Nanopartículas PLGA-Lipídio Marcadas com ¹³¹I para Entrega Direcionada de Paclitaxel e Imagem em Terapia de Melanoma

Resumo

Aqui, compostos de poli(d,l-lactida-co-glicolida) (PLGA)-lipídio conjugados com ácido fólico (FA) (FA-PL) foram desenvolvidos como nanocarregadores para entrega direcionada do fármaco anti-cancerígeno insolúvel paclitaxel (PTX), resultando nanopartículas FA-PLP. Além disso, ¹³¹I, como traçador radioativo, foi usado para marcar nanopartículas FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) para avaliar sua atividade de captação celular, circulação sanguínea in vivo e biodistribuição. As nanopartículas FA-PLP-¹³¹I tiveram morfologia esférica com grande estabilidade, distribuição de tamanho estreita (165,6 e 181,2 nm) e -22,1 mV em potencial zeta médio. Microscopia confocal de varredura a laser indicou que a molécula alvo FA promove captação de PLP-¹³¹I por células de melanoma B16F10, o que foi confirmado pela taxa de incorporação celular via detecção de atividade de ¹³¹I medida por contador gama. FA-PLP-¹³¹I sem PTX (FA-PL-¹³¹I) mostra citotoxicidade menor, boa biocompatibilidade, enquanto FA-PLP-¹³¹I demonstrou supressão eficiente de viabilidade celular comparado a PTX livre e PLP-¹³¹I. Após injeção intravenosa, a meia-vida de circulação sanguínea de PTX livre (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 h) foi prolongada para 18,5 ± 0,5 h por FA-PLP-¹³¹I. Através de direcionamento por FA, a captação tumoral de FA-PLP-¹³¹I foi aproximadamente 4,41 e 12,8 vezes maior comparada à de PLP-¹³¹I e PTX livre-¹³¹I, respectivamente. Além disso, após 40 dias de tratamento, FA-PLP-¹³¹I mostrou efeito de inibição tumoral melhorado comparado a PTX livre e PLP-¹³¹I, sem recaída e sem toxicidade sistêmica in vivo notável. Os resultados demonstram que a nanopartícula PLGA-lipídio marcada com ¹³¹I pode ser aplicada simultaneamente para entrega direcionada de fármaco e rastreamento confiável de fármacos in vivo.

Introdução

Um dos cânceres de pele mais agressivos, melanoma, origina-se da transformação maligna de melanócitos. Dada sua fácil recaída e alto potencial de metástase, a sobrevivência de 5 anos de pacientes com melanoma metastático é apenas 10%. Até hoje, o tratamento mais comum para pacientes com melanoma é quimioterapia, que é acompanhada por efeitos colaterais indesejáveis graves, baixa biodisponibilidade, pobre seletividade tumoral e toxicidade sistêmica limitante de dose, apresentando grandes desafios na quimioterapia de tumores.

Paclitaxel (PTX), um extrato natural de planta derivado das raízes secas, galhos, folhas e casca de taxus, um gênero de árvores coníferas, mostra atividade antitumor efetiva contra vários tipos de tumores, incluindo carcinoma ovariano e câncer de pulmão. Adicionalmente, PTX também foi relatado como eficiente contra melanoma humano. No entanto, além dos inconvenientes mencionados de fármacos quimioterápicos, uma mistura de Cremophor EL e álcool desidratado (1:1, v/v) é usada na prática clínica atual como meio de diluição para PTX, o que pode levar a efeitos colaterais graves, incluindo hipersensibilidade. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias para aumentar a solubilidade aquosa e acúmulo tumoral de agentes quimioterápicos para reduzir sua exposição periférica e minimizar sua toxicidade in vivo é primordial. O desenvolvimento recente de nanocarregadores de fármacos biocompatíveis fornece o potencial para aumentar a estabilidade fisiológica de PTX. Adicionalmente, a conjugação de moléculas alvo a estes nanocarregadores permitiria a entrega seletiva de agentes quimioterápicos a sítios tumorais com exposição periférica reduzida através de efeito direcionado mediado por receptor de superfície de células tumorais.

