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Potencial antioxidante de Artemisia capillaris, Portulaca oleracea e Extratos de Prunella vulgaris para Biofabricação de Nanopartículas de Ouro e Avaliação de Citotoxicidade

Resumo


Três extratos vegetais aquosos ( Artemisia capillaris , Portulaca oleracea e Prunella vulgaris ) foram selecionados para a biofabricação de nanopartículas de ouro. As atividades antioxidantes (ou seja, atividade de eliminação de radicais livres, conteúdo fenólico total e poder redutor) dos extratos e como essas atividades afetaram a biofabricação de nanopartículas de ouro foram investigadas. P. vulgares exerceu a maior atividade antioxidante, seguido por A. capillaris e então P. olerácea . P. vulgares foi o agente redutor mais eficiente no processo de biofabricação. Nanopartículas de ouro biofabricadas por P. vulgares (PV-AuNPs) tinham uma ressonância plasmônica de superfície máxima de 530 nm com formas diversas. A análise de difração de raios-X de alta resolução mostrou que os PV-AuNPs tinham uma estrutura cúbica centrada na face. O rendimento da reação foi estimado em 99,3% por espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado. O tamanho hidrodinâmico foi determinado como sendo 45 ± 2 nm com um potencial zeta de - 13,99 mV. Os PV-AuNPs exerceram atividade antioxidante dependente da dose. Notavelmente, a maior citotoxicidade dos PV-AuNPs foi observada contra células de adenocarcinoma colorretal humano na ausência de soro fetal bovino, enquanto para células de adenocarcinoma ductal de pâncreas humano, a maior citotoxicidade foi observada na presença de soro fetal bovino. Este resultado demonstra que P. vulgares extrato foi um agente redutor eficiente para biofabricação de nanopartículas de ouro exercendo citotoxicidade contra células cancerosas.

Introdução


O interesse por nanopartículas metálicas tem aumentado muito devido à sua ampla gama de aplicações [1]. Em particular, nanopartículas de ouro (AuNPs) têm uma infinidade de aplicações valiosas como veículos de entrega de drogas / genes, catalisadores, agentes de imagem e sensores químicos / biológicos [2]. Uma variedade de métodos químicos e físicos, como pulverização catódica, micela reversa e redução química, estão disponíveis para a fabricação de AuNPs. No entanto, esses métodos são limitados por questões relacionadas ao seu custo e potencial toxicidade. O uso de extratos vegetais na biofabricação (ou síntese verde) de AuNPs apresenta vantagens em relação aos demais métodos, o que o torna uma alternativa extremamente promissora [2]. O processo de biofabricação é econômico e fácil de aumentar. Ele utiliza materiais ecológicos e exibe atividades sinérgicas ao combinar as atividades de dois materiais (AuNPs e extratos vegetais). A biofabricação não introduz agentes redutores químicos nocivos durante a síntese, o que torna o processo totalmente verde. Além disso, esse recurso aumenta a biocompatibilidade dos AuNPs resultantes e aumenta sua estabilidade. Vários fitoquímicos derivados de extratos de plantas são empregados não apenas como agentes redutores, mas também como agentes de proteção e estabilização [3].

Artemisia capillaris pertence ao gênero Artemisia , que é um dos maiores gêneros da família Asteraceae [4]. Desde os tempos antigos, A. capillaris tem sido amplamente utilizado como medicamento fitoterápico devido aos seus diversos efeitos farmacológicos, que incluem atividades antibacteriana, antiinflamatória, antioxidante e hepatoprotetora. Estudos anteriores atribuíram esses efeitos aos constituintes ativos de A. capillaris , incluindo capilina, capileno, escoparona e β-sitosterol [4,5,6]. Portulaca oleracea , uma suculenta anual da família Portulacaceae, exibe vários efeitos farmacológicos, como atividades antibacteriana, antifúngica, antiinflamatória, antioxidante e antiulcerogênica. Foi demonstrado que esses efeitos resultam de vários componentes ativos, incluindo alcalóides, ácidos graxos, flavonóides, polissacarídeos e terpenóides [7, 8]. Prunella vulgaris é uma planta herbácea perene da família Lamiaceae. Vários estudos demonstraram as atividades antiviral [9], anticâncer [10], imunomoduladora [11], antioxidante [11, 12] e hipoglicêmica [13] de P. vulgares . Os principais componentes ativos que contribuem para esses efeitos são ácidos orgânicos, ácidos fenólicos e triterpenóides, incluindo ácido linolênico, ácido palmítico, cis- e trans- ácidos cafeico, ácido rosmarínico, ácido oleanólico e ácido ursólico [14].

