Óxido de Grafeno Reduzido por Micro-ondas e Revestido com Quitosana para Entrega Direcionada de Adriamicina e Terapia Aprimorada de Câncer de Mama

Resumo

Para alcançar melhor eficácia antitumoral, é urgente melhorar a eficiência de entrega de fármacos anticancerígenos no direcionamento de células cancerígenas. Neste trabalho, nanofolhas de óxido de grafeno funcionalizadas com quitosana (ChrGO) foram fabricadas via redução assistida por micro-ondas, que foram empregadas no nanosistema de entrega intracelular para agente anticancerígeno em células de câncer de mama. Pesquisa de carregamento e liberação de fármaco indicou que a adriamicina pode ser eficientemente carregada e liberada das nanofolhas ChrGO. Menor liberação de fármaco durante a entrega e melhor biocompatibilidade do ChrGO/adriamicina melhoram significativamente sua segurança e eficácia terapêutica em células BT-474 superexpressoras de HER2. Além disso, ChrGO/adriamicina em combinação com trastuzumabe exibiu atividade antitumoral sinérgica em células BT-474, demonstrando eficácia terapêutica superior comparada a cada fármaco isoladamente. Células tratadas com trastuzumabe (5 μg/mL) ou ChrGO/adriamicina equivalente (5 μg/mL) cada uma provocaram 54,5% e 59,5% de morte celular, respectivamente, enquanto o tratamento combinado com trastuzumabe e ChrGO/adriamicina resultou em dramáticos 88,5% de morte celular. A terapia de duplo alvo exibiu maior apoptose, indicando eficácia terapêutica superior devido à presença de diferentes mecanismos de ação. O tratamento combinado de ChrGO/adriamicina e trastuzumabe em células BT-474 induziu parada do ciclo celular e apoptose, que finalmente levaram à morte de células cancerígenas aumentadas. Este trabalho forneceu uma fabricação facilitada assistida por micro-ondas de ChrGO como nanosistema de entrega de fármaco intracelular controlado e direcionado, que se espera ser uma nova terapia promissora para tratamento de células de câncer de mama superexpressoras de HER2.

Introdução

O receptor HER2 é um membro da família do receptor EGFR que medeia crescimento e diferenciação de células cancerígenas e é altamente superexpressado em 20–30% dos cânceres de mama humanos, levando a um fenótipo de tumor metastático e prognóstico ruim [1]. HER2 também é superexpressado em aproximadamente 20% dos cânceres gástricos humanos [2]. Trastuzumabe, um anticorpo terapêutico monoclonal humanizado, demonstra vantagens terapêuticas promissoras como terapia de primeira linha em pacientes com câncer de mama superexpressor de HER2 [3]. No entanto, a taxa de resposta geral ao trastuzumabe permanece modesta: 15–30% quando tratado como terapia única e 50–75% quando usado em tratamento combinado com fármacos quimioterápicos [4]. Entre aqueles pacientes que respondem ao trastuzumabe, a maioria eventualmente progride após resposta inicial e adquire resistência ao longo do tempo após tratamento contínuo [5]. Assim, é essencial e necessário desenvolver terapias adicionais inovadoras para pacientes superexpressores de HER2 para melhorar taxas de sobrevivência globais.

Antraciclinas ainda servem como espinha dorsal do tratamento do câncer. Para os agentes antraciclínicos, o inibidor da topoisomerase II adriamicina tem sido amplamente usado para tratar muitos cânceres, como mama, pulmão e linfóides [6]. Adriamicina tem eficácia eficaz no tratamento de pacientes com câncer de mama superexpressores de HER2, devido à proximidade entre o gene HER2 e o gene topoisomerase II [7]. Apesar do benefício clínico observado com terapias baseadas em antraciclinas no câncer de mama, disfunção cardíaca restringiu aplicações terapêuticas mais expansivas. No ensaio clínico, trastuzumabe em combinação com adriamicina demonstrou eficácia significativa, enquanto cardiotoxicidade altamente dependente de dose foi um problema que tem que ser resolvido [8]. Liberação sustentada de agentes quimioterápicos no tecido do alvo cancerígeno é reconhecida como boa solução para reduzir doses necessárias para eficácia terapêutica e melhorar perfis de segurança [9]. Para alcançar melhor eficácia antitumoral mas menos efeitos colaterais, há uma necessidade urgente de melhorar a eficiência de entrega de fármacos anticancerígenos no direcionamento de células cancerígenas.

