Nanopartículas lipídicas de PLGA rastreadas com 131I como transportadores de administração de drogas para o tratamento quimioterápico direcionado do melanoma

Resumo

Aqui, compósitos de poli (d, l-lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA) -lipídio (FA-PL) conjugados com ácido fólico (FA) foram desenvolvidos como nanotransportadores para a distribuição direcionada de paclitaxel insolúvel de droga anticâncer (PTX), nanopartículas de FA-PLP resultantes. Além disso, ¹³¹ I, como um traçador radioativo, foi usado para marcar nanopartículas de FA-PLP (FA-PLP- ¹³¹ I) avaliar sua atividade de captação celular, circulação sanguínea in vivo e biodistribuição. O FA-PLP- ¹³¹ As nanopartículas I tinham uma morfologia esférica com grande estabilidade, uma distribuição de tamanho estreita (165,6 e 181,2 nm) e -22,1 mV em potencial zeta médio. A microscopia confocal de varredura a laser indicou que a molécula-alvo FA promove PLP- ¹³¹ Captação de I pelas células B16F10 de melanoma, que foi posteriormente confirmada pela taxa de incorporação celular via ¹³¹ Detecção de atividade I medida por um contador gama. FA-PLP- ¹³¹ I sem PTX (FA-PL- ¹³¹ I) mostra citotoxicidade menor, boa biocompatibilidade, enquanto FA-PLP- ¹³¹ Foi demonstrado que eu tenho supressão de viabilidade celular eficiente em comparação com PTX e PLP livres- ¹³¹ I. Após a injeção intravenosa, a meia-vida de circulação sanguínea do PTX livre ( t _1/2 =5,4 ± 0,23 h) foi prolongado para 18,5 ± 0,5 h por FA-PLP- ¹³¹ I. Através do direcionamento de FA, a captação tumoral de FA-PLP- ¹³¹ Eu era aproximadamente 4,41 e 12,8 vezes maior em comparação com o PLP- ¹³¹ I e PTX gratuito- ¹³¹ I, respectivamente. Além disso, após 40 dias de tratamento, FA-PLP- ¹³¹ Eu mostrei um efeito de inibição tumoral melhorado em comparação com PTX e PLP- ¹³¹ livres I, sem recidiva e sem toxicidade sistêmica notável in vivo. Os resultados demonstram que o ¹³¹ Nanopartículas de lipídio PLGA marcadas com I podem ser aplicadas simultaneamente para distribuição de drogas direcionadas e rastreamento confiável de drogas in vivo.

Histórico

Um dos cânceres de pele mais agressivos, o melanoma, origina-se da transformação maligna dos melanócitos [1, 2]. Dada sua fácil recidiva e alto potencial de metástase, a sobrevida de 5 anos de pacientes com melanoma metastizado é de apenas 10%. Até o momento, o tratamento mais comum para pacientes com melanoma é a quimioterapia, que é acompanhada por efeitos colaterais graves indesejáveis, baixa biodisponibilidade, baixa seletividade do tumor e toxicidade sistêmica limitante da dose, apresentando grandes desafios na quimioterapia do tumor [3, 4].

Paclitaxel (PTX), um extrato natural de planta derivado de raízes secas, ramos, folhas e cascas de taxus, um gênero de árvores coníferas [5, 6], mostra atividade antitumoral eficaz contra vários tipos de tumores, incluindo carcinoma de ovário e pulmão câncer [7,8,9]. Além disso, a PTX também foi relatada como eficiente contra o melanoma humano [10, 11]. No entanto, além das desvantagens acima mencionadas dos medicamentos quimioterápicos, um Cremophor EL e álcool desidratado (1:1, v / v ) mistura é usada na prática clínica atual como o meio de diluição para PTX, que pode levar a efeitos colaterais graves, incluindo hipersensibilidade [12, 13]. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias para aumentar a solubilidade aquosa e o acúmulo de agentes quimioterápicos no tumor para reduzir sua exposição periférica e minimizar sua toxicidade in vivo é fundamental. O recente desenvolvimento de nanocarreadores de fármacos biocompatíveis oferece o potencial de aumentar a estabilidade fisiológica da PTX [14,15,16]. Além disso, a conjugação de moléculas-alvo a esses nanocarreadores permitiria a entrega seletiva de agentes quimioterápicos a locais de tumor com exposição periférica reduzida por meio de um efeito direcionado mediado por receptor de superfície de célula tumoral [17,18,19].