Muitas vezes existe uma grande lacuna entre os resultados in vitro e in vivo na pesquisa de nanopartículas devido à “coroa da proteína”. Ao entrar em um ambiente biológico, a superfície das nanopartículas torna-se recoberta por um revestimento de diversas proteínas, que é denominado proteína corona [15]. As nanopartículas revestidas por corona de proteína entram na célula e influenciam a captação celular, citotoxicidade, biodistribuição, excreção, resposta celular, liberação do fármaco e eficiência terapêutica [16]. Curiosamente, as propriedades físico-químicas das nanopartículas metálicas, como sua forma, tamanho, carga superficial e rugosidade da superfície, afetam profundamente a adsorção de proteínas séricas ao formar a coroa protéica [17]. Shannahan e colaboradores relataram que a formação de uma coroa de proteína em nanopartículas de prata (AgNPs) medeia a toxicidade celular contra células epiteliais pulmonares de ratos e células endoteliais aórticas de ratos via receptores scavenger [18]. A albumina sérica afeta os AgNPs coloidais incorporados em hidrogel, reduzindo seus efeitos antibacterianos e citotóxicos [19].

No presente relatório, avaliamos as atividades antioxidantes dos extratos aquosos de A. capillaris , P. olerácea , e P. vulgares . Posteriormente, a biofabricação de AuNPs usando esses três extratos foi conduzida para investigar como as atividades antioxidantes dos extratos afetam a cor da solução coloidal e a forma da banda de ressonância plasmônica de superfície (SPR) dos AuNPs. Doravante, os AuNPs biofabricados são nomeados de acordo com o nome científico de cada planta:os AuNPs obtidos usando o extrato de A. capillaris são referidos como AC-AuNPs, os AuNPs obtidos usando o extrato de P. olerácea são referidos como PO-AuNPs, e os AuNPs obtidos usando o extrato de P. vulgares são referidos como PV-AuNPs. A atividade antioxidante do P. vulgares extrato foi o mais alto; assim, caracterizamos os PV-AuNPs por vários métodos espectroscópicos e microscópicos, incluindo espectrofotometria UV-visível, microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HR-TEM), difração de raios-X de alta resolução (HR-XRD) e plasma indutivamente acoplado espectroscopia de emissão óptica (ICP-OES). O tamanho hidrodinâmico dos PV-AuNPs foi medido por espalhamento dinâmico de luz (DLS) junto com o potencial zeta. Além disso, examinamos a atividade antioxidante dos PV-AuNPs monitorando a atividade de eliminação do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). A citotoxicidade contra três células cancerosas foi investigada por um ensaio de tetrazólio solúvel em água (WST) na presença ou ausência de soro bovino fetal (FBS) em cultura de células. Foram utilizadas as seguintes células cancerosas:adenocarcinoma colorretal humano (HT-29), célula de adenocarcinoma de mama humano (MDA-MB-231) e célula de adenocarcinoma ductal de pâncreas humano (PANC-1).

Métodos

Materiais


Cloreto de potássio ouro (III) (KAuCl 4 ), hidroxitolueno butilado (BHT), fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, ácido tricloroacético, reagente de fenol de Folin-Ciocalteu, carbonato de sódio, ácido gálico, tartarato de potássio de sódio, bicarbonato de sódio, ácido sulfúrico, 2,2′-azino-bis- Ido 3-etilbenztiazolina-6-sulfico (ABTS), persulfato de potsio e d - (+) - glucose foram adquiridos Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O DPPH foi adquirido da Alfa Aesar (Ward Hill, MA, EUA). O hexacianoferrato de potássio (III) foi obtido na Wako (Osaka, Japão). Sulfato de sódio, heptamolibdato tetra-hidratado de hexa-amônio e arseniato dissódico hepta-hidratado foram adquiridos em Junsei (Tóquio, Japão). O cloreto de ferro (III) foi obtido da Duksan (Gyeonggi, República da Coréia), e o sulfato de cobre pentahidratado foi obtido da Deajeng (Gyeonggi, República da Coréia). Os outros reagentes eram de qualidade analítica e utilizados conforme recebidos. Meio Eagle modificado por Dulbecco com alto teor de glicose (DMEM), penicilina-estreptomicina (10.000 U / mL), tripsina-EDTA (0,5%, sem vermelho de fenol) e solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram adquiridos da Gibco (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). O FBS foi obtido da GE Healthcare HyClone ™ (Victoria, Austrália).

Instrumentos


Um espectrofotômetro Shimadzu UV-2600 foi utilizado para adquirir espectros de UV-visível e observar SPR (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). Informações sobre o tamanho e a forma das partículas foram obtidas a partir de imagens HR-TEM. Para adquirir imagens HR-TEM, foi utilizado um instrumento JEM-2100F operando a 200 kV (JEOL, Tóquio, Japão). Uma solução coloidal de PV-AuNPs foi carregada em uma grade de cobre revestida com carbono (carbono tipo B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, EUA). A grelha carregada com a amostra foi seca ao ar à temperatura ambiente. Um difratômetro Rigaku Miniflex (40 kV, 30 mA) foi usado para adquirir o padrão HR-XRD com uma fonte de radiação CuKα ( λ =1,54056 Å) na faixa de 10º a 80 ° (2 θ escala) (Rigaku, Japão). Um liofilizador FD5505 foi utilizado para preparar amostras em pó para análise HR-XRD (Il Shin Bio, Seul, República da Coréia). Para estimar o rendimento da reação, ICP-OES foi conduzido em um instrumento Perkin Elmer Optima 8300 (Waltham, MA, EUA). A centrifugação foi conduzida (18.500 g força, 7 h, 18 ° C), e o sobrenadante foi recolhido. Duas amostras, isto é, a solução coloidal de PV-AuNP e o sobrenadante, foram submetidas à análise de ICP-OES. Uma centrífuga Eppendorf 5424R foi utilizada para centrifugação (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha). O tamanho hidrodinâmico e os potenciais zeta foram medidos pelo analisador NanoBrook 90 Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, EUA).