Nanomateriais baseados em óxido de grafeno (GO) têm demonstrado grande promessa na entrega controlada de agentes quimioterápicos [10]. Numerosos estudos demonstraram que a toxicidade do GO está associada à sua funcionalização de superfície [11]. Recentemente, agentes ambientalmente amigáveis, como quitosana e PEG, foram relatados para funcionalizar GO com grupos funcionais de superfície menos venenosos [12, 13]. Estabilidade coloidal de nanopartículas em meios biológicos é crucial para o desenvolvimento de sistema de entrega de fármacos eficaz e seguro para uso clínico [14]. Nanofolhas de GO funcionalizadas ganharam grande atenção em aplicações biomédicas devido às suas propriedades como biocompatibilidade e estabilidade. Como excelente candidato para biomaterial baseado em grafeno, estabilidade coloidal de GO ou rGO é importante para controlar o desempenho de transportadores de fármacos. GO funcionalizado com polietilenoglicol exibiu propriedade coloidal melhorada em meios de cultura celular [15]. P. Khanra relatou um método inovador para redução simultânea e biofuncionalização de GO usando células de levedura como biocatalisador redutivo [16, 17]. Avinav G apresentou uma biossíntese one-pot de GO utilizando extrato de levedura durante processo de autoclave [18]. Tratamento de sonicação de folhas de GO de tamanho micrométrico por horas resultou em nanofolhas de GO, que mostraram maior estabilidade coloidal comparado a GO de tamanho micrométrico regular [19]. Embora estudos anteriores demonstraram o alto potencial de GO para biomateriais, nanofolhas de GO biofuncionalizadas com quitosana por redução assistida por micro-ondas usando extrato de levedura livre de células não foram estudadas até agora. Para este propósito, uma nova estrutura de óxido de grafeno funcionalizado com quitosana (ChrGO) foi construída por um sistema de síntese por micro-ondas facilitado que utiliza extrato de levedura como redutor. Além disso, a funcionalização eficaz de GO com quitosana biocompatível fornece uma plataforma potencial para carregamento e entrega eficientes de fármacos. Estudos de carregamento e liberação de fármaco demonstraram que adriamicina foi eficientemente carregada e liberada das nanofolhas ChrGO. Os compostos ChrGO/adriamicina mostraram atividade antitumoral significativa de maneira dependente de concentração. Particularmente, o tratamento combinacional com ChrGO/adriamicina e trastuzumabe resultou em efeito de inibição de crescimento aumentado em células BT-474 comparado à monoterapia. A eficácia antitumoral sinérgica destes agentes foi revelada como mediada através de parada do ciclo celular e apoptose, que finalmente levaram à morte de células cancerígenas. Este trabalho relatou uma rota promissora para produção rápida e custo-efetiva de compostos ChrGO, que entregaram agentes quimioterápicos de maneira controlada espaço-temporalmente para tratamento eficiente do câncer (Esquema 1).

Biofuncionalização e redução assistida por micro-ondas de óxido de grafite como nanosistema de entrega de fármaco controlado para terapia de duplo alvo em células BT-474 superexpressoras de HER2

Materiais e Métodos

Materiais

Pó de grafite foi obtido da Qingdao Huatai Tech (Qingdao, China). Quitosana e adriamicina foram comprados da Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, China). Trastuzumabe foi comprado da Hoffmann-La Roche Ltd (Basel, Suíça). Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), meio modificado de Dulbecco's Eagle (DMEM) e soro fetal bovino (FBS) foram comprados da Invitrogen Corporation (Camarillo, EUA). Filtros centrífugos Amicon® Ultra foram comprados da Merck Millipore. Kit de ensaio de proliferação celular CellTiter 96® aqueous one solution e kit de sistema de ensaio Caspase-Glo® 3/7 foram obtidos da Promega Corporation (Madison, EUA). Levedura de padeiro seca foi obtida da AB/Mauri Co., Ltd. Linhagens celulares BT-474 e Cos-7 foram obtidas do Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências (Shanghai, China). Meio Luria-Bertani foi comprado da Sangon Biotech Co., Ltd. Todos os químicos eram grau analítico e comercialmente disponíveis sem purificação adicional.

