Pontos de Carbono Fluorescentes Verdes Acessíveis: Bioimagem Aprimorada e Entrega Direcionada de Fármacos

Resumo

Pontos de carbono com doxorrubicina encapsulada (DOX-CDs) foram preparados para bioimagem e entrega intracelular aprimorada de fármacos. Os CDs foram sintetizados via método hidrotérmico usando citrato e ureia a 200 °C por 1 h. Em seguida, DOX foi conjugado com sucesso nos CDs via interações físico-químicas. Os DOX-CDs exibiram boa estrutura cristalina, notável estabilidade aquosa, excelente propriedade de fotoluminescência e alto rendimento quântico de 93%. Imagens fluorescentes revelaram que os DOX-CDs podiam ser prontamente captados por células cancerígenas para marcação celular. Além disso, comportamento de liberação de DOX assistido por pH endolisossomal foi observado a partir dos DOX-CDs, e a citotoxicidade dos DOX-CDs foi confirmada pelo ensaio MTS contra células de câncer ovariano HO-8910. Adicionalmente, os CDs indicaram sinal fluorescente brilhante no teste de imagem animal e demonstraram baixa toxicidade após administração por 7 e 21 dias. Portanto, os CDs preparados poderiam ser uma sonda de imagem promissora para imagem biomédica e entrega intracelular de fármacos.

Introdução

Doxorrubicina (DOX) é um fármaco quimioterápico antraciclínico amplamente usado no tratamento de vários cânceres incluindo mama, pulmão, gástrico, ovariano, tireoide, mieloma múltiplo, sarcoma e cânceres pediátricos. O mecanismo de ação anticâncer para DOX é considerado interferir na síntese e reparo de DNA. Portanto, DOX precisa ser transportado através da membrana celular e ao núcleo celular para perturbar a síntese de DNA durante tratamento do câncer. No entanto, DOX livre não podia facilmente aproximar-se do núcleo celular e induzia severa cardiotoxicidade in vivo, o que dificultava sua aplicação como terapia contra câncer.

Recentemente, nanotransportadores multifuncionais como lipossomos, micelas, nanoemulsões, nanopartículas poliméricas e outras nanopartículas atraíram tremenda atenção por sua significância na entrega de fármacos anticâncer. Entre eles, como novo tipo de família de pontos quânticos, ponto quântico de carbono (CD) atraiu enorme interesse mundial desde sua descoberta em 2004. Em particular, CDs fluorescentes tornaram-se preferência em imagem celular, fotocatálise, entrega de fármacos, detecção de poluentes e íons de metais pesados, e equipamentos fotoelétricos devido às suas propriedades superiores em peso e tamanho quasi-zero (< 10 nm), alta fotoestabilidade, espectros de excitação amplos e contínuos, comprimento de onda ajustável, biocompatibilidade satisfatória, baixa toxicidade e excelente desempenho em fluorescência. Por exemplo, Yang et al. acoplaram com sucesso DOX aos CDs para tratamento anticâncer aprimorado, implicando que CDs têm grande significância na entrega de fármacos direcionada ao núcleo.

Anteriormente, várias técnicas foram propostas para preparar CDs incluindo numerosos materiais de biomassa, carbonização, passivação e funcionalização de superfície. Em detalhe, pode ser classificado em dois métodos principais. Um é a abordagem "top-down", descarga a arco, ablação a laser, gravação eletroquímica e método de oxidação, que se refere a quebrar grande escala de estrutura de carbono em nanopartículas de carbono. O outro método é o "bottom-up", que sintetiza pontos de carbono a partir de precursores moleculares, principalmente incluindo abordagem hidrotérmica, método ultrassônico e síntese assistida por micro-ondas. Xu et al. obtiveram pontos de carbono através de descarga a arco, oxidação, extração e eletroforese em gel. Ming et al. adquiriram pontos de carbono por eletrólise. Yang et al. otimizaram o método hidrotérmico original para sintetizar pontos de carbono com diferentes fluorescências. No entanto, esses métodos são limitados devido ao seu processo de síntese complicado, procedimento demorado, requisitos rigorosos de fabricação e matérias-primas caras. Além disso, o uso de solventes orgânicos como passivadores para a reação pode aumentar a toxicidade dos CDs. Além disso, a maioria dos CDs relatados emitia fluorescência azul sob excitação de luz UV, o que dificultava seriamente seu potencial no campo de imagem biomédica atribuído à forte autofluorescência de tecido interferindo.