Aqui, preparamos um composto de poli(d,l-lactida-co-glicolida) (PLGA)-lipídio que conjugalmente covalentemente ácido fólico (FA: uma molécula alvo de tumor) e encapsula PTX como fármaco quimioterápico para tratamento de melanoma. Além disso, ¹³¹I, um marcador radioativo, foi usado para radiomarcar as nanopartículas PLGA-lipídio para avaliar claramente seu comportamento in vivo. Devido à sua emissão beta negativa, meia-vida física e ampla gama de propriedades de decaimento, ¹³¹I é comumente usado como radiomarcador em clínica. A morfologia, estabilidade e dispersibilidade das nanopartículas PLGA-lipídio marcadas com ¹³¹I (FA-PLP-¹³¹I) foram avaliadas in vitro. Além disso, a captação celular, circulação sanguínea e biodistribuição de FA-PLP-¹³¹I foram investigadas medindo a radioatividade de ¹³¹I. Além disso, a eficácia anticancerígena direcionada de FA-PLP-¹³¹I foi estudada in vitro e in vivo. Os resultados indicam que FA-PLP-¹³¹I pode ser uma nanoplataforma versátil para uso como potencial nanocarregador de fármaco tumoral para fármacos quimioterápicos.

Métodos

Materiais

Poli(d,l-lactida-co-glicolida) (PLGA, PM: 5000-15.000, lactida:glicolida (50:50)) e cloramina-T foram comprados da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Na¹³¹I foi obtido da Atomic Hitech (Pequim, China). PTX (99%) e 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foram comprados da Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Lecitina de soja consistindo de 90-95% fosfatidilcolina, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[folato (polietileno glicol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-FA), e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carboxi (polietileno glicol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH) foram obtidos da Avanti (Alabaster, AL, EUA). Todos os reagentes de cultura celular foram comprados da Sigma Aldrich.

Preparação de Nanopartículas FA-PLP

Nanopartículas FA-PLP foram sintetizadas por um método de nanoprecipitação de auto-montagem. Em detalhes, 10 mg PTX foi dissolvido em 1 mL etanol e 2 mg PLGA foi dissolvido em 1 mL diclorometano. Após misturá-los, solução aquosa de etanol lecitina/DSPE-PEG₂₀₀₀-FA (4:1) (4% p/v) foi adicionada gota a gota na mistura por 4 h agitação suave a 25 °C. A mistura foi filtrada e lavada três vezes com água desionizada usando tubo de centrífuga de ultrafiltração Millipore para remover fármaco não encapsulado e solvente orgânico. Como controle, nanopartículas sem enxerto de molécula FA foram preparadas pelo mesmo método, substituindo DSPE-PEG₂₀₀₀-FA por DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH. As nanopartículas FA-PLP purificadas foram armazenadas a 4 °C até uso posterior.

Preparação de Nanopartículas FA-PLP Marcadas com ¹³¹I

Nanopartículas FA-PLP radioativas (FA-PLP-¹³¹I) foram preparadas através do método de oxidação por cloramina-T. Uma mistura de 1 mL FA-PLP (1 mg/mL), 500 µCi Na¹³¹I (que é a radioatividade máxima que pode ser enxertada em FA-PLP), e 100 µL de cloramina-T 5 mg/mL reagiram em tampão fosfato pH 7,5 por 10 min à temperatura ambiente. A reação foi então interrompida adicionando 200 µL de metabissulfito de sódio (5 mg/mL). ¹³¹I-marcado PLP e PTX foram preparados seguindo o mesmo procedimento. Eles foram purificados usando tubo de centrífuga (Millipore) para remover Na¹³¹I livre restante até que nenhuma atividade gama fosse detectável na solução de filtrado. O rendimento de radiomarcação e pureza das nanopartículas marcadas foram analisados usando contador gama (LKB gamma 1261; LKB Instruments).