Redução Assistida por Micro-ondas de GO Funcionalizado com Quitosana

Óxido de grafite (GO) foi preparado a partir de flocos de grafite nativo usando método de Hummer modificado [14]. Para obter uma única camada de GO nano-dimensionado, o GO foi exfoliado com sonda ultrassônica (Scientz, China) operando a 800 W por 8 h. Finalmente, o GO exfoliado foi disperso em água desionizada para uso posterior. As nanofolhas de quitosana-GO parcialmente reduzidas (ChrGO) foram sintetizadas através de redução assistida por micro-ondas de GO com solução aquosa de quitosana usando um sistema de síntese por micro-ondas. O extrato de levedura livre de células foi usado para a biossíntese de ChrGO via redução assistida por micro-ondas. Primeiro, as células de levedura estocadas foram ativadas por inoculação em meio Luria-Bertani e agitação a 135 rpm por 18 h a 25 °C. As células de levedura ativadas foram transferidas para solução de sacarose 2% agitando a 135 rpm por mais 6 h a 25 °C. Em seguida, 6 mL de extrato de levedura livre de células foi obtido por separação centrífuga a 2000 rpm por 5 min. Então, 50 mg de quitosana foi dissolvido em 25 mL de solução de ácido acético 2% (v/v) e misturado com extrato de levedura [20]. Uma solução de GO 5 mg foi adicionada sob agitação magnética vigorosa. Finalmente, a solução preparada foi transferida para equipamento de síntese por micro-ondas NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, China) para a reação de micro-ondas. O esquema de aquecimento para o sistema de micro-ondas envolveu aquecimento a 80 °C por 5 min e manutenção da temperatura por mais 5 min. O ChrGO obtido foi purificado com filtro MWCO 100-kDa (Millipore, EUA) e liofilizado para uso posterior.

Caracterizações

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de GO nano-dimensionado foram obtidas em um microscópio eletrônico de transmissão JEM-2100 com tensão de aceleração de 200 kV (JEOL, Japão). Espectros ultravioleta-visíveis (UV-Vis) foram obtidos usando um espectrofotômetro UV/Vis/NIR Lambda 950 (Perkin-Elmer, EUA). Espectros de transformada de Fourier infravermelha (FTIR) foram coletados usando um espectrômetro FTIR Vertex 70 varrendo de 4000 a 400 cm⁻¹ com amostras preparadas como pastilhas de KBr (Bruker, Alemanha). Espectros Raman foram registrados usando um microscópio Raman Senterra R200-L com comprimento de onda de excitação de 532 nm (Bruker Optics, Alemanha). Padrões de difração de raios X (XRD) foram examinados por um difratômetro Bruker D8 Advance (Bruker, Alemanha). Os elementos de superfície foram registrados usando espectroscopia de fotoelétrons por raios X (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD com radiação Al Ka monocromática (1486,6 eV) (Shimadzu, Japão). Análise termogravimétrica (TGA) foi conduzida em um PerkinElmer Pyris 1 TGA a uma taxa de aquecimento de 5 °C/min de 30 a 800 °C em atmosfera de nitrogênio (PerkinElmer, EUA). A carga de superfície dos compostos foi medida por um instrumento Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, Reino Unido).

Carregamento e Liberação de Fármaco

Quatro miligramas de nanopartículas ChrGO foi suspenso em 20 mL de solução aquosa de adriamicina (0,4 mg/mL). Após sonicação por 0,5 h, agitação foi realizada no escuro por 24 h, evitando luz. A adriamicina não carregada foi removida por centrifugação filtração através de filtros Amicon 50-kDa MWCO (Millipore, EUA) e lavada com tampão fosfato salino (PBS, pH 8,0) até o sobrenadante ficar incolor. A concentração de adriamicina foi determinada usando uma curva de concentração padrão de adriamicina por espectrometria UV-Vis a 490 nm com leitor de microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, EUA). A quantidade de carregamento de adriamicina no ChrGO foi determinada com absorbância UV-Vis medindo a concentração da perda de adriamicina no sobrenadante do filtro centrífugo Amicon® Ultra-15 mL.

As características de liberação de adriamicina do ChrGO foram estudadas. A ChrGO carregada com adriamicina foi submersa em 10 mL de solução tampão PBS. Em intervalos especificados, 2 mL de solução de adriamicina liberada destacada do ChrGO foi coletada por centrifugação filtração através de filtros Amicon 50-kDa MWCO (Millipore, EUA). O volume da solução ChrGO/adriamicina foi mantido constante adicionando 2 mL de solução tampão PBS fresca após cada amostragem. A quantidade de adriamicina liberada do ChrGO foi medida por absorbância UV-Vis a 490 nm por um leitor de microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, EUA). Os estudos de liberação foram investigados em diferentes soluções de pH (valores de pH 5 e 7,4).