Aqui, sintetizamos CDs fluorescentes verdes via pirólise térmica controlada verde e eficiente em uma etapa de citrato de sódio di-hidratado e ureia. DOX foi conjugado não-covalentemente na superfície dos CDs preparados para entrega de fármaco por meio de interação hidrofóbica e eletrostática, bem como empilhamento π-π. A morfologia e estrutura dos CDs foram investigadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e análise de difração de raios X. As propriedades ópticas foram avaliadas por espectrômetro UV-vis e espectros de emissão de fotoluminescência (PL). A liberação sustentada de fármaco foi realizada pelo método de diálise. A captação celular e distribuição intracelular de DOX-CDs foram investigadas por microscopia de fluorescência. O efeito anticâncer de DOX-CDs foi avaliado por ensaio MTS padrão. A imagem in vivo de CDs foi realizada em camundongos nu Balb/c. Finalmente, a toxicidade de longo prazo dos CDs foi investigada por análise histológica. Portanto, os CDs preparados seriam um agente potencial para imagem in vivo e entrega direcionada de fármacos.

Materiais e Métodos

Materiais

Citrato de sódio di-hidratado, ureia, L-arginina, acetona etilenodiamina, sulfato de quinina, salina fosfatada tamponada (PBS), ácido acético, fosfato de hidrogênio dissódico e paraformaldeído foram obtidos da Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (Shanghai, China). Kit de Ensaio Colorimétrico de Proliferação Celular MTS (MTS), Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM/alta glicose), solução de penicilina-estreptomicina e solução de tripsina-EDTA foram comprados da Beyotime Biotechnology Co. Ltd (Shanghai, China). Soro fetal bovino (FBS) foi obtido da Tianhang Biotechnology Co. Ltd (Hangzhou, China). Células de câncer ovariano HO-8910 e células endoteliais de veia umbilical humana EA.hy926 foram obtidas do Instituto de Nutrição e Saúde de Xangai, Academia Chinesa de Ciências (Shanghai, China). Cloridrato de doxorrubicina (DOX) foi comprado da Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Bolsas de diálise (PMCO = 1000 Da) foram compradas da SpectrumLabs (Los Angeles, CA, USA).

Síntese de CDs e DOX-CDs

Brevemente, citrato de sódio di-hidratado (0,2 mmoL) e ureia (5 mmoL) foram primeiramente dissolvidos em 1 mL de água DI. Então, a mistura foi transferida para recipiente de vidro e carbonizada a 200 °C por 1 h. Posteriormente, 1 mL de água DI e acetona (v/v, 1/3) foram adicionados e centrifugados a 10000 rpm por 10 min por três vezes.

DOX foi conjugado nos CDs pela interação não-covalente. Brevemente, DOX·HCl (0,5 mg) foi adicionado a 5 mL de CDs (5 mg/mL) e então agitado por 48 h no escuro. A solução resultante foi dialisada contra água DI em bolsa de diálise (PMCO = 1000 Da) por 24 h para obter DOX-CDs. Finalmente, os DOX-CDs foram liofilizados e armazenados a 4 °C.

Caracterização de CDs e DOX-CDs

A morfologia de tamanho dos CDs foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão (MET, FEI Tecnai G2 Spirit). Medidas de emissão PL foram realizadas em espectrofotômetro de fluorescência LS55 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). O rendimento quântico (QY) dos CDs foi determinado usando solução de sulfato de quinina em H₂SO₄ como referência. A estrutura cristalina foi observada por espectrofotômetro de infravermelho com transformada de Fourier Bruker Tensor27 (Pike Corporation, Madison, Wisconsin). Espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) foi realizada usando espectrômetro ESCALAB250Xi (Thermo, USA). Potencial zeta foi medido com potenciômetro Zeta (Malvern Panalytical, Malvern, UK).