Aqui, preparamos um composto de poli (d, l-lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA) -lipídio que conjuga covalentemente ácido fólico (FA:uma molécula de direcionamento de tumor) e encapsula PTX como um medicamento quimioterápico para tratamento de melanoma. Além disso, ¹³¹ I, um marcador radioativo, foi usado para marcar radioactivamente as nanopartículas de lípidos PLGA para avaliar claramente o seu comportamento in vivo. Por causa de sua emissão beta negativa, meia-vida física e ampla gama de propriedades de decaimento, ¹³¹ I é comumente usado como um radiomarcador na clínica [20,21,22]. A morfologia, estabilidade e dispersidade do ¹³¹ Nanopartículas de lipídio PLGA marcadas com I (FA-PLP- ¹³¹ I) foram avaliados in vitro. Além disso, a captação celular, circulação sanguínea e biodistribuição de FA-PLP- ¹³¹ Fui investigado medindo a radioatividade de ¹³¹ I. Além disso, a eficácia anticâncer direcionada de FA-PLP- ¹³¹ Fui estudado in vitro e in vivo. Os resultados indicam que FA-PLP- ¹³¹ I pode ser uma nanoplataforma versátil para uso como um nanocarreador de entrega de droga tumoral potencial para drogas quimioterápicas.

Métodos

Materiais

Poli (d, l-lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA, MW:5000–15.000, lactídeo:glicolídeo (50:50)) e cloramina-T foram adquiridos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Na ¹³¹ Fui obtido na Atomic Hitech (Pequim, China). PTX (99%) e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foram adquiridos de Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Lecitina de soja consistindo em 90-95% de fosfatidilcolina, 1,2-distearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina- N - [folato (polietilenoglicol) -2000] (DSPE-PEG ₂₀₀₀ -FA), e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- N - [carboxi (polietilenoglicol) -2000] (DSPE-PEG ₂₀₀₀ -COOH) foram obtidos da Avanti (Alabaster, AL, EUA). Todos os reagentes de cultura de células foram adquiridos da Sigma Aldrich.

Preparação de nanopartículas de FA-PLP

Nanopartículas de FA-PLP foram sintetizadas por um método de nanoprecipitação de automontagem [23]. Em detalhe, 10 mg de PTX foram dissolvidos em 1 mL de etanol e 2 mg de PLGA foram dissolvidos em 1 mL de diclorometano. Após misturá-los, lecitina / DSPE-PEG ₂₀₀₀ Foi adicionada solução aquosa de etanol -FA (4:1) (4% em peso) gota a gota à solução de mistura durante 4 h com agitação suave a 25 ° C. A mistura foi filtrada e lavada três vezes com água desionizada usando um tubo de centrifugação de ultrafiltração Millipore para remover o fármaco não encapsulado e o solvente orgânico. Como um controle, nanopartículas sem enxerto de molécula de FA foram preparadas através do mesmo método, substituindo DSPE-PEG ₂₀₀₀ -FA com DSPE-PEG ₂₀₀₀ -COOH. As nanopartículas de FA-PLP purificadas foram armazenadas a 4 ° C até uso posterior.

Preparação de ¹³¹ Nanopartículas de FA-PLP marcadas com I

FA-PLP radioativo (FA-PLP- ¹³¹ I) nanopartículas foram preparadas através do método de oxidação cloramina-T [24]. Uma mistura de 1 mL FA-PLP (1 mg / mL), 500 μCi Na ¹³¹ I (que é a radioatividade máxima que pode ser enxertada em FA-PLP) e 100 μL de 5 mg / mL de cloramina-T reagiram em um tampão de fosfato de pH 7,5 por 10 min em temperatura ambiente. A reação foi então extinta pela adição de 200 μL de metabissulfito de sódio (5 mg / mL). ¹³¹ PLP e PTX marcados com I foram preparados seguindo o mesmo procedimento. Eles foram purificados usando um tubo de centrífuga (Millipore) para remover o Na ¹³¹ livre restante I até que nenhuma atividade gama fosse detectável na solução de filtrado. O rendimento da radiomarcação e a pureza das nanopartículas marcadas foram analisados ​​usando um contador gama (LKB gama 1261; LKB Instruments).

Caracterização

Os espectros de absorção de UV-vis foram registrados usando um espectrofotômetro de UV-vis (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram coletadas em um Zeiss LIBRA 120 TEM. O tamanho, potencial zeta e índice de polidispersidade (PDI) das nanopartículas foram detectados por análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). As fotografias ópticas foram tiradas com uma câmera digital Nikon D3200.

Cultura de células

A linha celular de melanoma de camundongo B16F10 foi obtida do Cell Bank da Type Culture Collection da Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) e cultivada em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino e 100 U / mL de penicilina / estreptomicina em um umidificado 5% CO ₂ atmosfera a 37 ° C.