Análise de Biocompatibilidade e Ensaio de Eficácia Terapêutica

Células BT-474 e Cos-7 foram mantidas em RPMI-1640 suplementado com 10% FBS ou DMEM suplementado com 10% FBS, respectivamente, e cultivadas em atmosfera umidificada de 5% CO₂ a 37 °C. O ensaio de biocompatibilidade de GO e ChrGO foi realizado em células BT-474 ou Cos-7 via ensaio de citotoxicidade celular. Células foram semeadas em placas planas de 96 poços a uma densidade de 3 × 10⁴ células por poço e pré-incubadas por 18 h antes do tratamento com GO e ChrGO. Então, as diluições dos agentes testados foram adicionadas às células e incubadas por mais 24 h. A viabilidade das células foi determinada pelo CellTiter 96® aqueous one solution. A absorbância foi medida a 490 nm por um leitor de microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, EUA).

A eficácia dos complexos ChrGO/adriamicina isolados ou em tratamento combinado com trastuzumabe na proliferação em células BT-474 foi investigada por ensaio de inibição de proliferação [16]. Células BT-474 foram semeadas em placas planas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10⁴ células por poço e incubadas por 24 h. Então, complexos ChrGO/adriamicina isolados ou em tratamento combinado com trastuzumabe foram introduzidos nas células BT-474 no meio de cultura. Após incubação de 96 h, as células viáveis foram determinadas pelo CellTiter 96® aqueous one solution. A absorbância foi medida com um leitor de microplacas SpectraMax® M5 a 490 nm (Molecular Devices, EUA). Os dados foram analisados com ANOVA unidirecional. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Análise de Ciclo Celular e Ensaio de Apoptose

Para análise de ciclo celular, células BT-474 foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 5 × 10⁵ células por poço e permitidas aderir por 16 h. As células foram tratadas com complexos ChrGO/adriamicina isolados ou em combinação com trastuzumabe por 24 h. Células BT-474 foram colhidas e fixadas com 70% (v/v) etanol a 4 °C por 24 h. As células BT-474 fixadas foram coradas com solução de iodeto de propídio (15 μg/mL) contendo ribonuclease A (10 μg/mL) a 25 °C por uma hora. Então, as células foram analisadas com um citômetro de fluxo (BD Biosciences, EUA). Para o ensaio de apoptose, células BT-474 foram semeadas em placas de 96 poços de paredes brancas a uma densidade de 2 × 10⁴ células por poço e permitidas aderir por 18 h. As células foram tratadas com complexos ChrGO/adriamicina, trastuzumabe isolado ou em tratamento combinado por 24 h. Então, o meio de cultura foi descartado, e 100 µL de reagente Caspase-Glo® 3/7 foi adicionado a cada poço e incubado a RT por 2 h. Luminescência foi medida por um leitor de microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, EUA). Os resultados foram analisados por ANOVA unidirecional. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os estudos foram realizados de acordo com diretrizes e regulamentos relevantes.

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterização

A morfologia das folhas de GO sintetizadas foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A Figura 1a revela a distribuição uniforme de tamanho de nanofolhas de GO abaixo de 100 nm, com tamanho médio de aproximadamente 45 nm. A alta densidade eletrônica do GO exibiu melhor contraste comparado à quitosana, que é mal visível devido à sua baixa densidade eletrônica e natureza hidratada [21]. Devido à maior área de superfície, folhas de GO ou rGO nanoescalares têm sido amplamente usadas como transportadores de fármacos [22]. O padrão de difração eletrônica de área selecionada (SAED) na Fig. 1c exibe anéis concêntricos, que demonstram a presença de natureza policristalina correspondente ao óxido de grafeno [23].

a Imagem MET de baixa ampliação de nanofolhas de GO, b imagem MET de alta resolução de nanofolhas e c um padrão SAED típico de nanofolhas de GO

Para estabilizar nanofolhas de GO em solução fisiológica, nanofolhas de GO funcionalizadas com quitosana foram preparadas por redução assistida por micro-ondas usando um sistema de micro-ondas [24]. O GO-quitosana reduzido resultante (ChrGO) foi analisado por espectrometria UV-Vis. A Figura 2a mostra os espectros UV-Vis de GO e ChrGO. GO exibiu um pico de absorção agudo a 230 nm e um ombro a 300 nm, que é atribuído à transição π–π* de ligações aromáticas C=C e transição n–π* de ligações C=O, respectivamente [25, 26]. Após a quitosana ser enxertada no GO, o pico a 230 nm deslocou para o vermelho para 270 nm para ChrGO, e o ombro a 300 nm obviamente desapareceu, o que foi atribuído à restauração parcial da conjugação eletrônica entre os átomos de carbono aromáticos [27]. Uma solução preta de ChrGO sintetizado é mostrada na Fig. 2b, que indica a formação de óxido de grafeno parcialmente reduzido (p-rGO). Tanto as nanofolhas de GO quanto o ChrGO foram bem dispersas em H₂O desionizada. A estabilidade coloidal de GO ou derivados de GO em solução aquosa é muito importante para sua aplicação biomédica. Os resultados sugeriram que a quitosana foi conjugada com GO após a redução.