Estudo de Liberação de Fármaco In Vitro

A liberação in vitro de DOX a partir de DOX-CDs foi investigada usando bolsa de diálise. Brevemente, DOX-CDs foram carregados na bolsa de diálise e imersos em PBS (pH 7,4 e 5,0), respectivamente, então colocados em incubadora agitadora (37 °C, 100 rpm). Em tempos predeterminados, amostras de 0,5 mL foram retiradas e substituídas com mesmo volume de PBS. O DOX liberado foi registrado por intensidade de fluorescência a 590 nm.

Teste de Citotoxicidade In Vitro

A citotoxicidade celular de DOX-CDs foi determinada por ensaio MTS contra células de câncer ovariano HO-8910 e células endoteliais de veia umbilical EA.hy926. Brevemente, células foram semeadas em placa de 96 poços na concentração de 0,5 × 10⁵ células/mL, mantidas por 24 h para permitir adesão celular. Então, DOX-CDs em várias concentrações foram adicionados em cada poço. Após 24 h de incubação, o meio foi aspirado, e 90 µL de meio e 10 µL de MTS foram adicionados a cada poço. Após 4 h, a absorbância a 490 nm foi medida usando leitor de microplacas (BioTek Epoch, Service Card). As viabilidades celulares foram expressas como porcentagem de células sobreviventes e reportadas como médias de medidas triplicadas.

Estudo de Imagem Celular In Vitro

Células de câncer ovariano HO-8910 foram inoculadas em placa de 6 poços e incubadas a 37 °C por 24 h para adesão celular. Então, as células foram incubadas com DOX-CDs para permitir captação celular. Após 4 h de incubação, o meio foi removido, e células foram lavadas três vezes com PBS frio e fixadas com paraformaldeído 4% por 10 min. Finalmente, a morfologia e distribuição de fluorescência das células foram visualizadas por microscópio de fluorescência (Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, Alemanha).

Imagem In Vivo

Experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado Animal da Universidade Médica de Xuzhou. Camundongos nu Balb/c foram usados para avaliar o potencial de CDs em imagem fluorescente. Brevemente, camundongos nu Balb/c foram injetados subcutaneamente com solução aquosa de CDs (50 µL, 6 mg/mL) no local de injeção após injeção intraperitoneal de 2% pentobarbital para anestesia. Além disso, a biodistribuição dos CDs no corpo do camundongo também foi investigada injetando CDs (5 mg/kg) via veia da cauda. Diferentes órgãos (coração, rim, baço, fígado, bexiga) foram coletados para avaliações de fluorescência em vários pontos de tempo. A imagem de fluorescência animal foi realizada em sistema de imagem Tanon-5200Multi Gel, e o tempo de exposição foi 1,0 s para todas as imagens de fluorescência.

Estudo de Toxicidade In Vivo

Camundongos Kunming (fêmeas, 7 semanas) foram usados para investigar toxicidade de longo prazo in vivo dos CDs. Camundongos Kunming foram divididos aleatoriamente em 2 grupos: CDs e grupo controle. Os camundongos foram injetados com PBS e CDs via veia da cauda (6 mg/kg). Então, os principais órgãos incluindo coração, pulmão, rim, fígado e baço foram coletados após 7 e 21 dias de injeção. Posteriormente, os órgãos foram fixados com paraformaldeído 4%, fatiados e corados com hematoxilina e eosina (H&E). Finalmente, as seções histológicas foram observadas sob microscópio óptico (Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, Alemanha).

Resultados e Discussão

Caracterização de CDs e DOX-CDs

CDs foram preparados através de estratégia em uma etapa usando citrato de sódio di-hidratado e ureia (citrato de sódio di-hidratado/ureia = 1/25) a 200 °C por 1 h. DOX foi conjugado covalentemente na superfície dos CDs preparados para entrega de fármaco (Esquema 1). Conforme mostrado na imagem de MET (Fig. 1a), os CDs exibiram morfologia esférica uniforme com diâmetro médio de 2,75 nm e distribuição de tamanho relativamente estreita. Além disso, a estrutura cristalina dos CDs pôde ser observada pela imagem de MET de alta resolução (Fig. 1a inseto), indicando bem cristalinos com franjas de rede notáveis.