Ensaios de incorporação in vitro

Ensaios de incorporação in vitro dependentes do tempo foram realizados para determinar os tempos de eficiência de ligação celular ideais para o ¹³¹ Compostos marcados com I [25]. As células B16F10 foram semeadas em placas de 24 poços a 1 × 10 ⁵ células por poço e cultivadas até a confluência. Amostras radioiodadas ( ¹³¹ I, PL- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I, FA-PLP- ¹³¹ I) foram preparados em meio DMEM e adicionados aos poços de cultura de células, separadamente. Após 0,5, 1, 2, 4 e 6 h de incubação, as células foram lavadas com PBS três vezes e sua radioatividade medida com um contador gama (Instituto de Ciência e Tecnologia da China, Jia Branch Innovation Co., Ltd.). Os valores de incorporação (%) foram calculados conforme descrito na literatura anterior [25]. Além disso, as nanopartículas foram marcadas com o corante fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC, Sigma) e depois incubadas com células B16F10. As imagens de fluorescência das células foram capturadas usando um microscópio de varredura a laser confocal comercial (FV1200, Olympus, Tóquio, Japão).

Ensaio de citotoxicidade in vitro

O ensaio de viabilidade celular MTT foi usado para estudar a citotoxicidade de PL- ¹³¹ I e FA-PL- ¹³¹ I, assim como o de PTX grátis, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I, contra células B16F10. Resumidamente, as células B16F10 foram semeadas em placas de 96 poços por 24 h e expostas a PL- ¹³¹ I e FA-PL- ¹³¹ I (com 0-100 μg / mL PLGA-lipídio), ou PTX livre, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I (em várias concentrações de 0–40 μg / mL) por 24 h. A experiência foi realizada em triplicado. Todos os dados foram expressos como média ± DP.

Modelo Animal

Ratinhos Balb / c com três a 5 semanas de idade foram adquiridos a Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Fudan, que está em conformidade com o Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

Células B16F10 (1 × 10 ⁶ ) em PBS foram injetados por via subcutânea no flanco direito dos camundongos. O volume crescente do tumor foi medido usando um paquímetro, e o volume do tumor foi calculado usando a fórmula:volume =(comprimento × largura ² ) / 2. Quando o volume do tumor atingiu aproximadamente 80 mm ³ , os ratos foram distribuídos aleatoriamente em grupos experimentais.

Estudo sobre Circulação Sanguínea e Biodistribuição

Camundongos Balb / c saudáveis ​​foram injetados por via intravenosa com PTX- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I (100 μL de 10 μCi por camundongo, 5 mg / kg). A circulação sanguínea foi medida retirando aproximadamente 10 μL de sangue da cauda dos camundongos. A radioatividade no sangue foi medida usando um contador gama. A fim de detectar a biodistribuição das nanopartículas, camundongos portadores de um tumor B16F10 foram injetados com PTX- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I na mesma dose e sacrificado 24 horas após a injeção. Os principais órgãos foram pesados ​​e coletados para contagem gama.

Quimioterapia de tumor in vivo

Camundongos Balb / c com tumores B16F10 foram injetados com 150 μL de solução salina, PTX livre, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I (na mesma concentração de PTX, 5 mg / kg). O tamanho do tumor e o peso corporal foram medidos por um calibrador a cada 4 dias. Os volumes relativos do tumor foram calculados como V / V ₀ ( V ₀ era o volume do tumor quando o tratamento foi iniciado). Após aproximadamente 40 dias de tratamento, os camundongos foram sacrificados e os principais órgãos coletados, fixados em formalina 4%, embebidos em parafina e fatiados, corados com hematoxilina e eosina e examinados em microscópio digital.