a Espectro UV-Vis das nanofolhas de GO e ChrGO em solução aquosa, b fotografias de nanofolhas de GO e ChrGO sintetizado

A espectroscopia FTIR foi realizada para caracterizar a estrutura de GO, quitosana e ChrGO (Fig. 3a). Os picos característicos de GO estavam situados em 3440 cm⁻¹ e 1376 cm⁻¹, correspondendo a ligações O–H e C–OH, respectivamente. O pico a 1072 cm⁻¹ foi atribuído à vibração de alongamento de C–N–C. Notavelmente, os picos de moléculas de quitosana a 2912 cm⁻¹ e 2848 cm⁻¹ foram atribuídos às vibrações de alongamento de CH₃– e –CH₂– [28, 29]. p-rGO funcionalizado com quitosana resultou em novas ligações, que levaram a novos picos nos espectros ChrGO. Há uma diminuição significativa nas intensidades da banda C=O a 1636 cm⁻¹ no ChrGO comparado àquele no GO, o que sugere que o processo de redução removeu os grupos contendo oxigênio do GO [30]. O espectro FTIR do ChrGO confirmou a conjugação bem-sucedida de quitosana no GO. Além disso, a espectroscopia Raman foi usada para caracterizar as propriedades eletrônicas e estrutura do grafeno. A banda G é atribuída aos fônons E_2g de domínios de carbono sp², enquanto a banda D é atribuída à vibração de domínios de átomos de carbono sp³ e átomos de carbono desordenados. A intensidade da banda D indica as características de desordem e defeitos em folhas de carbono [31]. A redução de nanofolhas de GO também foi analisada na razão de sinal da banda D versus G [32]. O espectro Raman representativo de GO mostra dois picos característicos da banda D (1341 cm⁻¹) e banda G (1591 cm⁻¹) na Fig. 3b. A mudança na intensidade relativa do valor I_D/I_G ilustra a mudança no estado de conjugação eletrônica do GO no processo de redução [33]. O deslocamento da banda D exibe funcionalização bem-sucedida de GO reduzido. O valor de I_D/I_G aumenta de 0,99 (GO) para 1,12 (ChrGO), o que é atribuído à introdução de defeitos sp3 após funcionalização e recuperação incompleta da estrutura característica do grafeno [34]. Esta observação está em boa concordância com relatório anterior e sugere a formação de grafeno funcionalizado com quitosana [16].

a Espectros FTIR de GO, ChrGO e quitosana, b Espectros Raman de GO e ChrGO

A composição de superfície do ChrGO foi confirmada por XPS. A varredura completa do espectro XPS do ChrGO mostra três picos a 284, 399 e 533 eV, que são atribuídos a C1s, N1s e O1s (Fig. 4a), respectivamente. A análise elementar relativa exibiu um aumento nos níveis de oxigênio e nitrogênio do ChrGO, com uma diminuição associada no conteúdo de carbono comparado ao GO. Os espectros C1s de alta resolução do ChrGO mostrados na Fig. 4b exibem quatro picos separados, correspondentes a ligações C–C ou C=C (sp², 284,7 eV), C-O (epóxido/hidroxilas, 286,4 eV), C=O (sp³, 288,2 eV) e O=C–O (carboxilatos, 289,1 eV). O aparecimento de um pico de amida no ChrGO fornece evidência para a funcionalização de quitosana no GO [35]. Os abundantes grupos funcionais hidrofílicos na superfície tornaram o ChrGO altamente solúvel em solução aquosa, o que é consistente com os resultados de FTIR. Biomoléculas como aminoácidos redutivos e ácido alfa-linolênico no extrato de levedura podem ter papel significativo na fabricação assistida por micro-ondas de ChrGO [20].