A estrutura química dos CDs foi caracterizada por espectroscopia FTIR. Conforme mostrado na Fig. 1d, picos agudos a 3499 cm⁻¹ e 1729 cm⁻¹ atribuídos a –OH e –COOH respectivamente, enquanto aqueles a 780 cm⁻¹ e 1372 cm⁻¹ poderiam ser atribuídos a N–H. Pode-se concluir que tanto grupos carboxila quanto amino existem na superfície dos pontos de carbono como grupos funcionais e modificam macromoléculas biológicas com funções específicas, o que fornece possibilidade para pesquisa de aplicação futura dos pontos de carbono.

Além disso, as propriedades ópticas dos CDs foram investigadas usando absorbância UV-vis e espectroscopia PL. Conforme mostrado na Fig. 1c, os CDs exibiram pico de absorbância a 410 nm, e DOX revelou pico de absorbância a 500 nm. Enquanto isso, os DOX-CDs mantiveram os picos de absorbância dos CDs e DOX a 410 nm e 500 nm, respectivamente, indicando conjugação bem-sucedida de DOX nos CDs. Além disso, conforme mostrado na figura inseto da Fig. 1c, a solução aquosa de DOX-CDs revelou amarelo claro e transparente sob luz natural e tornou-se verde brilhante sob excitação UV. Além disso, o rendimento quântico de fluorescência foi calculado como 93% com sulfato de quinina usado como referência (QY = 54%). Como CDs foram excitados em comprimentos de onda de 340 a 440 nm, o pico PL mostrou quase nenhum deslocamento, indicando propriedades de emissão independentes de excitação dos CDs. O comprimento de onda de excitação máximo e pico PL dos CDs são 400 e 525 nm, respectivamente. O comportamento PL independente de excitação pode resultar dos estados de superfície uniformes dos CDs.

Adicionalmente, a composição elementar dos CDs foi determinada por XPS. Conforme demonstrado na Fig. 1f, o espectro XPS determinou que os CDs constituíam principalmente de carbono (C), nitrogênio (N) e oxigênio (O) e a razão atômica correspondente foi 78,39%, 7,52% e 14,1%, separadamente. Três picos típicos de C₁s, N₁s e O₁s podem ser observados a 284,8, 399,5 e 532,6 eV, respectivamente. Especificamente, espectro C₁s exibiu 3 picos a 284,8, 286,7 e 288,3 eV, representando existência de ligações C–C, C–N, C–O ou C=O, separadamente (Figura S1A). O espectro de alta resolução para N₁s revelou pico a 399,5 eV, atribuído a C–N. Além disso, o espectro O₁s também confirmou presença de ligações C=O e C–O a 531,9 e 532,6 eV, respectivamente (Figura S1B).

A intensidade de fluorescência dos CDs manteve maravilhosa estabilidade tanto a 4 °C quanto à temperatura ambiente (Figura S2A). A diminuição da intensidade fluorescente a 4 °C em 2 semanas por menos de 10% pode ser negligenciada. Portanto, espera-se que os pontos de carbono possuam estabilidade de longo prazo para serem usados como agente de imagem biomédica.

A Figura S2B ilustrou que intensidades PL dos CDs diminuíram em soluções aquosas de alto (> 10) ou baixo (< 3) pH. No entanto, a intensidade PL foi estável em solução aquosa pH 3–10. Os CDs preparados aplicados em marcação biológica e bioimagem são requeridos para serem co-incubados com células, onde condição de pH é em torno de neutro (pH = 6–8), o que garante estabilidade PL. Teoricamente, indicou que os CDs preparados podem emitir fluorescência com alta estabilidade em células para marcação biológica e bioimagem.

Para clarificar a estabilidade fluorescente dos CDs, teste de anti-fotobranqueamento foi realizado. Conforme mostrado na Figura S2C, comparado com pontos quânticos (CdTe) e corantes fluorescentes tradicionais (DAPI), os pontos de carbono exibiram não apenas maior intensidade de fluorescência, mas também excelente resistência ao fotobranqueamento. Além disso, os CDs também foram bem dispersos em várias soluções como água DI, PBS, meio FBS, meio DMEM e meio CM1-1, esperando excelente estabilidade no sistema sanguíneo (Figura S3).

