS–N=N–CS, nanopartículas HMSS–N=N–CS/DOX e HMSS/DOX foram adicionadas a PBS pH 7,4 com diferentes concentrações de mistura enzimática colônica. Como mostrado na Fig. 5a, as HMSS–N=N–CS/DOX exibiram liberação lenta de DOX em PBS a pH 7,4, e a porcentagem de liberação cumulativa foi apenas aproximadamente 10% em 24 h, indicando boa capacidade de tamponamento dos polímeros CS e ligações azo. Como esperado, no caso de enzima diluída em PBS a pH 7,4, a liberação cumulativa de DOX melhorou para mais de 20% no mesmo período. Além disso, a quantidade de liberação de DOX aumentou dramaticamente para quase 40% na presença de enzima concentrada. Comparada com a liberação responsiva a enzimas das HMSS–N=N–CS/DOX, a liberação de DOX das HMSS/DOX teve tendências semelhantes na presença ou ausência de enzima concentrada. A porcentagem de liberação de fármaco relativamente baixa foi devida à interação eletrostática entre as HMSS carregadas negativamente e a DOX carregada positivamente. Os resultados acima provaram que a liberação de DOX das HMSS–N=N–CS/DOX foi marcadamente acelerada por enzimas extraídas da microflora em regiões colônicas. O mecanismo de liberação responsiva a enzimas poderia ser que as ligações azo nas HMSS–N=N–CS são degradadas pela enzima, causando a desprendimento da CS da superfície das HMSS e a liberação rápida das HMSS. Ligações azo têm sido relatadas como clivadas por enzimas secretadas pela microflora colônica.

Adicionalmente, para avaliar ainda mais a liberação responsiva a enzimas das HMSS–N=N–CS/DOX em ambiente GI mimetizado, as nanoplataformas HMSS–N=N–CS/DOX foram inicialmente dispersas em SGF por 2 h e depois dispersas em SIF por 6 h, e finalmente os carreadores foram adicionados a PBS pH 7,4 contendo 1 mg/mL de enzima extraída. Como mostrado na Fig. 5b, em suco gástrico simulado, a liberação de DOX foi relativamente rápida, e a quantidade cumulativa atingiu 15% em 2 h. A liberação relativamente rápida foi devida à interação mais fraca entre HMSS–N=N–CS e DOX sob condições ácidas que sob condições neutras. Em seguida, a liberação de DOX foi desacelerada em SIF por 2–8 h. No entanto, após as HMSS–N=N–CS/DOX serem incubadas com enzimas extraídas em PBS pH 7,4, a liberação de DOX continuou a aumentar marcadamente, e a quantidade de liberação cumulativa atingiu mais de 50% em 24 h. A liberação incompleta de DOX das HMSS–N=N–CS/DOX foi devida à forte interação entre a DOX positivamente carregada e as HMSS negativamente carregadas.

Adsorção de Proteína e Estabilidade das HMSS–N=N–CS

Para administração oral, as propriedades de superfície dos nanocarreadores afetarão inevitavelmente os comportamentos de liberação de fármaco e bioadsorção. Um ensaio de adsorção de proteína na superfície foi usado para avaliar o efeito da CS enxertada na superfície das HMSS. Como mostrado na Fig. 6a, nanocarreadores HMSS nus tiveram adsorção dramática de BSA de até 16,5%, atribuída à grande área superficial e cavidade oca das HMSS, forte capacidade de adsorção e interações inespecíficas entre grupos silanol das HMSS e BSA. Além disso, HMSS–NH₂ também teve quantidade relativamente alta de BSA adsorvido de 10,2%. No entanto, a porcentagem de BSA adsorvido na superfície diminuiu marcadamente para 2,5% após o polímero CS ser adicionado como cobertura, diminuindo drasticamente o efeito no comportamento in vivo das HMSS–N=N–CS. Para observar ainda mais a estabilidade das amostras HMSS–N=N–CS e HMSS, 20 mg de HMSS–N=N–CS e HMSS foram adicionados a PBS pH 7,4 e água deionizada. Como mostrado na Fig. 6b, embora HMSS–N=N–CS e HMSS fossem relativamente estáveis em água, as HMSS floculavam rapidamente em PBS pH 7,4. Por outro lado, a dispersibilidade das HMSS–N=N–CS foi obviamente melhorada após o polímero CS ser enxertado nas superfícies das HMSS. Além disso, os carreadores HMSS–N=N–CS podem permanecer estáveis por mais de 12 h sem precipitação em PBS pH 7,4. Esses resultados provaram que a cobertura com o polímero CS hidrofílico pode melhorar a dispersibilidade e diminuir a adsorção de proteína na superfície das HMSS–N=N–CS.