a Espectros XPS de varredura de GO e ChrGO, b espectros de alta resolução de C1s

O padrão de difração de raios X (XRD) de GO e ChrGO é apresentado na Fig. 5a. Nos espectros XRD de GO, o pico principal a 11,0° e pico fraco a 20,7° apresentam claramente a estrutura de grafite. O pico de difração característico a 11,0° correspondente ao plano (001) de GO, que mostra a síntese bem-sucedida de GO [36]. O pequeno inchaço entre 20° e 24° mostra os moietes grafiticos, que é atribuído ao grafite pristino não oxidado [37]. Com a funcionalização de quitosana, o pico (001) de GO desaparece, enquanto o pico de difração amplo a 21,4° torna-se proeminente. Este deslocamento pode ser atribuído à redução do GO, onde a redução faz o rGO empacotar mais firmemente que o GO. A reflexão (002) da amostra ChrGO é muito ampla, sugerindo que a amostra é muito mal ordenada ao longo da direção de empilhamento, que pode ser atribuída à redução incompleta do GO [33]. Os comportamentos de decomposição de GO, quitosana e ChrGO foram estudados por análise gravimétrica térmica (TGA) [38]. As curvas TGA de ChrGO, GO e quitosana são mostradas na Fig. 5b, que foram medidas em atmosfera de nitrogênio. GO começou a perder peso abaixo de 100 °C, que foi atribuído à eliminação de água livre adsorvida na estrutura empilhada [39]. O GO perdeu 42% de seu peso na faixa de 191–231 °C, que estava relacionado à decomposição de grupos contendo oxigênio lábil. A taxa de perda de peso do ChrGO a 100–250 °C é significativamente menor que GO, e é óbvio que ChrGO mostrou padrão de decomposição diferente comparado ao GO. A eliminação térmica de ChrGO e quitosana pura ocorreu de 250 a 440 °C, que está relacionada à despolimerização e pirólise de grupos funcionais mais estáveis, como unidades glicosídicas de quitosana e grupos carboxil [40]. Comparado com GO, ChrGO foi termicamente estável e deu uma perda de peso principal de 36% no primeiro estágio de decomposição a 250–440 °C, enquanto pouca perda de peso é exibida para GO. A perda de peso significativa na região de alta temperatura de 450–800 °C foi devida à degradação térmica do esqueleto de carbono, que pode ser atribuída aos resíduos de quitosana e biomoléculas do extrato de levedura como aminoácidos [41].

a Padrões XRD de GO e ChrGO, b Curvas TGA de GO, quitosana e ChrGO

A carga de superfície de GO e ChrGO foi medida por um instrumento Malvern Zeta Nano ZS-90, que é um parâmetro importante de estabilidade coloidal. A maior densidade de carga de superfície em nanofolhas de GO cria uma dispersão coloidal mais estável [42]. Como mostrado no Arquivo Adicional 1: Fig. S1, o potencial zeta de GO diminuiu monotonicamente de − 10,7 mV a pH 3 para − 35,5 mV a pH 11, o que confirmou a carga negativa na superfície das nanofolhas de GO. O valor de potencial zeta para ChrGO foi comparativamente menor que o potencial de GO em qualquer pH variando de 3 a 11. Nanofolhas ChrGO exibiram estabilidade em toda a faixa de valores de pH, enquanto coloides de GO reduzido foram relatados como menos estáveis em água desionizada devido ao aumento do empilhamento π–π em superfícies desoxigenadas [43]. Embora alguns grupos amina livres estivessem presentes na superfície de quitosana [44], um potencial zeta mais alto de ChrGO não foi alcançado. O valor menor de potencial zeta de ChrGO pode ser atribuído às abundantes moléculas de aminoácidos negativos do extrato de levedura, que aumentaram a estabilidade coloidal em solução fisiológica [20]. A superfície carregada negativamente do ChrGO os torna potencialmente aplicáveis para carregamento e entrega do fármaco.

Biocompatibilidade do ChrGO Sintetizado

A biocompatibilidade do ChrGO sintetizado é importante para suas aplicações em entrega de fármacos. A citotoxicidade celular de ChrGO e GO foi investigada por ensaio de citotoxicidade. Células Cos-7 e BT-474 foram incubadas na presença de ChrGO ou GO por 24 h. Os resultados de citotoxicidade celular são mostrados na Fig. 6. Pode-se concluir que ChrGO não mostrou citotoxicidade celular óbvia para células Cos-7 e BT-474. Mesmo a uma concentração de 100 μg/mL, a viabilidade celular foi acima de 90%. No entanto, GO exibiu citotoxicidade celular significativa de maneira dependente de dose, com apenas 73,0 ± 0,5% e 71,0 ± 0,5% de sobrevivência celular para Cos-7 e BT-474 a uma concentração de 100 μg/mL, respectivamente. Os resultados demonstraram que quitosana funcionalizada na superfície de GO mostrou baixa citotoxicidade e melhorou muito a biocompatibilidade. Funcionalização de superfície de GO com macromoléculas foi relatada para atenuar notavelmente seus efeitos citotóxicos [45]. Hu et al. relataram que soro fetal bovino em meio celular diminuiu marcadamente a citotoxicidade celular de GO em células de câncer de pulmão de não pequenas células A549 [46].