Caracterização

Espectros de absorção UV-vis foram registrados usando espectrofotômetro UV-vis (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram coletadas em um Zeiss LIBRA 120 TEM. Tamanho, potencial zeta e índice de polidispersidade (IDP) de nanopartículas foram detectados por análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Fotografias ópticas foram tiradas com câmera digital Nikon D3200.

Cultura Celular

A linha celular de melanoma de camundongo B16F10 foi obtida do Banco de Células da Coleção de Tipo de Cultura da Academia Chinesa de Ciências (Shanghai, China) e cultivada em DMEM contendo 10% soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina em atmosfera umidificada 5% CO₂ a 37 °C.

Ensaios de Incorporação In Vitro

Ensaios de incorporação in vitro dependentes do tempo foram realizados para determinar os tempos ótimos de eficiência de ligação celular para os compostos marcados com ¹³¹I. Células B16F10 foram semeadas em placas de 24 poços a 1 × 10⁵ células por poço e cultivadas até confluência. Amostras radioiodinadas (¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I) foram preparadas em mídia DMEM e adicionadas aos poços de cultura celular, separadamente. Após 0,5, 1, 2, 4 e 6 h de incubação, as células foram lavadas com PBS três vezes e sua radioatividade medida com contador gama. Valores de incorporação (%) foram calculados como descrito na literatura prévia. Adicionalmente, nanopartículas foram marcadas com corante fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC, Sigma) e então incubadas com células B16F10. Imagens de fluorescência das células foram capturadas usando microscópio confocal de varredura a laser comercial (FV1200, Olympus, Tokyo, Japão).

Ensaio de Citotoxicidade In Vitro

O ensaio de viabilidade celular MTT foi usado para estudar a citotoxicidade dos nanocarregadores controle, PL-¹³¹I e FA-PL-¹³¹I, bem como a de PTX livre, PLP-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I, contra células B16F10. Brevemente, células B16F10 foram semeadas em placas de 96 poços por 24 h e expostas a PL-¹³¹I e FA-PL-¹³¹I (com 0-100 µg/mL PLGA-lipídio), ou PTX livre, PLP-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I (em várias concentrações de 0-40 µg/mL) por 24 h. O experimento foi realizado em triplicata. Todos os dados foram expressos como média ± DP.

Modelo Animal

Camundongos Balb/c de 3 a 5 semanas foram comprados da Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Fudan, que cumpre o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

Células B16F10 (1 × 10⁶) em PBS foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos. O volume tumoral crescente foi medido usando paquímetro, e o volume tumoral foi calculado usando a fórmula: volume = (comprimento × largura²)/2. Quando o volume tumoral atingiu aproximadamente 80 mm³, os camundongos foram randomizados nos grupos experimentais.

Estudo de Circulação Sanguínea e Biodistribuição

Camundongos Balb/c saudáveis foram injetados por via intravenosa com PTX-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I (100 µL de 10 µCi por camundongo, 5 mg/kg). Circulação sanguínea foi medida coletando aproximadamente 10 µL de sangue da cauda de camundongos. A radioatividade no sangue foi medida usando contador gama. Para detectar a biodistribuição das nanopartículas, camundongos portadores de tumor B16F10 foram injetados com PTX-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I na mesma dose e sacrificados 24 h após injeção. Os órgãos principais foram pesados e coletados para contagem gama.

Quimioterapia Tumor In Vivo

Camundongos Balb/c portadores de tumores B16F10 foram injetados com 150 µL de salina, PTX livre, PLP-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I (na mesma concentração de PTX, 5 mg/kg). O tamanho do tumor e peso corporal foram medidos por paquímetro a cada 4 dias. Volumes tumorais relativos foram calculados como V/V₀ (V₀ foi o volume tumoral quando o tratamento foi iniciado). Após aproximadamente 40 dias de tratamento, camundongos foram sacrificados e órgãos principais coletados, fixados em formalina 4%, inclusos em parafina e fatiados, corados com hematoxilina e eosina, e examinados sob microscópio digital.