Os CDs exibiram valor de potencial zeta de −31,1 mV (Figura S4), que pode ser atribuído à existência de grupos funcionais oxigênio e carboxila na superfície dessas partículas. O DOX potencialmente carregado positivamente pode ser fisicamente anexado na superfície dos CDs via interação eletrostática com grupo carboxila e interação hidrofóbica. DOX-CDs exibem valor de potencial zeta de −9,7 mV, confirmando a fabricação dos complexos DOX-CD. Além disso, os CDs contêm rede de carbono sp² que pode carregar estrutura aromática de DOX via fortes interações π-π. A eficiência de encapsulamento ótima e eficiência de carregamento de fármaco foram investigadas por várias concentrações de DOX. Conforme demonstrado na Figura S5, a eficiência máxima de encapsulamento foi calculada como 50,82% com eficiência de carregamento correspondente de 6,82% a 0,1 mg/mL de DOX.

Liberação In Vitro de DOX dos DOX-CDs

O comportamento de liberação in vitro de DOX a partir de DOX-CDs foi realizado em PBS para investigar liberação de DOX sensível a pH. Para demonstrar isso, os DOX-CDs foram incubados em diferentes valores de pH (pH 7,4, 6,0 e 5,0) e a liberação de DOX foi monitorada. Conforme mostrado na Fig. 2, os DOX-CDs indicaram perfis de liberação sustentada em pH 7,4, 6,0 e 5,0 durante o período de repouso. Os resultados indicaram que a liberação de DOX foi dependente de pH. Apenas 13% de DOX foi liberado dentro de 8 h quando DOX-CDs foram incubados a pH 7,4. No entanto, quando o valor de pH foi reduzido para 6,0 ou 5,0, mais de 35% ou 65% de DOX foi liberado dos DOX-CDs, respectivamente, sugerindo sensibilidade dos DOX-CDs ao pH baixo. Demonstrou que a quantidade de DOX liberado aumentou em pH mais baixo, o que foi atribuído à protonação aumentada de grupos –NH₂ no DOX em ambiente ácido. Portanto, os DOX-CDs podem proibir vazamento prematuro de DOX durante circulação sanguínea e aumentar a liberação intracelular de fármaco. É de grande benefício para tratamento eficaz do câncer.

Teste de Citotoxicidade In Vitro

A questão de biocompatibilidade é crítica para CDs para aplicação em imagem biomédica e entrega de fármacos. A citotoxicidade de CDs em várias concentrações foi realizada contra células de câncer ovariano HO-8910 e células endoteliais de veia umbilical EA.hy926. Conforme representado na Fig. 3a, tanto células HO-8910 quanto EA.hy926 mantiveram alta viabilidade acima de 85% mesmo em alta concentração de 5 mg/mL, indicando excelente biocompatibilidade e baixa citotoxicidade dos CDs.

Quando acoplado com DOX, os DOX-CDs exibiram viabilidade celular dependente de concentração de DOX contra células de câncer ovariano HO-8910. Conforme mostrado na Fig. 3b, a viabilidade celular dos DOX-CDs foi significativamente menor que a dos CDs livres de DOX, especialmente quando a concentração de DOX foi acima de 0,05 mg/mL, indicando excelente efeito anticâncer dos DOX-CDs.

Estudo de Captação Celular e Marcação In Vitro

Para avaliar a capacidade de captação intracelular de DOX-CDs, a imagem celular foi investigada nas células HO-8910. Conforme ilustrado na Fig. 4, fluorescência verde e vermelha vívidas foram observadas dentro das células cancerígenas atribuídas à presença de CDs e DOX, respectivamente. Especialmente, sinal intenso de fluorescência verde localizou-se principalmente no citoplasma, indicando distribuição intracelular dos CDs. Inversamente, o sinal vermelho foi significativamente mais forte nos núcleos celulares comparado com citoplasma, sugerindo que o DOX pode ter se desconjugado dos CDs e movido diretamente para os núcleos celulares atribuído à sua alta afinidade com DNA. Pode ser explicado que o baixo valor de pH (5,0) no endossomo e lisossomo pôde auxiliar a liberação de DOX dos DOX-CDs. Portanto, os DOX-CDs poderiam ser um agente promissor para marcação celular e entrega intracelular de fármacos.