Biocompatibilidade de GO e ChrGO. Concentrações variadas de nanopartículas foram cultivadas com a células Cos-7 e b células BT-474, e seu efeito na viabilidade celular foi determinado

Carregamento e Liberação de Fármaco

A aplicação biomédica potencial do ChrGO como transportador de fármaco é medida pelo comportamento de carregamento e liberação de fármaco. As características estruturais de derivados de grafeno são altamente eficazes para entrega de fármacos aromáticos devido à sua área de superfície específica muito grande. Adriamicina é um dos quimioterápicos primários contra uma variedade de malignidades hematológicas e tumores sólidos e é frequentemente usada como fármaco modelo para avaliar sistemas de entrega de fármacos de derivados de grafeno [47]. A capacidade de carregamento de adriamicina nas nanofolhas ChrGO foi verificada pelo pico característico de absorbância UV-Vis de adriamicina a 490 nm. Como esperado, a eficiência máxima de carregamento de adriamicina ligada nas nanofolhas ChrGO foi tão alta quanto 169,8%, que foi parcialmente atribuída à grande área de superfície das nanofolhas ChrGO. Os nanocompósitos ChrGO/adriamicina carregados com adriamicina foram facilmente dispersos em um tampão fisiológico, exibindo uma solução transparente com cor levemente avermelhada.

Para explorar o perfil de liberação de adriamicina dos complexos ChrGO/adriamicina, diferentes valores de pH de PBS foram introduzidos para imitar ambientes de células tumorais. Arquivo Adicional 1: Fig. S2 mostra os perfis de liberação cumulativa de adriamicina do ChrGO/adriamicina a pH 5 e 7,4. A adriamicina liberada do ChrGO/adriamicina foi caracterizada por uma liberação rápida inicial e então um estágio de liberação mais lenta em solução PBS pH 5,0. A liberação cumulativa de adriamicina foi 6,5% nas primeiras 3 h e então exibiu um aumento lento para 26,7% em 96 h a pH 5,0. Em contraste, a porcentagem de adriamicina do ChrGO/adriamicina aumentou mais lentamente e foi menor a pH 7,4, exibindo uma porcentagem de liberação de adriamicina de 2,5% nas primeiras 3 h a 7,4% em 96 h. Estudos prévios mostraram perfis de liberação de fármacos de GO funcionalizado muito lentamente em meio a pH 7,4 [48]. A protonação de grupos carboxil no ChrGO diminui empilhamento π–π, ligação H e interações eletrostáticas entre adriamicina e ChrGO, facilitando a liberação de adriamicina no meio ácido [49]. A sensibilidade ao pH dá ao ChrGO/adriamicina potencial para entrega de fármaco específica de sítio, que subsequentemente aumenta a citotoxicidade em células tumorais.

Eficácia Terapêutica dos Complexos ChrGO/Adriamicina

A eficácia terapêutica dos complexos ChrGO/adriamicina dentro de células cancerígenas de mama BT-474 superexpressoras de HER2 foi investigada pelo ensaio de inibição de proliferação. A superexpressão do receptor HER2 tem papel chave na transformação de células de câncer de mama BT-474. Tratamento com trastuzumabe isolado, um anticorpo monoclonal anti-HER2, resulta em inibição significativa de crescimento de células BT-474 [50]. Como mostrado na Fig. 7a, após tratamento com complexos ChrGO/adriamicina, a viabilidade celular de células BT-474 diminuiu significativamente, demonstrando efeito tóxico dependente de dosagem. Além disso, quando comparado à adriamicina livre, os complexos ChrGO/adriamicina demonstraram desempenho menos eficaz em matar células BT-474, que foi atribuído à difusão gradual de adriamicina carregada em vez de tratamento direto com adriamicina livre [51]. No entanto, a eficácia terapêutica dos complexos ChrGO/adriamicina foi próxima à da adriamicina livre à medida que sua concentração de complexos ChrGO/adriamicina aumentou, o que pode ser explicado pela liberação sustentada de adriamicina do transportador ChrGO.

a Viabilidade celular in vitro de células BT-474 incubadas com concentrações de adriamicina livre e adriamicina carregada em complexos ChrGO/adriamicina, b citotoxicidade de complexos ChrGO/adriamicina (5 μg/mL) em combinação com trastuzumabe (5 μg/mL) em células BT-474. Adria: adriamicina. **p < 0,01, ***p < 0,001