Resultados e Discussão

Preparação e Caracterização de Nanopartículas FA-PLP Marcadas com ¹³¹I

O esquema de síntese de nanopartículas FA-PLP-¹³¹I é mostrado na Fig. 1. Em resumo, nanopartículas FA-PLP foram sintetizadas através de um método de nanoprecipitação de auto-montagem e FA-PLP radioativo (FA-PLP-¹³¹I) foi preparado usando o método de oxidação por cloramina-T. PTX foi encapsulado pelo composto PLGA-lipídio, que foi então enxertado com FA conjugado covalentemente na superfície da casca via PEGilação. Finalmente, ¹³¹I foi enxertado na superfície externa da nanopartícula. Imagens TEM indicaram que as nanopartículas FA-PLP-¹³¹I tinham morfologia esférica de distribuição de tamanho estreita (165,6 a 181,2 nm), o que foi confirmado por espalhamento dinâmico de luz (Fig. 2a, b). O potencial zeta variou de -39,1 a -3,2 mV (Fig. 2c). Os espectros UV-vis de PTX livre e FA-PLP-¹³¹I (com mesma concentração de PTX) mostraram o mesmo pico característico a 233 nm (Fig. 2d), indicando que PTX foi encapsulado dentro de FA-PLP-¹³¹I e que encapsulação não influenciou a intensidade de absorbância de PTX. Após cálculo, a eficiência de encapsulação de PTX em FA-PLP-¹³¹I foi mostrada como 56,35 ± 1,6%. O rendimento de radiomarcação de PTX-¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I foi 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5 e 54,8 ± 2,7, respectivamente.

Estabilidade é essencial para aplicação biomédica de nanopartículas. Após 4 semanas em armazenamento, FA-PLP-¹³¹I dissolvido em água, mídia celular, soro fetal bovino e PBS não exibiu mudanças em tamanho médio, potencial zeta, índice IDP (Fig. 3a-c), indicando grande estabilidade e dispersibilidade. Além disso, a estabilidade de radiomarcação de FA-PLP-¹³¹I foi detectada em plasma de camundongo a 37 °C (Fig. 3d), mostrando menos de 15% desiodação dentro de 7 dias.

Captação Celular In Vitro

A Figura 4 mostra a incorporação in vitro dependente do tempo de ¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I em células B16F10 medida por contador gama. FA-PLP-¹³¹I, bem como FA-PL-¹³¹I, mostraram valores de incorporação maiores que todos os pontos testados, aumentando com o tempo. Os valores de incorporação de FA-PLP-¹³¹I a 6 h foram 3,12 e 23,4 vezes maiores que os de ¹³¹I e PLP-¹³¹I, em concordância com resultados de imagens de microscopia confocal de varredura a laser de células B16F10 incubadas com nanopartículas FA-PLP-¹³¹I e PLP-¹³¹I marcadas com fluoresceína isotiocianato (Arquivo adicional 1: Figura S1). Estes resultados demonstram a alta captação celular de FA-PLP-¹³¹I, provavelmente devido ao efeito de direcionamento mediado por FA em células B16F10.

Citotoxicidade In Vitro

A citotoxicidade dos nanocarregadores controle, PL-¹³¹I e FA-PL-¹³¹I foi testada por ensaio MTT. Células tratadas com PL-¹³¹I e FA-PL-¹³¹I por 24 h tiveram viabilidade similar ao controle (Fig. 5a), indicando boa biocompatibilidade. Adicionalmente, FA-PLP-¹³¹I foi muito mais efetivo em suprimir proliferação de células B16F10 que PTX livre e PLP-¹³¹I na mesma concentração de PTX (Fig. 5b), indicando excelente quimioterapia direcionada a células. Os resultados demonstram que FA-PLP-¹³¹I tem alto efeito quimioterápico sem radiotoxicidade e citotoxicidade.