Preparação dos Extratos Aquosos de A. capillaris , P. olerácea , e P. vulgares


As partes aéreas secas de P. vulgares e A. capillaris , incluindo as flores e folhas, foram adquiridos da Omniherb (Daegu, República da Coréia) e P. olerácea foi obtido da Handsherb (Youngchun, República da Coréia). Os extratos aquosos das partes aéreas de cada planta foram preparados por sonicação (WUC-A22H, Daihan Scientific Co. Ltd., República da Coréia). Para cada planta, 100 g da planta picada foram extraídos três vezes com água desionizada (1000 mL). O procedimento de extração compreendeu sonication das plantas a 25 ° C por 3 h. O extrato aquoso foi filtrado e o filtrado foi liofilizado em um liofilizador a vácuo (FD8518, IlShinBioBase Co. Ltd., República da Coréia). Finalmente, o pó do extrato de cada planta foi obtido e armazenado a -20 ° C antes do uso.

Atividade de eliminação radical DPPH


Em cada poço de uma microplaca de 96 poços, 20 μL de cada extrato foram misturados com uma solução radical DPPH em etanol (0,1 mM, 180 μL) para dar várias concentrações finais do extrato (31,25 μg / mL, 62,5 μg / mL, 125 μg / mL e 250 μg / mL). A placa foi incubada no escuro por 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, a absorbância de cada poço foi medida a 517 nm usando um leitor de detecção múltipla (Synergy HT, BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). O BHT foi usado como padrão. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. A absorbância dos AuNPs foi subtraída da absorbância de cada amostra para eliminar a absorbância intrínseca dos AuNPs em 517 nm.

Atividade de eliminação radical ABTS


O cátion radical ABTS foi preparado pela reação de 1:1 ( v / v ) mistura de uma solução de ABTS 7,4 mM e uma solução de persulfato de potássio 2,6 mM por 24 h no escuro à temperatura ambiente. A solução do radical ABTS foi diluída com etanol para uma absorvância de 0,74 a 730 nm para as medições. Em cada poço de uma microplaca de 96 poços, a solução radical ABTS em etanol (180 μL) foi adicionada a 20 μL de cada extrato (concentrações finais do extrato, 15,63 μg / mL, 31,25 μg / mL, 62,5 μg / mL, e 125 μg / mL). Após incubação por 10 min no escuro à temperatura ambiente, a absorbância de cada poço foi medida a 730 nm usando um leitor de detecção múltipla. Uma solução de vitamina C foi preparada como padrão. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Potência de redução


Volumes iguais (500 μL) de várias concentrações dos extratos foram misturados com tampão de fosfato 0,2 M (pH 6,6, 500 μL) e 1% de hexacianoferrato de potássio (III) (500 μL). As concentrações finais dos extratos foram 52,1 μg / mL, 104,2 μg / mL, 208,3 μg / mL e 416,7 μg / mL. Cada mistura foi incubada a 50 ° C. Após 20 min, ácido tricloroacético (10%, 500 μL) foi adicionado à mistura, seguido por centrifugação a 3400 g força por 10 min. Em seguida, uma solução de cloreto de ferro (0,1%, 100 μL) foi adicionada a 500 μL do sobrenadante. Após 10 min, a absorbância da mistura de reação foi medida a 700 nm usando um leitor de detecção múltipla. O BHT foi usado como padrão. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Conteúdo fenólico total


A relação entre a atividade antioxidante e o teor de compostos fenólicos foi investigada. Vinte microlitros do extrato foram misturados com 100 μL de reagente de Folin-Ciocalteu (diluído 10 vezes com água desionizada) e 80 μL de carbonato de sódio (7,5%, w / v ) A reação foi realizada no escuro à temperatura ambiente. Após 30 min, a absorbância a 765 nm foi medida, e o conteúdo fenólico total foi determinado usando uma curva de calibração construída com ácido gálico. Todas as determinações foram realizadas em triplicado.

Biofabricação de PO-AuNPs, AC-AuNPs e PV-AuNPs


Duas soluções estoque foram preparadas antes das reações de biofabricação:cloreto de potássio ouro (III) (10 mM) e o extrato (2%, w / v ) A solução estoque de cada extrato (2%) foi centrifugada (18.500 g força, 30 min, 18 ° C). O sobrenadante foi coletado e utilizado para a reação de biofabricação. As concentrações finais foram ajustadas para 0,5 mM de cloreto de ouro de potássio (III) e 0,05% ( w / v ) extrair em um frasco de vidro de 2 mL para a biofabricação de AuNPs. Após misturar os sais de Au com o extrato, a incubação foi realizada a 37 ° C em estufa seca por 5 h. Em seguida, espectros de UV-visível foram adquiridos na faixa de 300 ~ 800 nm.