Para estudar se trastuzumabe, um anticorpo monoclonal anti-HER2, poderia melhorar a atividade antitumoral de quantidades equivalentes de adriamicina carregada no ChrGO, células BT-474 foram tratadas com trastuzumabe isolado ou em combinação com ChrGO/adriamicina. Tratamento com trastuzumabe isolado produziu inibição significativa de proliferação de BT-474, que é consistente com relatório anterior [52]. A terapia combinada com trastuzumabe e ChrGO/adriamicina resultou em efeito de inibição de crescimento celular aumentado, como mostrado por uma redução de 88,5% comparada com redução de 54,5% com trastuzumabe isolado (5 μg/mL) e 59,5% com ChrGO/adriamicina equivalente isolado (5 μg/mL) versus controle negativo (Fig. 7b). Os resultados sugerem que o sistema ChrGO pode ser efetivamente usado para desenvolver compostos para terapias combinadas, e o tratamento combinado de ChrGO/adriamicina e trastuzumabe resultou em redução modesta, mas significativa, de viabilidade celular comparada a cada fármaco isolado.

Análise de Ciclo Celular e Apoptose

Para determinar se os complexos ChrGO/adriamicina têm efeitos na progressão do ciclo celular, um ensaio de ciclo celular de complexos ChrGO/adriamicina isolados ou em tratamento combinado com trastuzumabe foi realizado em células BT474. Como mostrado na Fig. 8a, análise de citometria de fluxo revelou que trastuzumabe isolado aumentou a população celular na fase G0/G1. Tratamento com ChrGO/adriamicina isolado mediou redução significativa no número de células G0/G1 e acúmulo na fase S e fase G2/M comparado a células controle. Além disso, ChrGO/adriamicina combinado com trastuzumabe mediou parada na fase S, acompanhada por diminuição significativa no número de células na fase G0/G1. Enquanto ChrGO/adriamicina é mais ativo na fase S do ciclo celular, tratamento com ChrGO/adriamicina com trastuzumabe pode causar aumento na fase G0/G1 comparado a ChrGO/adriamicina isolado. Relatório anterior mostrou que trastuzumabe pode causar parada celular na fase G1 [53]. Adriamicina inibe proliferação celular e replicação de DNA, levando finalmente à parada do ciclo celular [54].

a Análise de ciclo celular após tratamento com ChrGO/adriamicina isolado ou em combinação com trastuzumabe em células BT-474, b efeito de ChrGO/adriamicina (5 μg/mL) mais trastuzumabe (5 μg/mL) na indução de apoptose em células BT-474. Adria: adriamicina. **p < 0,01, ***p < 0,001

Para avaliar os efeitos de ChrGO/adriamicina em moléculas apoptóticas, células BT-474 foram tratadas por 48 h com ChrGO/adriamicina, trastuzumabe, ou tratamento combinacional de ambos agentes. Para visualização de apoptose, atividade de caspase 3/7 tem sido extensivamente usada como marcador específico de apoptose devido à sua atividade relacionada ao processo de apoptose [55]. Como observado na Fig. 8b, comparado ao controle negativo, tratamento com ChrGO/adriamicina (5 μg/mL) isolado aumentou significativamente a atividade de caspase 3/7. No entanto, trastuzumabe (5 μg/mL) isolado não aumentou significativamente a expressão de caspase 3/7, sugerindo que trastuzumabe não induz apoptose. Em contraste, tratamento com ChrGO/adriamicina (5 μg/mL) mais trastuzumabe (5 μg/mL) aumentou significativamente a atividade de caspase 3/7 comparado àquele com cada fármaco isolado. A terapia de duplo alvo mostrou maior apoptose, indicando eficácia terapêutica superior devido à presença de diferentes mecanismos de ação. Similar a outros estudos, adriamicina amplifica a resposta apoptótica em células cancerígenas superexpressoras de HER2 [56]. Em conclusão, ChrGO/adriamicina combinado com trastuzumabe induz parada do ciclo celular e apoptose, que finalmente resulta em morte celular aumentada.

Conclusões

No presente trabalho, as nanofolhas de óxido de grafeno funcionalizadas com quitosana foram estruturadas com redução assistida por micro-ondas, que demonstraram biocompatibilidade e boa estabilidade de dispersão. Os nanocompósitos preparados mostraram alta eficiência de encapsulamento e entrega de fármaco. As nanofolhas ChrGO/adriamicina exibiram inibição significativa de crescimento de BT-474 de maneira dependente de dose. O tratamento combinado de ChrGO/adriamicina e trastuzumabe resultou em eficácia terapêutica superior em células BT-474 comparado àquele com cada agente isolado. Os resultados são favoráveis para o desenvolvimento de nanotransportadores intracelulares para entregar fármacos de maneira controlada, que se espera melhorar o efeito terapêutico em terapias de câncer superexpressoras de HER2.