Estudo de Circulação Sanguínea e Biodistribuição

Radiomarcação foi reportada como mais confiável que imagem de fluorescência para rastreamento quantitativo e preciso in vivo de nanopartículas. Nanopartículas FA-PLP marcadas com ¹³¹I foram preparadas para investigar seu comportamento in vivo, incluindo circulação sanguínea e biodistribuição, medida por contador gama. A meia-vida de circulação sanguínea de PTX livre (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 h) foi prolongada para 18,5 ± 0,5 h por FA-PLP-¹³¹I (Fig. 6a) devido a encapsulação em nanopartículas, o que foi favorável para acúmulo tumoral direcionado. Em seguida, a biodistribuição de PTX livre-¹³¹I, PLP-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I em camundongos portadores de tumor B16F10 a 1 dia pós-injeção foi investigada (Fig. 6b). FA-PLP-¹³¹I, bem como FA-PL-¹³¹I, exibiram aumento óbvio de captação tumoral, que foi 4,41 e 12,8 vezes maior que a de PLP-¹³¹I e PTX livre-¹³¹I, respectivamente, provavelmente devido à circulação sanguínea prolongada de FA-PLP-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I e seu efeito de direcionamento por FA. Além disso, fígado e baço também exibiram captação relativamente alta devido ao seu metabolismo de nanopartículas, que foram os órgãos metabólicos normais.

Quimioterapia Tumor In Vivo

Camundongos tratados com PTX livre, PLP-¹³¹I e FA-PLP-¹³¹I exibiram inibição de crescimento tumoral comparado ao grupo controle salina (Fig. 7a). No geral, FA-PLP-¹³¹I foi o mais efetivo em supressão de crescimento tumoral sem recaída comparado a todos os grupos tratados após aproximadamente 40 dias de tratamento. Estes resultados são esperados considerando a circulação sanguínea significativamente prolongada de FA-PLP-¹³¹I e portanto sua capacidade de promover acúmulo tumoral direcionado mediado por FA. Além disso, acúmulo tumoral direcionado também levou a redução na exposição periférica de PTX, minimizando toxicidade sistêmica. Como esperado, sobre o processo completo de tratamento, não houve perda notável de peso corporal (Fig. 7b), e órgãos principais, incluindo coração, fígado, baço, pulmão e rim, não mostraram lesões histológicas óbvias em nenhum grupo (Fig. 7c).

Conclusões

Em resumo, sintetizamos nanopartículas PLGA-lipídio marcadas com ¹³¹I como carreadores de entrega de fármaco para quimioterapia direcionada a melanoma. Medindo a radioatividade de ¹³¹I, os comportamentos in vitro e in vivo de nanopartículas FA-PLP-¹³¹I foram estudados. As FA-PLP-¹³¹I obtidas mostraram grande dispersibilidade e estabilidade coloidal e de radiomarcação. Os nanocarregadores controle, PL-¹³¹I e FA-PL-¹³¹I também mostraram boa biocompatibilidade. Após encapsulação de PTX, FA-PLP-¹³¹I foi o mais efetivo em suprimir proliferação de células B16F10 sem citotoxicidade, atribuído ao efeito de direcionamento por FA. Além disso, FA-PLP-¹³¹I demonstrou prolongar significativamente a circulação sanguínea de PTX e efetivamente acumular na região tumoral alvo. Assim, FA-PLP-¹³¹I teve excelente inibição de crescimento tumoral e grande biocompatibilidade in vivo. Os resultados destacam o potencial promissor destes nanocarregadores FA-PLP-¹³¹I versáteis como agentes confiáveis de rastreamento de fármacos bem como sua aplicação em terapia tumoral direcionada.