Cultura de células


Três células cancerosas (HT-29, PANC-1 e MDA-MB-231) foram adquiridas do Korean Cell Line Bank (Seul, República da Coréia). As células foram cultivadas em DMEM de alta glicose suplementado com FBS a 10%, penicilina (100 unidades / mL) e estreptomicina (100 μg / mL). As células foram cultivadas a 37 ° C (fornecido 5% CO 2 ) em uma incubadora e mantida confluência de aproximadamente 80% antes da tripsinização.

Citotoxicidade


O kit EZ-CYTOX da DoGenBio (Gyonggi, República da Coréia) foi usado para o ensaio WST para avaliar a citotoxicidade contra células cancerosas. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5,0 × 10 3 células / poço. A incubação foi realizada por 24 h em uma incubadora a 37 ° C sob um CO 2 (5%) atmosfera. Após a incubação, o meio foi descartado. Em seguida, diferentes concentrações de PV-AuNPs (0, 29,9, 59,8, 119,6, 239,2 e 478,3 μg / mL com base na concentração de Au medida por análise de ICP-OES) foram adicionadas às células com o meio de cultura na presença ou ausência de SFB. Após mais 24 horas de incubação a 37 ° C na incubadora, o reagente EZ-CYTOX (10 μL) foi adicionado e as células foram incubadas em um CO 2 incubadora por mais 1 h. A absorvância foi medida a 450 nm usando um leitor multimodo híbrido Cytation (BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). A absorbância intrínseca dos PV-AuNPs interferiu na medição da citotoxicidade em 450 nm. Portanto, a absorbância de fundo dos PV-AuNPs foi subtraída da absorbância de cada ponto de dados medido a 450 nm. A absorbância de fundo dos PV-AuNPs foi medida em condições livres de WST. Além disso, o mesmo volume de água desionizada foi utilizado como controle em vez dos PV-AuNPs.

Análise estatística


Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados são apresentados como a média ± erro padrão (SE). A significância das diferenças foi investigada usando ANOVA (análise de variância unilateral) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey ou o teste de comparação múltipla de Newman-Keuls. As análises estatísticas foram calculadas usando GraphPad Software (GraphPad Software versão 5.02, San Diego, CA, EUA). Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para valores de p <0,05.

Resultados e discussão

Atividades antioxidantes dos extratos


Extratos aquosos das partes aéreas de cada planta foram obtidos por sonicação. Os rendimentos de extração de A. capillaris , P. olerácea , e P. vulgares foram 14,1%, 39,12% e 28,6%, respectivamente. O maior rendimento de extração foi mostrado em P. olerácea , seguido por P. vulgares e por último por A. capillaris . Para avaliar as atividades antioxidantes dos extratos, medimos a atividade de eliminação de radicais livres, poder redutor e conteúdo fenólico total. As atividades de eliminação de radicais livres dos extratos foram determinadas pelos ensaios DPPH e ABTS. O DPPH é amplamente utilizado para avaliar a atividade antioxidante dos compostos fenólicos, pois o radical DPPH é um radical livre estável que perde sua intensidade de absorbância quando é reduzido pelos antioxidantes. O ensaio ABTS mede a capacidade de um antioxidante de eliminar os radicais que são gerados pela reação de um agente oxidante forte com ABTS. É avaliada a redução da absorbância do radical ABTS por antioxidantes com propriedades doadoras de hidrogênio. Os extratos aquosos exibiram atividades de eliminação de uma maneira dependente da dose. Nas concentrações testadas (15,63 μg / mL, 31,25 μg / mL, 62,5 μg / mL, 125 μg / mL e 250 μg / mL), o extrato de P. vulgares (IC 50 50,35 ± 1,22 μg / mL contra o radical DPPH; IC 50 38,6 ± 0,44 μg / mL contra o radical ABTS) exibiu as atividades mais potentes contra os radicais DPPH e ABTS seguidos pelo extrato de A. capillaris (IC 50 156,72 ± 0,97 μg / mL contra o radical DPPH; IC 50 147,28 ± 2,95 μg / mL contra radical ABTS) e, em seguida, o extrato de P. olerácea (IC 50 247,33 ± 1,57 μg / mL contra o radical DPPH; IC 50 305,54 ± 4,86 ​​μg / mL contra radical ABTS). Notavelmente, P. vulgares mostrou uma atividade sequestrante de radicais livres DPPH mais potente do que BHT (IC 50 71,37 ± 0,84 μg / mL), que foi usado como padrão (Tabela 1 e Fig. 1a, b). O extrato de P. vulgares demonstraram as maiores atividades de eliminação de radicais DPPH e ABTS entre os três extratos. Este resultado implicava que possivelmente mais compostos antioxidantes existiriam em P. vulgares do que em A. capillaris e P. olerácea.