Captação Celular

Células Caco-2, como células de adenocarcinoma colorretal epitelial humano, são amplamente usadas como células modelo em liberação oral de fármacos. Como mostrado na Fig. 7a, células Caco-2 incubadas com DOX livre mostraram sinal de fluorescência relativamente forte resultante da DOX porque a DOX positivamente carregada podia entrar na célula e depois no núcleo. Comparado com o grupo DOX livre, o grupo HMSS–N=N–CS/DOX mostrou intensidade de sinal de fluorescência mais fraca devido à liberação incompleta de fármaco das HMSS–N=N–CS/DOX. No entanto, após as HMSS–N=N–CS/DOX serem pré-incubadas com a mistura enzimática colônica por 1 h, mostraram sinal de fluorescência marcadamente aumentado. Isso foi atribuído às ligações azo serem clivadas pela mistura enzimática, o que levou à remoção da CS das superfícies das HMSS, acelerando significativamente a liberação de DOX das HMSS–N=N–CS/DOX. Para avaliar quantitativamente as diferenças de captação celular para HMSS–N=N–CS/DOX e HMSS–N=N–CS/DOX incubadas com enzimas extraídas, FCM foi usado. Como mostrado na Fig. 7b, a intensidade média de fluorescência (MFI) para o grupo HMSS–N=N–CS/DOX foi 124,7, mais fraca que a do grupo DOX livre, com valor p menor que 0,001. Animadoramente, após as HMSS–N=N–CS/DOX serem pré-incubadas com a mistura enzimática colônica por 1 h, a MFI aumentou marcadamente para 357 e até excedeu a do grupo DOX livre devido à liberação acelerada de fármaco das HMSS–N=N–CS/DOX após a quebra das ligações azo. Todos esses resultados indicaram que as ligações azo nas HMSS–N=N–CS/DOX podiam ser clivadas na presença de enzimas colônicas, o que levou à remoção da CS da superfície das HMSS e acelerou a liberação de DOX das HMSS.

Avaliação In Vitro da Viabilidade Celular

Para provar o efeito de liberação responsiva a enzimas das HMSS–N=N–CS/DOX em condições colônicas simuladas, um ensaio de viabilidade celular in vitro foi realizado usando células Caco-2. O fármaco anticancerígeno clássico DOX foi usado no ensaio de viabilidade celular. Antes deste ensaio, diferentes concentrações de HMSS e HMSS–N=N–CS vazias foram empregadas para averiguar a biocompatibilidade da nanoplataforma para células Caco-2 e NIH-3T3 normais (fibroblastos de embrião de camundongo) em várias concentrações de 10 a 250 µg/mL pelo ensaio MTT. Como mostrado na Fig. 8a, b, HMSS e HMSS–N=N–CS em diferentes concentrações mostraram citotoxicidade desprezível após incubação com células Caco-2 ou NIH-3T3, e a viabilidade das células Caco-2 foi 87,9% e 88,3% na alta concentração de 100 µg/mL, respectivamente, o que é suficientemente alto para aplicações clínicas devido ao alto carregamento de fármaco das HMSS. Além disso, células NIH-3T3 incubadas com HMSS e HMSS–N=N–CS por 48 h tiveram alta viabilidade celular (acima de 80%) na concentração relativamente alta de 100 µg/mL. Esses resultados indicaram que HMSS e HMSS–N=N–CS são citocompatíveis e poderiam ser empregados para liberação oral.

