Um novo imunossensor magnetoelástico para detecção ultrassensível do antígeno carcinoembrionário

Resumo

Um novo imunossensor sem fio é desenvolvido para a detecção ultrassensível de antígeno carcinoembrionário. A dimensão ótima dos microchips, como unidades magnetoelásticas sensíveis, foi avaliada por simulação e experimentos. Os efeitos exclusivos da amplificação do sinal e da biocompatibilidade das partículas de ouro contribuem para a estabilidade e sensibilidade do sensor. Além disso, para aumentar a sensibilidade, as concentrações de trabalho de anticorpo e BSA são selecionadas para serem 50 mg / mL e 0,1%, respectivamente. A imagem do microscópio de força atômica lança luz sobre a análise biológica. O imunossensor nanomagnetoelástico exibe uma resposta linear ao logaritmo das concentrações do antígeno carcinoembriônico (CEA) variando de 0,1 a 100 ng / mL, com um limite de detecção de 2,5 pg / mL. O biossensor projetado tem méritos de excelente estabilidade e sensibilidade em relação ao CEA.

Histórico

O câncer é uma das doenças fatais no mundo [1]. O câncer em pacientes pode ser detectado clinicamente quando a concentração dos biomarcadores tumorais atinge uma determinada quantidade no soro [2]. Portanto, é absolutamente necessário obter ensaios sensíveis, rápidos e precisos para marcadores tumorais, que forneçam uma estratégia eficaz para o diagnóstico do câncer [3]. O antígeno carcinoembrionário (CEA) pertence a uma família de glicoproteínas de superfície celular com peso molecular de 180∼200 kDa. Foi descoberto pela primeira vez em tecido de câncer de cólon humano em 1965 [4, 5]. O CEA geralmente se apresenta em níveis muito baixos (0 ~ 5 ng / mL) no sangue de adultos saudáveis [6]. Geralmente, um nível anormal de CEA pode ser considerado um sinal de câncer, como carcinoma gástrico [7], carcinoma pancreático [8], carcinoma colorretal [9], carcinoma de pulmão [10] e carcinoma de mama [11]. Isso significa que o CEA pode ser usado como um biomarcador tumoral. O monitoramento do nível de CEA no sangue pode ser utilizado para pré-alertar, rastrear e diagnosticar cânceres. Enquanto isso, o CEA também pode ser usado para pesquisas de acompanhamento daqueles que foram tratados clinicamente. A sensibilidade do CEA à recorrência do tumor é superior a 80%, o que é anterior ao exame clínico e patológico. Assim, a observação contínua do CEA fornece uma base importante para o diagnóstico e prognóstico dos efeitos curativos [12].

Os biossensores respondem a reconhecimentos específicos de sinais mensuráveis de saída molecular biológica por alguma disciplina, permitindo respostas rápidas, alta sensibilidade e baixo custo. Recentemente, biossensores imunológicos têm sido intensamente estudados, como o imunoensaio enzimético [13], o fluorimunoensaio [14] e o imunoensaio eletroquímico [15,16,17]. Devido à sua excelente especificidade e sensibilidade, os imunossensores fornecem meios promissores para a análise de biomarcadores tumorais, mesmo quando os compostos-alvo estão em concentrações muito baixas [18,19,20,21].

A nanotecnologia está fornecendo novos métodos para a aplicação de nanopartículas (NPs) em tecnologia de biossensor. Os NPs de metal exibem muitas características especiais, que fornecem plataformas notáveis para a interface de elementos de bio-reconhecimento [22, 23]. Imunoensaios baseados em NPs têm atraído grande atenção dos pesquisadores [24,25,26]. Os biossensores magnetoelásticos não são afetados pela temperatura ambiente e pH com alta sensibilidade de resposta. Portanto, neste estudo, propomos um método de imunoensaio magnetoelástico baseado em nanopartículas de ouro (AuNPs) e microchips magnetoelásticos. Um imunossensor foi desenvolvido com sucesso para detectar biomarcadores CEA.

Resultados e discussão

Em vista da forma em forma de fita do microchip magnetoelástico (ME), a permeabilidade magnética é maior ao longo de seu comprimento [27]. Os resultados preliminares mostraram que a largura e a espessura ótimas do chip ME foram de 1 mm e 28 μm, respectivamente [28]. A simulação foi usada para otimizar o comprimento do chip, conforme demonstrado na Fig. 1b.

Comprimento ideal do chip ME. a O deslocamento relativo é diferente com a variação do comprimento. b A simulação foi usada para otimizar o comprimento do chip

O deslocamento relativo é diferente com a variação de comprimento na Fig. 1a. O deslocamento relativo máximo é obtido quando o comprimento é de 6 mm na análise modal de primeira ordem. Significa a sensibilidade teoricamente mais alta. Portanto, as dimensões ótimas do chip foram projetadas como 6 mm × 1 mm × 28 μm neste artigo.