Atividades de eliminação de radicais DPPH e ABTS e poder redutor dos extratos aquosos de A. capillaris , P. olerácea , e P. vulgares . a Atividades de eliminação de radicais DPPH. b Atividades de eliminação de radicais ABTS. c Reduzindo o poder dos extratos. Os dados são apresentados como a média ± SEM. Os asteriscos indicam o significado da diferença em relação ao padrão (BHT ou vitamina C):* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Os resultados são representativos de três experimentos independentes

Também examinamos as atividades antioxidantes dos extratos via um ensaio de potência redutora. Na presença de antioxidantes, ferricianeto de potássio (Fe 3+ ) é convertido em ferrocianeto de potássio (Fe 2+ ), que reage com o cloreto férrico para formar um complexo férrico-ferroso. O complexo férrico-ferroso possui absorbância máxima em 700 nm, que pode ser usada para avaliar o poder redutor de um antioxidante. No relatório atual, o poder redutor é expresso como a concentração (μg / mL) de cada extrato que deu uma absorbância de 0,7 a 700 nm. Conforme mostrado na Fig. 1c, P. vulgares (162,98 μg / mL) exerceu um poder de redução notavelmente maior do que A. capillaris (235,38 μg / mL) e P. olerácea (396,16 μg / mL). Como mencionado anteriormente, os resultados do poder redutor também indicaram que possivelmente mais compostos antioxidantes existiriam em P. vulgares do que em A. capillaris e P. olerácea.

O conteúdo fenólico total de cada extrato também foi investigado. É bem conhecido que os compostos fenólicos são antioxidantes potenciais e possuem a capacidade de eliminar os radicais devido aos seus grupos hidroxila. Assim, a atividade antioxidante de um extrato vegetal pode se correlacionar bem com seu conteúdo fenólico. Uma curva de calibração padrão foi construída usando ácido gálico, e esta curva mostrou uma relação linear ( y =6.0617 x + 0,1293, r 2 =0,9983). Usando a curva padrão, o conteúdo fenólico total foi calculado e é expresso como miligramas de ácido gálico equivalente (GAE) por grama de extrato. O conteúdo fenólico total dos extratos foi 90,53 ± 6,81 mg GAE / g para P. vulgares , 39,88 ± 4,55 mg GAE / g para A. capillaris , e 18,32 ± 2,76 mg GAE / g para P. olerácea . A quantidade de conteúdo fenólico total foi maior em P. vulgares entre os três extratos.

Houve uma correlação positiva entre o conteúdo fenólico total e a capacidade dos extratos de eliminar os radicais ou seu poder redutor. Tomados em conjunto, os extratos aquosos de A. capillaris , P. olerácea , e P. vulgares exibiu atividades antioxidantes significativas. Em particular, o extrato de P. vulgares mostrou a maior atividade de eliminação de radicais contra os radicais DPPH e ABTS, o poder redutor mais forte e o maior conteúdo fenólico total, o que implica que o extrato de P. vulgares exerceria a atividade mais forte como um agente redutor para a biofabricação de AuNPs. Esses resultados interessantes da biofabricação de AuNPs usando os três extratos serão discutidos na seção seguinte.

Biofabricação de AC-AuNPs, PO-AuNPs e PV-AuNPs


Propomos que a atividade antioxidante do extrato afeta fortemente o processo de biofabricação de AuNPs. Uma vez que a atividade antioxidante é a principal força motriz na redução de sais de Au a AuNPs, P. vulgares , que possui a maior atividade antioxidante, é capaz de ser o agente redutor mais eficiente. O processo de biofabricação foi seguido por espectrofotometria UV-visível, já que AuNPs possuem um SPR distinto na faixa de comprimento de onda do infravermelho próximo ao visível. A biofabricação de AuNPs foi realizada pela mistura de sais de Au com cada solução de extrato. Cada extrato continha diversos fitoquímicos que são muito eficientes para a redução de sais de Au a AuNPs.

A banda SPR distinta de AuNPs resultou em mudanças na cor da solução inicialmente amarelo pálido para azul escuro para os PO-AuNPs, marrom fluorescente para os AC-AuNPs e vermelho vinho para os PV-AuNPs (Fig. 2) . Os espectros de UV-visível foram registrados após a incubação a 37 ° C em um forno seco por 5 h para observar a banda SPR distinta de cada conjunto de AuNPs (Fig. 3). A absorbância máxima foi observada em 530 nm para os PV-AuNPs e em 555 nm para os AC-AuNPs. No caso dos PO-AuNPs, uma banda larga de SPR foi observada de 500 a 700 nm. Os três extratos geraram AuNPs com uma banda SPR característica em espectros de UV-visível. Cada mudança de cor junto com a banda SPR distinta apoiou claramente a biofabricação bem-sucedida de AuNPs com cada extrato. Propusemos que os três fatores relacionados às atividades antioxidantes (atividade sequestradora de radicais livres, conteúdo fenólico total e poder redutor) afetam a biofabricação de AuNP. O extrato de P. vulgares marcou a maior pontuação para todos os três fatores, seguido por A. capillaris e por último por P. olerácea . Curiosamente, os PO-AuNPs mostraram agregar após armazenamento à temperatura ambiente (25 ° C) por 30 min. Esse resultado sugeriu que os PO-AuNPs foram os mais instáveis, quanto à atividade antioxidante, quantidade de compostos fenólicos totais e poder redutor de P. olerácea foram os mais baixos entre esses três extratos. Em contraste, os PV-AuNPs mostraram a maior absorbância e uma solução transparente de vinho tinto. A absorbância dos AC-AuNPs estava entre a dos PO-AuNPs e os PV-AuNPs. Portanto, com base nessas observações, foi determinado que maior atividade sequestradora de radicais livres, conteúdo fenólico total e poder redutor de P. vulgares extrato resultou na síntese de AuNPs mais estáveis ​​em comparação com os AuNPs produzidos pelos extratos de A. capillaris e P. olerácea . Coletivamente, as bandas máximas de SPR apresentaram deslocamentos batocrômicos e hipocrômicos com diminuição da atividade antioxidante do extrato. Além disso, o formato da banda SPR tendeu a se alargar com a diminuição da atividade antioxidante. Consequentemente, os PV-AuNPs foram ainda caracterizados por HR-TEM, HR-XRD, tamanho hidrodinâmico e medições de potencial zeta. Para determinar o rendimento da reação, a análise ICP-OES foi conduzida. A atividade antioxidante e a citotoxicidade na presença / ausência de FBS foram posteriormente avaliadas contra células cancerosas.