O efeito do nanocarreador carregado com DOX HMSS–N=N–CS/DOX na viabilidade de células Caco-2 é mostrado na Fig. 8c. DOX livre mostrou citotoxicidade forte e dependente de concentração para células 4T1, atribuída ao fato de que a DOX livre positivamente carregada podia atravessar facilmente as membranas das células 4T1. O valor de IC₅₀ para o grupo DOX livre foi determinado como 10,18 µg/mL usando o software SPSS Statistics. Comparado com DOX livre, HMSS–N=N–CS/DOX exibiu maior viabilidade celular na mesma concentração de DOX devido à liberação incompleta de DOX das HMSS–N=N–CS induzida pelas fortes interações eletrostáticas entre carreadores HMSS carregados negativamente e DOX carregada positivamente. O valor de IC₅₀ para o grupo HMSS–N=N–CS/DOX foi 32,22 µg/mL, muito maior que o de DOX livre. No entanto, HMSS–N=N–CS/DOX pré-incubada com enzimas colônicas concentradas mostrou citotoxicidade dependente de concentração óbvia, e o valor de IC₅₀ foi calculado como 9,41 µg/mL, muito menor que o de HMSS–N=N–CS/DOX. Essa razão pode ser atribuída às enzimas colônicas degradarem as ligações azo nas HMSS–N=N–CS, o que levaria ao desprendimento da CS enxertada da superfície das HMSS, causando a liberação rápida de DOX dos carreadores HMSS.

Estudos de Toxicidade

Os riscos do uso de HMSS–N=N–CS são fator vital a ser considerado antes de suas aplicações clínicas no futuro. Coloração H&E de irritação da mucosa gastrointestinal é essencial para avaliar a biossegurança in vivo do sistema de liberação para administração oral (Fig. 9a). Comparado a um grupo soro fisiológico, tanto os grupos HMSS quanto HMSS–N=N–CS não exibiram alterações histopatológicas marcantes ou hiperemia após administração oral por uma semana com dose de administração de 100 mg/kg. Nenhuma morte ou comportamentos incomuns de ratos foi observada durante o processo experimental. A diminuição do peso corporal é amplamente considerada como índice importante e simples para toxicidade sistêmica in vivo. Como mostrado na Fig. 9b, os pesos corporais de camundongos nos grupos HMSS e HMSS–N=N–CS aumentaram ligeiramente e foram semelhantes aos do grupo soro fisiológico. Os resultados acima indicaram que HMSS e HMSS–N=N–CS mostraram boa biocompatibilidade como carreadores de fármacos para administração oral.

Conclusões

Em resumo, CS biodegradável foi ligada através de ligações azo para tamponar as aberturas das HMSS para alcançar liberação de fármacos direcionada ao cólon sensível a enzimas. A DOX foi carregada na cavidade oca e mesoporos das HMSS em estado não cristalino com alta eficiência de carregamento de 35,2%. Resultados de estabilidade e adsorção de BSA ilustraram que os gatekeepers de CS poderiam aumentar a biocompatibilidade e estabilidade das HMSS. Resultados de liberação in vitro provaram que HMSS–N=N–CS/DOX exibiu comportamento de liberação de fármaco responsivo a enzimas na presença de enzimas colônicas. Resultados de captação por CLSM e FCM indicaram que a captação celular de DOX aumentou obviamente após HMSS–N=N–CS/DOX ser incubada com a mistura enzimática colônica. Resultados de viabilidade celular indicaram que HMSS–N=N–CS/DOX incubada com enzimas colônicas mostrou citotoxicidade aumentada, e o valor de IC₅₀ diminuiu obviamente de 32,22 µg/mL para HMSS–N=N–CS/DOX para 9,41 µg/mL após incubação.