Um diagrama esquemático do biossensor Nano-ME é ilustrado na Fig. 2. Em primeiro lugar, o chip Nano-ME foi quimicamente tratado por cisteína para fabricar os filmes moleculares de automontagem (SAM) na superfície, como uma camada funcional para imobilização de CEAAb. Em seguida, a albumina de soro bovino (BSA) promove o desempenho do CEAAb, reduzindo a ligação não específica e o impedimento estérico. Imagens de microscópio de força atômica (AFM) foram realizadas para observar a morfologia da superfície do chip. Conforme indicado na Fig. 3a, a espessura da camada de SAM era de 120 nm. A imagem na Fig. 3b revela que o CEAAb foi covalentemente ligado à camada de SAM com rugosidade crescente. Foi claramente mostrado na Fig. 3c que o CEA foi especificamente reconhecido e efetivamente combinado, com uma altura aproximada de 200 nm e tamanho maior.

Esquema do biossensor Nano-ME construído

Imagens AFM da camada SAM ( a ) Camada CEAAb-SAM ( b ) Complexo de CEA-CEAAb ( c )

Em uma determinada dimensão do chip, a concentração do anticorpo é um fator importante relacionado à sensibilidade do imunossensor. Portanto, foi necessário avaliar os sinais de resposta de diferentes concentrações de CEAAb (20, 50, 70 e 100 μg / mL, conforme mostrado na Fig. 4a). Os resultados mostram que a resposta ótima foi obtida em aproximadamente 448 Hz (Fig. 4b), quando a concentração de CEAAb é de 50 μg / mL. Se a concentração de CEAAb aumentasse para 70 μg / mL, a resposta começava a declinar devido ao impedimento estérico e à repulsão eletrostática [29].

a A curva de resposta de frequência versus CEAAb. b Histograma de freqüência

Em princípio, o CEA é especificamente reconhecido com o anticorpo, o que leva à diminuição da frequência de resposta. A Figura 5a mostra a curva de resposta em tempo real do imunossensor em relação ao CEA. Enquanto isso, adquirimos uma curva de ajuste linear na Fig. 5b.

Resposta em tempo real ( a ) e curvas de ajuste ( b ) do biossensor versus CEA

Geralmente, a resposta estável do sensor foi alcançada em 40 min (Fig. 5a). A mudança da frequência de ressonância foi registrada com as concentrações correspondentes de CEA. A mudança de Hz é linearmente dependente do logaritmo das concentrações de CEA variando de 0,1 a 100 ng / mL ( R ² =0,9688), com o limite de detecção de 2,5 pg / mL (Fig. 5b). Até onde sabemos, a faixa linear e o limite de detecção são obviamente menores do que os dos métodos anteriores [28]. Os resultados demonstraram que um método sem fio e altamente sensível ao CEA foi estabelecido com sucesso.

Conclusões

Nesta contribuição, um imunossensor Nano-ME para detecção altamente sensível de CEA foi desenvolvido com sucesso com base no chip ME. AuNPs e BSA melhoraram efetivamente a sensibilidade e estabilidade. O imunossensor Nano-ME proposto exibe amplas faixas de determinação de CEA de 0,1 a 100 ng / mL com um baixo limite de detecção de 2,5 pg / mL. Portanto, a determinação precisa de CEA pelo imunossensor conforme preparado foi alcançada com resultados satisfatórios. Beneficiando-se de sua especificidade, simplicidade e reprodutibilidade, a plataforma proposta apresenta uma aplicação promissora no desenvolvimento da detecção não invasiva do câncer.