Fotografias digitais de PO-AuNPs, AC-AuNPs e PV-AuNPs

Espectros UV-visíveis de PO-AuNPs (linha preta), AC-AuNPs (linha vermelha) e PV-AuNPs (linha azul)

Imagens HR-TEM dos PV-AuNPs


As técnicas microscópicas são as ferramentas mais eficazes para visualizar nanopartículas. Junto com HR-TEM, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica são comumente utilizadas para determinar o tamanho, morfologia, topografia e estruturas bidimensionais / tridimensionais. O tamanho e a morfologia dos PV-AuNPs foram investigados com HR-TEM. Conforme mostrado na Fig. 4, várias formas, incluindo esferas, triângulos, hastes, losangos e hexágonos, foram observadas (Fig. 4a ~ e). A observação de estruturas reticuladas em uma haste (Fig. 4f, g) e um triângulo (Fig. 4h) demonstrou claramente que os PV-AuNPs eram de natureza cristalina. Este resultado foi fortemente apoiado pelos resultados da análise HR-XRD subsequentes. O tamanho de cada forma de partícula foi medido a partir das imagens HR-TEM, e os histogramas de tamanho resultantes são ilustrados na Fig. 5. Todos os histogramas mostraram uma distribuição gaussiana. Nanopartículas discretas nas imagens foram selecionadas aleatoriamente para obter um tamanho médio de cada forma. O diâmetro das esferas foi determinado como sendo 23,8 ± 1,3 nm a partir de 250 nanopartículas (Fig. 5a). Curiosamente, triângulos equiláteros foram produzidos; assim, medimos as alturas de 64 nanopartículas (25,7 ± 2,2 nm, Fig. 5b). Vinte e sete nanopartículas em forma de bastonete foram escolhidas aleatoriamente para determinar o comprimento médio (28,4 ± 0,4 nm, Fig. 5c). A razão de aspecto média, definida como o comprimento dividido pela largura, das hastes foi determinada como 2,4. Para o formato do losango, 38 losangos foram selecionados aleatoriamente nas imagens. Como mostrado na Fig. 5d, e, os comprimentos médios das linhas diagonais longas e curtas foram medidos como sendo 22,0 ± 0,6 nm e 15,4 ± 0,3 nm, respectivamente. PV-AuNPs de formatos diversos possuíam o tamanho de menos de 30 nm, e os tamanhos foram comparados com o tamanho hidrodinâmico na seção seguinte.

Imagens HR-TEM de PV-AuNPs. A barra de escala representa a 50 nm, b 50 nm, c 50 nm, d 50 nm, e 10 nm, f 2 nm, g 2 nm e h 2 nm

Histogramas de tamanho de PV-AuNPs. a O diâmetro das esferas. b A altura dos triângulos equiláteros. c O comprimento das hastes. d O comprimento (linha diagonal longa) do losango. e O comprimento (linha diagonal curta) do losango

Tamanho hidrodinâmico e potencial zeta dos PV-AuNPs


O tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta são características importantes na pesquisa de nanopartículas para aplicações futuras. Geralmente, o tamanho medido a partir de imagens HR-TEM é menor do que o tamanho hidrodinâmico, pois o tamanho hidrodinâmico reflete as biomoléculas ligadas na superfície das nanopartículas. Como mostrado na Fig. 6a, o tamanho hidrodinâmico foi determinado como sendo 45 ± 2 nm com um índice de polidispersidade de 0,258, que era maior do que o tamanho das esferas medido a partir das imagens HR-TEM (23,8 ± 1,3 nm de 250 nanopartículas) . Este resultado sugere claramente que os fitoquímicos no extrato se ligam à superfície dos PV-AuNPs e os estabilizam. Além disso, os PV-AuNPs possuíam um potencial zeta negativo de - 13,99 mV (Fig. 6b). Esses resultados mostraram que os fitoquímicos com cargas negativas provavelmente contribuíram para o potencial zeta negativo. Este potencial zeta negativo dá forças repulsivas em uma solução coloidal de PV-AuNPs conferindo sua estabilidade. Portanto, um de nossos trabalhos futuros incluirá a triagem fitoquímica no extrato de P. vulgares para elucidar os compostos exatos que contribuem para o potencial zeta negativo.