Resultados e discussão

Preparação e caracterização de ¹³¹ Nanopartículas de FA-PLP marcadas com I

O esquema de síntese de FA-PLP- ¹³¹ As nanopartículas I são mostradas na Fig. 1. Em resumo, as nanopartículas de FA-PLP foram sintetizadas através de um método de nanoprecipitação de automontagem e FA-PLP radioativo (FA-PLP- ¹³¹ I) foi preparado usando o método de oxidação cloramina-T [23, 24]. PTX foi encapsulado pelo composto PLGA-lipídio, que foi então enxertado com FA conjugado covalente na superfície da casca por meio de PEGuilação. Finalmente, ¹³¹ Fui enxertado na superfície externa das nanopartículas. Imagens TEM indicaram que o FA-PLP- ¹³¹ As nanopartículas I tinham uma morfologia esférica de distribuição de tamanho estreita (165,6 a 181,2 nm), que foi confirmada por espalhamento de luz dinâmico (Fig. 2a, b). O potencial zeta variou de −39,1 a −3,2 mV (Fig. 2c). Os espectros de UV-vis de PTX e FA-PLP- ¹³¹ livres I (com a mesma concentração de PTX) mostrou o mesmo pico de característica em 233 nm (Fig. 2d), indicando que PTX havia sido encapsulado em FA-PLP- ¹³¹ I e que o encapsulamento não influenciou a intensidade de absorbância da PTX. Após o cálculo, a eficiência de encapsulamento de PTX em FA-PLP- ¹³¹ Foi demonstrado que eu era 56,35 ± 1,6%. O rendimento da radiomarcação de PTX- ¹³¹ I, PL- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I foi de 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5 e 54,8 ± 2,7, respectivamente.

Síntese de FA-PLP- ¹³¹ I nanopartículas

a Imagem TEM de FA-PLP- ¹³¹ I. b Tamanho de partícula e c potencial zeta de FA-PLP- ¹³¹ Eu analisei por espalhamento de luz dinâmico. d Espectro de absorção de PTX livre e FA-PLP- ¹³¹ eu

A estabilidade é essencial para a aplicação biomédica de nanopartículas [26]. Após 4 semanas de armazenamento, FA-PLP- ¹³¹ Eu dissolvido em água, mídia celular, soro fetal bovino e PBS não exibiu alterações no tamanho médio, potencial zeta, índice PDI (Fig. 3a-c), indicando grande estabilidade e dispersidade. Além disso, a estabilidade de radiomarcação de FA-PLP- ¹³¹ I foi detectado em plasma de camundongo a 37 ° C (Fig. 3d), mostrando menos de 15% de desiodação em 7 dias.

a , b Estabilidade colóide e c Teste PDI de FA-PLP- ¹³¹ I em diferentes meios, incluindo água, DMEM, PBS e soro fetal bovino (FBS). d Curva de estabilidade de radiomarcação de FA-PLP- ¹³¹ I em plasma de camundongo a 37 ° C em 2 semanas de armazenamento

Captação celular in vitro

A Figura 4 mostra a incorporação in vitro dependente do tempo de ¹³¹ I, PL- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I em células B16F10 medido por um contador gama. FA-PLP- ¹³¹ I, bem como FA-PL- ¹³¹ I, apresentou os maiores valores de incorporação do que todos os pontos de tempo testados, aumentando com o tempo. Os valores de incorporação de FA-PLP- ¹³¹ I às 6 horas era 3,12 e 23,4 vezes maior do que ¹³¹ I e PLP- ¹³¹ I, de acordo com os resultados de imagens de microscopia de varredura a laser confocal de células B16F10 incubadas com FA-PLP- ¹³¹ marcado com isotiocianato de fluoresceína I e PLP- ¹³¹ I nanopartículas (arquivo adicional 1:Figura S1). Estes resultados demonstram a alta absorção celular de FA-PLP- ¹³¹ I, provavelmente devido ao efeito de direcionamento mediado por FA nas células B16F10.

Incorporação dependente do tempo de ¹³¹ I, PL- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I em células B16F10

Citotoxicidade in vitro

A citotoxicidade dos nanocarreadores de controle, PL- ¹³¹ I e FA-PL- ¹³¹ Fui testado pelo ensaio MTT. Células tratadas com PL- ¹³¹ I e FA-PL- ¹³¹ I por 24 h teve uma viabilidade semelhante ao controle (Fig. 5a), indicando uma boa biocompatibilidade. Além disso, FA-PLP- ¹³¹ Fui muito mais eficaz na supressão da proliferação de células B16F10 do que PTX e PLP livres- ¹³¹ I na mesma concentração de PTX (Fig. 5b), indicando excelente quimioterapia direcionada a células. Os resultados demonstram que FA-PLP- ¹³¹ I tem um alto efeito quimioterápico sem radiotoxicidade e citotoxicidade.

a Viabilidade celular de células B16F10 após tratamento com PL- ¹³¹ I e FA-PL- ¹³¹ I por 24 h. b Viabilidades celulares de células B16F10 após incubação com diferentes concentrações de PTX livre, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ Eu por 24 h