Estudo de Imagem Animal In Vivo

Um camundongo nu foi administrado subcutaneamente com solução aquosa de CDs (50 µL, 6 mg/mL). O camundongo foi então anestesiado por injeção intraperitoneal de 1% pentobarbital e imagem por sistema de imagem Tanon-5200Multi Gel sob luz de excitação 488 nm e filtro de emissão 535 nm. Conforme mostrado na Fig. 5a, forte fluorescência verde foi observada no local administrado, implicando que a fluorescência dos CDs pôde efetivamente penetrar pele e tecido de camundongos. Além disso, o camundongo manteve-se saudável após injeções, indicando que os CDs eram de excelente biocompatibilidade e baixa toxicidade para animais. Considerando todos os resultados, os CDs eram capazes como sonda de luminescência excepcional para bioimagem in vitro e in vivo.

Além disso, a biodistribuição e via de excreção dos CDs foram realizadas injetando o nanossonda via veia da cauda. Em diferentes pontos de tempo (0, 0,5, 1, 3 h), vários órgãos foram dissecados para imagem de fluorescência. Conforme mostrado na Fig. 5b, rim e bexiga revelaram sinal de fluorescência muito mais forte comparado com outros órgãos incluindo coração, baço e fígado após injeção. Além disso, o sinal de fluorescência no rim aumentou significativamente dentro de 0,5 h pós-injeção e diminuiu gradualmente após 1 h. Então, o sinal de fluorescência na bexiga aumentou gradualmente de 0,5 h a 1 h, indicando que os CDs foram entregues à bexiga a partir do rim. O resultado indicou que os CDs poderiam ser excretados e eliminados pelo sistema rim-bexiga.

Teste de Toxicidade de Longo Prazo In Vivo

Além disso, estudo de toxicidade de longo prazo in vivo também foi realizado para investigar totalmente o potencial de empregar CDs em pesquisa clínica. Camundongos Kunming foram injetados via veia da cauda com PBS e CDs, e órgãos principais (coração, pulmão, rim, fígado, baço) foram coletados após 7 e 21 dias para análise histológica. Subsequentemente, figuras de tecidos histológicos foram imageadas por microscópio para avaliar diferença patológica entre grupos experimentais e grupo controle. Conforme exibido na Fig. 6, nenhum dano orgânico notável e lesão inflamatória foram observados nos órgãos principais de animais administrados com CDs, sugerindo que os CDs preparados eram seguros para uso clínico e estudo in vivo. Portanto, os CDs verdes sintetizados eram biocompatíveis como biomarcador e sonda de bioimagem.

Conclusão

Em conclusão, este trabalho demonstrou preparação custo-efetiva de CDs fluorescentes verdes com alto QY de 93% para bioimagem e entrega intracelular aprimorada de fármacos. DOX foi conjugado com sucesso nos CDs para formar DOX-CDs com boa estrutura cristalina, notável estabilidade aquosa e excelente propriedade de fotoluminescência. Os DOX-CDs puderam responder aos ambientes de pH intracelulares para promover liberação intracelular gatilhada por ácido. Atribuído à sensibilidade a pH, os DOX-CDs mostraram inibição eficaz à proliferação de células HO-8910. Os DOX-CDs exibiram excelente capacidade de marcação celular e responderam ao pH endo/lisossomal para liberar DOX dentro das células. Os CDs atuaram como sondas fluorescentes tanto in vitro quanto in vivo. Finalmente, nenhum efeito tóxico notável foi observado em camundongos tratados com CDs pela análise histológica. No entanto, o trabalho demonstrou que CDs preparados pelo método custo-efetivo podem ter grande potencial em imagem biomédica e entrega intracelular de fármacos.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e seus arquivos de informação suplementar.

Abreviações

CDs:

Pontos de carbono

DOX:

Doxorrubicina

DOX-CDs:

Pontos de carbono com doxorrubicina encapsulada

FBS:

Soro fetal bovino

Ensaio MTS:

Kit de Ensaio Colorimétrico de Proliferação Celular MTS

PBS:

Salina fosfatada tamponada

QY:

Rendimento quântico

MET:

Microscopia eletrônica de transmissão

XPS:

Espectroscopia de fotoelétrons de raios X