Hydrodynamic size and zeta potential of PV-AuNPs. a Hydrodynamic size. b Zeta potential

HR-XRD Analysis of the PV-AuNPs


X-ray diffraction analysis is generally employed to obtain crystallographic information about metallic nanoparticles. The characteristic diffraction patterns in terms of the Bragg reflections obtained from HR-XRD showed that the PV-AuNPs possessed a crystalline structure. The diffraction peaks (2θ values) observed at 38.1°, 44.5°, 64.8°, and 77.4° corresponded to the (111), (200), (220), and (311) planes, respectively, of a face-centered cubic structure in the PV-AuNPs (Fig. 7). The Scherrer equation (D  = 0.89·λ/W·cosθ ) was used to determine the approximate size of the PV-AuNPs. We selected the most intense (111) peak for application in the equation. The definition of each term in the equation is as follows:D is the size of the PV-AuNPs determined from the (111) peak, θ is the Bragg diffraction angle of the (111) peak, λ is the X-ray wavelength that was utilized, and W is the full width at half maximum (FWHM) of the (111) peak, in radians. From the Scherrer equation, the approximate size of the PV-AuNPs was determined to be 16.7 nm. The size determined from the Scherrer equation was smaller than the sizes measured from both HR-TEM images and the hydrodynamic size. The hydrodynamic size was the largest, possibly due to the fact that phytochemicals in the extract bound to the surface of the PV-AuNPs.

HR-XRD analysis of PV-AuNPs

Reaction Yield of the PV-AuNPs


ICP-OES was used to estimate the reaction yield. First, the total concentration of Au was obtained by analyzing the PV-AuNP solution. Second, the PV-AuNPs were centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was analyzed to ascertain the concentration of unreacted Au in the reduction reaction. Then, the reaction yield was estimated as follows:reaction yield (%) = 100 − [Au concentration in the supernatant/Au concentration in the colloidal solution] × 100.

Based on ICP-OES analysis, the concentrations of Au in the colloidal PV-AuNP solution and the supernatant were determined to be 96.337 ppm and 0.679 ppm, respectively. Therefore, the reaction yield of the PV-AuNPs was determined to be 99.3%. From the ICP-OES results, we concluded that the reaction condition was optimal which produced a high reaction yield of PV-AuNPs.

Antioxidant Activity of the PV-AuNPs


The DPPH radical scavenging activity was examined to evaluate the antioxidant activity of the PV-AuNPs. As shown in Fig. 8, the DPPH radical scavenging activity of the PV-AuNPs was nearly constant at a concentration of less than 20.9 μg/mL (based on the Au concentration). However, as the concentration increased (41.9~334.8 μg/mL based on the Au concentration), the DPPH radical scavenging activity also increased, suggesting that the activity was dose-dependent. O IC 50 of the PV-AuNPs was observed to be 165.0 μg/mL, which was equivalent to the IC50 of vitamin C (49.4 μM).

DPPH radical scavenging activity of PV-AuNPs. The concentration was expressed as Au concentration

Green-synthesized AuNPs or AgNPs have been known to possess antioxidant activity in terms of DPPH radical scavenging activity [20, 21]. Ginseng-berry-mediated AuNPs demonstrated antioxidant activity [20]. The absorption of phytochemicals in the ginseng berry extract on the surface of nanoparticles having a large surface area can be credited to the antioxidant activity of AuNPs [20]. Green-synthesized AuNPs using Angelica pubescens roots showed antioxidant activity with a dose-dependent manner [21]. Secondary metabolites in A. pubescens such as flavonoids, sesquiterpenes, and phenolic compounds are potential contributors for the free radical scavenging activity [21]. However, AgNPs demonstrated higher antioxidant activity than AuNPs in the two articles mentioned above.

Cytotoxicity of the PV-AuNPs


The cytotoxicity of the PV-AuNPs against three cancer cells from different tissue types (colon, pancreas, and breast) was evaluated to examine the tissue-specific cytotoxicity of the nanoparticles in the presence/absence of FBS (Fig. 9). When serum was present during the cell culture, various kinds of protein coronas formed. The protein corona was dependent on the characteristics of the nanoparticles, such as the size, shape, surface charge, and surface roughness [22]. The protein corona can either increase or decrease the cellular uptake and cytotoxicity of the nanoparticles [23]. However, there are controversial reports regarding whether the protein corona causes the cytotoxicity to increase or decrease. Thus, the cytotoxicity of the PV-AuNPs was evaluated in the presence and absence of FBS. In the absence of FBS, HT-29 showed the greatest cytotoxicity at the tested concentrations (29.9~478.3 μg/mL) among three cells (Fig. 9a), followed by MDA-MB-231 (Fig. 9b) and lastly by PANC-1 (Fig. 9c). However, in the presence of FBS, these cells demonstrated a different phenomenon. PANC-1 showed the highest cytotoxicity, followed by HT-29 cells. In the absence of FBS and with 478.3 μg/mL Au, both the PANC-1 and MDA-MB-231 cells did not show any significant cytotoxicity, while strong cytotoxicity was observed for the HT-29 cells (65.6% cytotoxicity). However, in the presence of FBS, cytotoxicity was observed for PANC-1 (37.5% cytotoxicity) at 478.3 μg/mL Au. In general, the PV-AuNPs surrounded by a protein corona strongly influenced the cytotoxicity against cancer cells, although the results were tissue-specific. The protein corona produced by FBS increased the cytotoxicity against PANC-1 when compared with the cytotoxicity in the absence of FBS; however, the cytotoxicity decreased in the presence of the protein corona for HT-29 when compared with the cytotoxicity without the protein corona.