Estudo sobre Circulação Sanguínea e Biodistribuição

A radiomarcação foi relatada como mais confiável do que a imagem de fluorescência para o rastreamento in vivo quantitativo e preciso de nanopartículas [27, 28]. ¹³¹ Nanopartículas de FA-PLP marcadas com I foram preparadas para investigar seu comportamento in vivo, incluindo circulação sanguínea e biodistribuição, conforme medido por um contador gama. A meia-vida de circulação sanguínea do PTX livre ( t _1/2 =5,4 ± 0,23 h) foi prolongado para 18,5 ± 0,5 h por FA-PLP- ¹³¹ I (Fig. 6a) devido ao encapsulamento de nanopartículas, que foi favorável para o acúmulo de direcionamento de tumor [29,30,31]. Em seguida, a biodistribuição de PTX livre- ¹³¹ I, PLP- ¹³¹ I e FA-PLP- ¹³¹ I em camundongos com tumor B16F10 em 1 dia após a injeção foi investigado (Fig. 6b). FA-PLP- ¹³¹ I, bem como FA-PL- ¹³¹ I, exibiu um aumento óbvio de captação de tumor, que foi de 4,41 e 12,8 vezes do que o de PLP- ¹³¹ I e PTX gratuito- ¹³¹ I, respectivamente, provavelmente devido à circulação sanguínea prolongada de FA-PLP- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, e seu efeito de segmentação FA. Além disso, o fígado e o baço também exibiram uma absorção relativamente elevada devido ao seu metabolismo de nanopartículas, que eram os órgãos metabólicos normais [32, 33].

a A curva de circulação sanguínea de FA-PLP- ¹³¹ I após a injeção intravenosa. b Biodistribuição de PTX- ¹³¹ I, FA-PL- ¹³¹ I, FA-PLP- ¹³¹ I, e PLP- ¹³¹ I em camundongos com tumor B16F10

Quimioterapia de tumor in vivo

PTX gratuito-, PLP- ¹³¹ I-, e FA-PLP- ¹³¹ Os camundongos tratados com I exibiram inibição do crescimento do tumor em comparação com o grupo de controle com solução salina (Fig. 7a). No geral, FA-PLP- ¹³¹ I foi o mais eficaz na supressão do crescimento tumoral sem recidiva em comparação com todos os grupos tratados após aproximadamente 40 dias de tratamento. Estes resultados são os esperados, considerando a circulação sanguínea significativamente prolongada de FA-PLP- ¹³¹ I e, portanto, sua capacidade de promover o acúmulo direcionado ao tumor mediado por FA. Além disso, o acúmulo direcionado ao tumor também levou a uma redução na exposição periférica de PTX, minimizando assim a toxicidade sistêmica. Como esperado, ao longo do processo de tratamento completo, não houve perda perceptível no peso corporal (Fig. 7b), e os principais órgãos, incluindo o coração, fígado, baço, pulmão e rim, não mostraram lesões histológicas óbvias em qualquer grupo ( Fig. 7c).

a O volume relativo do tumor e b peso corporal de camundongos com tumor após injeção na veia da cauda com solução salina (controle), PTX livre, PLP- ¹³¹ I e FA- PLP- ¹³¹ I. b Peso corporal de camundongos com tumor após injeção na veia da cauda com solução salina (controle), PTX livre, PLP- ¹³¹ I e FA- PLP- ¹³¹ I. c As imagens representativas de coloração com hematoxilina e eosina dos principais órgãos, incluindo coração, fígado, baço, pulmão e rim. Barra de escala =100 μm

Conclusões

Em resumo, sintetizamos ¹³¹ Nanopartículas de lipídio PLGA marcadas com I como transportadores de entrega de drogas para quimioterapia direcionada ao melanoma. Medindo a radioatividade de ¹³¹ I, os comportamentos in vitro e in vivo de FA-PLP- ¹³¹ I nanopartículas foram estudadas. O FA-PLP obtido- ¹³¹ Eu mostrei grande dispersão e estabilidade coloidal e radiomarcação. Os nanocarreadores de controle, PL- ¹³¹ I e FA-PL- ¹³¹ Também mostrei boa biocompatibilidade. Após o encapsulamento de PTX, FA-PLP- ¹³¹ I foi o mais eficaz em suprimir a proliferação de células B16F10 sem citotoxicidade, atribuída ao efeito de direcionamento de FA. Além disso, FA-PLP- ¹³¹ Foi demonstrado que eu prolongava significativamente a circulação sanguínea de PTX e efetivamente se acumulava na região do tumor alvo. Assim, FA-PLP- ¹³¹ Tive uma excelente inibição do crescimento tumoral e grande biocompatibilidade in vivo. Os resultados destacam o potencial promissor deste versátil FA-PLP- ¹³¹ I nanocarriers como agentes de rastreamento de drogas confiáveis, bem como sua aplicação na terapia direcionada a tumor.

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