Preparação Otimizada e Caracterização Físico-Química de Nanolipossomos Dupla-Droga Encapsulando Erlotinibe e Doxorrubicina

Resumo

A quimioterapia combinatória sinérgica depende da entrega coordenada de fármacos com mecanismos distintos. Apresentamos uma plataforma de nanolipossomos não-PEGilados, reprodutível, que co-encapsula erlotinibe (ERL) na bicamada lipídica e doxorrubicina (DOX) no núcleo aquoso. Lipídios (DSPC, colesterol, POPG) foram montados por hidratação de filme fino, seguida de sonicação com sonda para obter vesículas sub-200 nm. DOX foi carregado usando gradientes de sulfato de amônio (AS) ou pH; o gradiente AS produziu >90% de eficiência de encapsulação (EE) de DOX versus ~17% para o método de pH. EE de ERL atingiu 30%. Microscopia eletrônica de transmissão revelou núcleos cristalinos de DOX-sulfato e cristais de ERL menos ordenados na bicamada. As vesículas permaneceram estáveis em tamanho entre 4–37 °C e liberaram ERL rapidamente (<8 h) enquanto DOX liberou-se lentamente, permitindo perfil sinérgico tempo-diferencial. Esses achados estabelecem uma plataforma robusta de nanolipossomos dupla-droga adequada para estudos translacionais.

Introdução

Cânceres de mama triplo-negativos e outros tumores refratários resistem a monoterapias padrão devido a vias de dano ao DNA e sobrevivência entrelaçadas. Regimes combinados que primeiro preparam tumores com inibidor de fator de crescimento e depois os expõem a agente genotóxico mostraram sinergia pré-clínica. Para traduzir tais efeitos in vitro clinicamente, um veículo de entrega que co-entregue ambos os agentes e sincronize sua liberação é essencial, especialmente quando a farmacocinética difere marcadamente.

Nanolipossomos — vesículas de bicamada fosfolipídica — encapsulam naturalmente fármacos hidrofílicos no núcleo e hidrofóbicos na membrana, alcançando co-localização e acúmulo tumoral aumentado via efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR). No entanto, protocolos de manufatura confiáveis, reprodutíveis e dados físico-químicos abrangentes permanecem escassos, limitando a tradução clínica.

Métodos

Materiais

DSPC, POPG, colesterol (Avanti Polar Lipids), DOX·HCl e ERL base livre (Boryung Co. / Shanghai Send), sulfato de amônio, ácido cítrico (Daejung), e reagentes (Sigma-Aldrich).

Preparação de Nanolipossomos Dupla-Droga

ERL foi incorporado em mistura 27:20:3 (p/p/p) DSPC:colesterol:POPG (3:50 p/p fármaco) e seco em filme fino. Hidratação com 250–400 mM AS (ou 300 mM ácido cítrico, pH 3,9) a 65 °C produziu vesículas multilamelares. Sonicação com sonda (5 s ligado/2 s desligado, 20% amplitude, 36 J/pulso) em banho de gelo-água reduziu tamanho a ~140 nm. Excesso de AS foi removido por diálise noturna contra PBS (pH 7,4).

DOX (1,5 mg/mL, 2 mL) foi adicionado a 8 mL de lipossomos carregados com ERL e carregado por gradiente de pH ou AS. Quatro protocolos de carregamento de DOX (incubação, sonicação, equilíbrio, diálise) foram avaliados para otimizar EE.

Caracterização

Espalhamento dinâmico de luz mediu tamanho e polidispersidade; TEM (JEM-2100F) visualizou morfologia e estruturas cristalinas. Eficiência de encapsulação foi calculada a partir de fármaco liberado por Triton X-100 e quantificado por UV-Vis (ERL) ou fluorescência (DOX). Liberação in vitro empregou cassetes de diálise em PBS (pH 7,4) a 37 °C. Estabilidade física foi avaliada monitorando tamanho a 4, 25 e 37 °C por 21 dias.

Resultados e Discussão

Controle de Tamanho por Sonicação

Lipossomos de ERL não tratados tinham ~760 nm, encolhendo a ~222 nm dentro de 10 min de sonicação com sonda; sonicação adicional produziu mudanças negligenciáveis. Sonicação em banho de água alcançou redução similar mais rápido mas aumentou aquecimento, então resfriamento em gelo-água foi preferido. Pós-diálise, lipossomos apresentaram média de 140 nm.

Eficiência de Carregamento de DOX

Carregamento por gradiente AS produziu EE de 90%+, superando em muito os ~17% do gradiente de pH. Concentração de 350 mM AS maximizou EE e minimizou variabilidade, provavelmente devido à cristalização favorável de DOX-sulfato. Entre os quatro protocolos, a combinação de incubação a 65 °C, 15 min de sonicação com sonda e 30 min de equilíbrio à temperatura ambiente (Grupo 2) produziu a maior EE (~98%). Sonicação mais longa ou equilíbrio retardado reduziram EE, presumivelmente por vazamento de AS.

Morfologia e Cristalinidade

Imagens de TEM confirmaram vesículas esféricas <200 nm. TEM de alta resolução e SAED revelaram cristais de DOX-sulfato altamente ordenados no núcleo e cristais de ERL menos ordenados na superfície externa da bicamada. Controles de fármaco único exibiram padrões cristalinos similares, validando a integridade estrutural do sistema dupla-droga.

Estabilidade Física

Variações de diâmetro foram <15% a 4 °C, <10% a 25 °C e <6% a 37 °C por 21 dias, indicando robusta estabilidade. A alta temperatura de transição de fase do DSPC e 40% de colesterol provavelmente contribuíram para essa resiliência.

Liberação Tempo-Diferencial

Em PBS, ERL liberou ~65% em 48 h, enquanto DOX liberou ~30%. A janela inicial de 8 h mostrou >4% h⁻¹ de liberação de ERL versus <1% h⁻¹ de DOX, confirmando perfil de liberação sequencial propício à ação sinérgica.

Conclusões

Estabelecemos uma plataforma de nanolipossomos não-PEGilados, escalável, que co-encapsula ERL e DOX com alta EE e tamanho controlado. Sonicação com sonda após hidratação de filme reduz otimamente o diâmetro vesicular. Carregamento por gradiente AS, especialmente com 350 mM AS e breve equilíbrio pós-sonicação, produz a maior EE de DOX. TEM e SAED confirmam arranjos cristalinos distintos de cada fármaco. As vesículas são fisicamente estáveis e exibem liberação tempo-diferencial de ERL e DOX, posicionando-as como veículo promissor para terapia oncológica sinérgica.

Abreviações

DOX

Doxorrubicina

DSPC

1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina

EE

Eficiência de encapsulação

EPR

Permeabilidade e retenção aumentadas

ERL

Erlotinibe

PK

Farmacocinética

POPG

1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal sódico)

SAED

Difração de elétrons em área selecionada

SEM

Erro padrão da média

Tc

Temperatura de transição de fase

TEM

Microscopia eletrônica de transmissão