In vitro cytotoxicity on cancer cells. a HT-29. b MDA-MB-231. c PANC-1

It has been reported that a variety of proteins bind to both positively and negatively charged AuNPs, while few proteins bind to AuNPs with a neutral charge [17, 24]. The negatively charged AuNPs showed a higher affinity and a slower release of fibrinogen protein than the positively charged AuNPs, suggesting the existence of specific binding sites for fibrinogen on the negatively charged AuNPs [17]. The PV-AuNPs possessed a negative zeta potential; thus, the binding of fibrinogen may affect the cytotoxicity against cancer cells. The investigation of the protein corona of nanoparticles is beneficial in nanomedicine research for future biomedical and clinical applications.

Conclusions


The aqueous extracts of A. capillaris , P. olerácea , and P. vulgaris exhibited antioxidant activity which was evaluated by free radical scavenging activity, total phenolic content, and reducing power. P. vulgaris exerted the highest antioxidant activity, followed by A. capillaris e P. olerácea . The extract of P. vulgaris possessing the highest antioxidant activity was a very efficient green reducing agent for the biofabrication of AuNPs. The findings of our study demonstrate that the factors of the antioxidant activity, such as the free radical scavenging activity, reducing power, and total phenolic content, are closely correlated with the color of the colloidal solution and the shape of the SPR band of the resulting AuNPs. When the antioxidant activity was high, the resulting AuNPs showed a narrow SPR band with a strong absorbance. In contrast, a broad SPR band was observed for the PO-AuNPs, in which P. olerácea exhibited the lowest antioxidant activity among the three extracts. Furthermore, the PO-AuNPs aggregated easily after storage at ambient temperature. Consequently, the extract of P. vulgaris produced a wine-red colloidal solution of PV-AuNPs with various shapes with a maximum SPR of 530 nm. A face-centered cubic crystalline pattern of PV-AuNPs was confirmed by high-resolution X-ray diffraction analysis. The reaction yield was estimated by ICP-OES to be 99.3%. The hydrodynamic size (45 ± 2 nm) was larger than that measured from HR-TEM images suggesting that phytochemicals bound on the surface of the PV-AuNPs. Furthermore, phytochemicals with negative charges possibly attributed to a negative zeta potential of − 13.99 mV. The antioxidant activity of the PV-AuNPs was dependent on the Au concentration that was assessed based on the DPPH radical scavenging activity. Green-synthesized AuNPs using ginseng-berry and A. pubescens root extracts also showed DPPH radical scavenging activity [20, 21]. The PV-AuNPs showed cytotoxicity against HT-29, PANC-1, and MDA-MB-231 cells. Interestingly, the presence or absence of FBS dramatically affected the cytotoxicity against these cells. This phenomenon was possibly due to the protein corona that surrounded the surface of the nanoparticles.

Currently, AuNPs have diverse applications in nanomedicine as drug delivery vehicles or carriers of anticancer agents such as doxorubicin. P. vulgaris ethylacetate fraction showed cardioprotective effects with a concentration-dependent manner on isolated rat cardiomyocytes subjected to doxorubicin-induced oxidative stress [25]. PV-AuNPs can be applied as doxorubicin delivery vehicles with a cardioprotective ability. Therefore, our subsequent work will explore the anticancer activities of the PV-AuNPs loaded with doxorubicin for future biomedical and pharmaceutical applications. Diverse plant extracts have a potential to be effective reducing agents for biofabricating AuNPs. When the biofabrication reaction is conducted, it is essential to select a plant extract that possesses a high antioxidant activity in order to produce stable AuNPs. Additionally, P. vulgaris extract has a potential to be used as a reducing agent for the green synthesis of other novel metallic nanoparticles with valuable applications in the future.

Abreviações

ABTS:

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
AC-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of A. capillaris
AgNPs:

Nanopartículas de prata
AuNPs:

Gold nanoparticles
BHT:

Butylated hydroxytoluene
DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
FBS:

Soro fetal bovino
GAE:

Gallic acid equivalent
HR-TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução
HR-XRD:

High-resolution X-ray diffraction
HT-29:

Human colorectal adenocarcinoma cell
IC50 :

Half maximal inhibitory concentration
ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy
MDA-MB-231:

Human breast adenocarcinoma cell
PANC-1:

Human pancreas ductal adenocarcinoma cell
PO-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. olerácea
PV-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. vulgaris
SPR:

Ressonância de plasmon de superfície
WST assay:

Water-soluble tetrazolium assay

Nanomateriais

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