Métodos

Sob o campo magnético variável no tempo, o microchip ME vibra ao longo do comprimento. No campo magnético modulado para fazer vibrar o microchip ME, a energia do campo magnético é convertida em energia potencial elástica para atingir o valor máximo. Devido ao formato do chip sensor em forma de fita, a permeabilidade magnética é maior ao longo de seu comprimento; portanto, um campo magnético incidente gera vibrações longitudinais no sensor de quase qualquer orientação, exceto normal para o plano basal do sensor. Dado pela Eq. (1):
$$ {f} _0 =\ frac {1} {2L} \ sqrt {\ frac {E} {\ rho \ left (1 - {\ nu} ^ 2 \ right)}} $$ (1)
onde E denota módulo de elasticidade, v é o coeficiente de Poisson, ρ é a densidade do material do sensor, e L é a dimensão longitudinal do chip. Quando a temperatura de teste, umidade e outros parâmetros ambientais são constantes, a mudança de frequência de ressonância do sensor magnetoelástico depende sensivelmente apenas da mudança de massa (△ m ) em sua superfície, conforme fornecido pela Eq. (2)
$$ \ frac {\ triangle f} {\ triangle m} =- \ frac {f_0} {2M} $$ (2)
Com base na Eq. (2), a mudança da frequência de ressonância é proporcional à quantidade de CEA. Portanto, as concentrações de CEA podem ser alcançadas pela mudança de frequência, onde f ₀ é a frequência de ressonância inicial, M é a massa inicial, △ m é a mudança em massa, e △ f é a mudança na frequência de ressonância do sensor. A Equação 2 mostra que a sensibilidade do sensor (△ f / △ m ) é inversamente proporcional à massa magnetoelástica inicial (M) do sensor. Sensores com dimensões físicas menores têm uma massa inicial menor, resultando em maior sensibilidade. O sinal negativo na equação representa uma diminuição na frequência (△ f ) a uma adição de massa não magnetoelástica (△ m ) no sensor. Conseqüentemente, a ligação dos organismos-alvo à superfície do biossensor causa um aumento de massa com uma diminuição correspondente na frequência de ressonância fundamental.

Bases magnetoelásticas da liga Metglas 2826MB (Fe40Ni38Mo4B18) foram processadas pela Honey well Corporation (Morristown, NJ, EUA). CEA, anticorpo CEA, albumina de soro bovino (BSA, 99%) e solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH =7,4) foram adquiridos na Sangon (Shanghai, China). Acetona, isopropanol, etanol, 1-etil-3-carbodiimida (EDC) e N -hidroxissulfosuccinimida (NHS) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, EUA). Todos os outros reagentes foram de grau analítico. A água ultrapura foi obtida no sistema Mill-Q (Milli-pore, EUA). AFM Park System (ND-100, Coreia), Plasma (P3C, Shanghai, China), ohmímetro Gauss (GM500), ZNB Vector Network Analyzer (R&S, Alemanha), cortador a laser (AV3620A, Qingdao, China) e medidor HT20 gauss (Hengtong, Shanghai) foram usados.

A base de liga ME foi cortada a laser em microchips de 6 mm × 1 mm × 28 μm, depois limpa por ultrassom com acetona, isopropanol, etanol e água deionizada por 5 min e seca com nitrogênio. A ativação da modificação da superfície dos microchips limpos é processada por um método de plasma. Ambos os lados do microchip foram pulverizados com camada de cromo (100 nm), seguido por revestimento com camada de AuNP (40 nm) para fabricar chips Nano-ME. O chip Nano-ME lida com plasma com oxigênio de alta pureza (0,9999) e então imerso em solução de cisteamina 40 mM e mantido por 12 h em temperatura ambiente. Depois disso, os chips Nano-ME foram modificados biologicamente e incubados com diferentes concentrações de CEAAb por 1 h a 37 ° C na presença de 1-etil-3-carbodiimida (EDC) e N -hidroxissulfosuccinimida (NHS). O CEAAb foi inicialmente ativado com 10 mg / mL de EDC e 10 mg / mL de NHS. Finalmente, o chip Nano-ME, modificado por CEAAb, foi posteriormente conduzido com BSA 0,1% por 30 min.

O biossensor Nano-ME foi construído da seguinte forma:um tubo de vidro foi envolvido pela bobina e conectado a um analisador de rede vetorial. Enquanto isso, adicionar campo magnético forneceu corrente alternada para fazer a bobina produzir campo magnético alternado. A frequência ressonante do biossensor Nano-ME pode ser obtida por um analisador de rede vetorial. Diferentes concentrações de CEA (0–100 ng / mL) foram adicionadas ao tubo de ensaio, e a mudança de frequência foi registrada a cada 5 minutos até 40 minutos. Depois disso, o chip Nano-ME foi enxaguado com PBS para caracterização de AFM.

Abreviações

AFM:: Microscópio de força atômica
AuNPs:: Nanopartículas de ouro
BSA:: Albumina sérica bovina
CEA:: Antígeno Carcinoembrionário
CEAAb:: Anticorpo CEA
EDC:: 1-Etil-3-carbodiimida
Hz:: Frequência
ME:: Magnetoelástico
NHS:: N -Hidroxissulfosuccinimida
PBS:: Salina tamponada com fosfato
SAM:: Molecular de automontagem

Preparação e caracterização de transistores de película fina CuAlO2 do tipo p nanocristalino processado em solução Síntese fácil e atividade fotocatalítica de luz visível aprimorada de novos compostos de heterojunção p-Ag3PO4 / n-BiFeO3 para degradação de corante

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias