Nanopartículas de ouro com quitosana, quitosana N-acilada e oligossacarídeo de quitosana como transportadores de DNA

Resumo

Atualmente, as nanopartículas de ouro têm encontrado aplicações na engenharia e nas ciências médicas, tirando proveito de suas propriedades e características. A ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, é um dos principais recursos para aplicações ópticas e outras propriedades físicas, como alta densidade, que representa a chave para a captação celular. Entre outras aplicações, no campo médico, algumas doenças podem ser tratadas usando terapia genética, incluindo doenças monogenéticas ou poligênicas e infecções. A adição, supressão ou substituição de genes é uma das muitas opções de manipulação genética. Este trabalho explora um método alternativo não viral para transferência de genes usando nanopartículas de ouro funcionalizadas com polímeros orgânicos; duas vias de síntese foram utilizadas:uma delas com borohidreto de sódio como agente redutor e outra com oligossacarídeo quitosana como agente redutor e estabilizador. Nanopartículas de ouro conjugadas com quitosana, quitosana acilada e oligossacarídeo de quitosana foram utilizadas para avaliar a eficiência de transfecção do DNA plasmídico em cultura de células (HEK-293). As propriedades físicas e químicas dos nanocompósitos de ouro foram caracterizadas usando espectroscopia UV-Vis, ξ - potencial e microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, a interação entre nanopartículas de ouro e DNA de plasmídeo foi demonstrada usando eletroforese em gel de agarose. Os testes de transfecção foram realizados e avaliados pela atividade de β-galactosidase e expressão da proteína fluorescente verde. A porcentagem de transfecção obtida com quitosana, quitosana acilada e oligossacarídeo de quitosana foi de 27%, 33% e 60%, respectivamente.

Histórico

A terapia gênica pode ser definida resumidamente como uma forma de introduzir material genético nas células para diversos fins, entre eles o tratamento de doenças genéticas [1]. Entre os dois principais tipos de vetores de DNA para terapia gênica, viral e não viral, o último apresenta as vantagens de ausência de imunogenicidade, boa adesão, não infectividade [2], estabilidade em armazenamento e facilidade de produção. Por outro lado, mesmo quando vetores virais, como retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados, etc., apresentam altas taxas de transfecção e rápida transcrição, apresentam desvantagens como rápida eliminação da circulação, toxicidade, imunogenicidade e capacidade reduzida para transportar grandes quantidades de informações [3,4,5]. Normalmente, no caso de transportadores não virais, o DNA estranho é carregado em um plasmídeo e é protegido e estabilizado durante a formação de conjugados ou complexos. Em particular, a quitosana (CO) tem sido estudada para o desenvolvimento de vetores de DNA não virais, uma vez que apresenta altas taxas de transfecção e baixa toxicidade, protegendo o DNA dos ácidos nucléicos durante o transporte intercelular [4]. Este polímero amplamente presente na natureza (é encontrado como o principal constituinte das cascas dos crustáceos e como parte das paredes celulares de muitos fungos [6]) é um polissacarídeo que pode ser obtido após a transformação da quitina (obtenção de 2-amino-2-desoxi Unidades de repetição de -β-D-glucopiranose, mas ainda retendo uma pequena quantidade de resíduos de 2-acetamido-2-desoxi-β-D-glucopiranose [7]) (Fig. 1a). As aplicações médicas da quitosana nativa requerem, na maioria dos casos, algumas modificações do polímero; entre as principais desvantagens a serem superadas estão a insolubilidade em pH fisiológico e a alta viscosidade em solução ácida diluída [8]. Alguns pesquisadores apontaram que a dinâmica de transfecção celular depende do tamanho e forma do veículo [1, 8,9,10,11,12], por exemplo, Huo et. al. relataram como essas propriedades se correlacionam com a eficiência de penetração para o caso de nanopartículas de ouro [10].

A solubilidade da quitosana pode ser modificada mudando a distribuição dos grupos acetil remanescentes na cadeia e o grau de acetilação [13]. Outro método para controlar as propriedades físicas da quitosana é a acilação (Fig. 1b). De acordo com a disponibilidade de grupos amino e o grau de acetilação, algumas biointerações da quitosana podem ser controladas, aumentando sua hidrofobicidade por acilação com ácidos graxos, por exemplo [7]. Le Tien et. al. [7] relataram N-acilação de quitosana para matrizes de liberação controlada em produtos farmacêuticos. Bhattarai et. al. [14] obtiveram nanopartículas de ouro estabilizadas com quitosana N-acilada para aplicações em condições fisiológicas, exibindo as vantagens da quitosana não acilada. Outra modificação útil da quitosana é a redução do comprimento da cadeia do polímero (oligossacarídeo de quitosana, COS) [15]. Dentre as propriedades dos diversos tipos de COS obtidos a partir da quitosana, sua menor viscosidade e maior solubilidade em água são muito úteis para muitas aplicações [16]. Foi relatado que a quitosana de baixo peso molecular pode aumentar a captação celular, principalmente por causa de seus comprimentos de cadeia mais curtos (unidades de D-glucosamina 2-10) (Fig. 1c) e grupos amino livres [17,18,19]. Além disso, a síntese de nanopartículas de ouro com oligossacarídeo de quitosana como agente redutor não inclui nenhum reagente tóxico [20].

Estrutura química de a quitosana, b quitosana acilada e c oligossacarídeo de quitosana

As nanopartículas de ouro (AuNPs) levaram ao desenvolvimento de um novo tipo de nanomateriais, aproveitando suas propriedades ópticas e alta estabilidade física que os tornam uma opção muito viável para diversas aplicações [21,22,23,24,25]; por este meio, eles apresentam melhorias para a transfecção celular em relação aos lipocomplexes ou polímeros, por terem maior densidade e, assim, reduzir o tempo de captação [12]. Como o ouro tem uma grande afinidade com o amino (-NH ₂ ), grupos funcionais ciano (-CN) e tiol (-SH), grandes oportunidades estão abertas para muitos tipos de funcionalização [9, 26]. Monocamadas catiônicas são obtidas, por exemplo, pela adição de polímeros catiônicos a nanopartículas de ouro, melhorando a interação do ácido nucleico e a adsorção eletrostática [27, 28]. Desta forma, nanocomplexos combinando quitosana e ouro tiram vantagens de ambos os materiais para aplicações biológicas [29,30,31,32,33], representando um material promissor para o desenvolvimento de portadores de DNA [5, 10, 12, 14].

Há uma grande variedade de métodos biológicos para sintetizar AuNPs, compreendendo o uso de carboidratos, microrganismos, enzimas, vitaminas e biopolímeros, entre outros [34]. Entre a chamada síntese verde [35], o uso do método de síntese one-pot, utilizando a quitosana como agente redutor e estabilizador, tem se mostrado mais sintonizável e seguro para aplicações biomédicas [36, 37]. Da mesma forma que os métodos de síntese tradicionais, no caso da síntese em um único recipiente, o tamanho das partículas obtidas depende da concentração do agente redutor; desta forma, no caso particular do oligossacarídeo de quitosana, a razão quitosana / ouro deve ser controlada a fim de obter diferentes tamanhos de partícula, sendo o peso molecular da quitosana um fator importante para o tamanho e distribuição da forma das nanopartículas. Este trabalho teve como objetivo a avaliação de diferentes nanocomplexos baseados em quitosana-AuNP para transfecção de DNA, incluindo síntese verde / one-pot com oligossacarídeo de quitosana de 5 kDa, que é um peso molecular mais baixo do que os relatados para aplicações semelhantes [36, 38].

Os testes de transfecção foram realizados na linha celular HEK-293 ( Homo sapiens (humano) - morfologia epitelial - feto de rim embrionário) com os plasmídeos pSV-β-Gal e pIRES2-EGFP. Esses testes foram selecionados com base na eficiência de transfecção e citotoxicidade que são dependentes do tipo de célula e que, de acordo com Corsi et. al. [4], a transfecção é mais favorável para a linha celular HEK-293 em comparação com MG63 e células-tronco mesenquimais.

Métodos

Síntese de nanocompósitos

Cada experimento foi realizado com nanopartículas de ouro com quitosana modificada e não modificada; dois métodos principais de síntese foram utilizados:um deles envolvendo a síntese química de nanopartículas de ouro com quitosana em sua forma simples (CO-AuNPs) e quitosana hidrofobicamente modificada com grupos acil (Acil-CO-AuNPs) e o outro um verde / um- síntese de pot usando quitosana de cadeia curta (oligossacarídeo de quitosana, COS @ n-AuNPs). A Figura 2 mostra um diagrama esquemático para cada síntese; os procedimentos experimentais correspondentes são descritos abaixo.

Diagrama esquemático para cada síntese: a - b síntese química de nanopartículas de ouro com quitosana em sua forma simples (CO-AuNPs) e com grupos acila hidrofobicamente modificados (Acil-CO-AuNPs) e c - f síntese verde / one-pot para quitosana de cadeia curta (oligossacarídeo de quitosana, COS @ n-AuNPs)

Materiais

Cloreto de ouro (III) tri-hidratado (HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ O), boro-hidreto de sódio (NaBH ₄ ), quitosana de baixo peso molecular (50-190 kDa, grau de desacetilação de 75%) e oligossacarídeo de quitosana (baixo peso molecular, 5 kDa) foram obtidos da Sigma Aldrich. Todos os utensílios de vidro foram lavados e deixados em um banho de água régia recém-preparada (HCl:HNO ₃ , 3:1 v / v ) por 24 horas, e enxágue abundantemente com água Mili-Q antes do uso, para remover qualquer vestígio de metal [39].

Nanopartículas de quitosana-ouro (CO-AuNPs)

A síntese de nanopartículas de quitosana-ouro foi realizada seguindo Huang et. al. Metodologia de [9]. Para isso, 20 mg de solução de quitosana de baixo peso molecular (2 mg / ml) foram adicionados a 10 ml de ácido acético a 1% e misturados com vórtice até a dissolução completa e armazenados durante a noite. Dois mililitros da solução obtida foram filtrados usando um filtro de seringa de polietersulfona de 0,22 μm, em seguida, foram misturados com 1 ml de HAuCl 10 mM ₄ ∙ 3H ₂ O solução usando forte agitação por 30 min. 0,4 ml de NaBH 100 mM recém-preparado ₄ solução fria foi usada como agente redutor; foi adicionado gota a gota enquanto se mexia, e uma rápida mudança de cor de amarelo para vermelho-vinho foi observada; depois disso, a agitação continuou por um tempo total de 2 h (Fig. 2a).

Nanopartículas de quitosana-ouro aciladas (acil-CO-AuNPs)

Cloreto de caproyl (C ₆ H ₁₁ ClO, Sigma Aldrich) foi usado para a síntese de nanopartículas de quitosana-ouro aciladas.

Gelificação

A acilação de quitosana (baixo peso molecular) foi realizada seguindo o método relatado por Remant Bahadur et al. [6] com pequenas modificações. Para isso, foram adicionados 0,83 g de quitosana a 100 ml de solução de ácido acético a 1% sob agitação magnética que continuou por 24 h. Cinco mililitros desta solução foram filtrados com um filtro de seringa de polietersulfona de 0,22 μm e, em seguida, seu pH foi ajustado para 7,2 com uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 M lentamente adicionada sob agitação vigorosa. Um mililitro de cloreto de caproílo foi adicionado a 5 ml desta última solução e a mistura resultante foi agitada durante 5 h. O pH da mistura foi ajustado para 6,8-7 com uma solução de hidróxido. O gel obtido foi precipitado com acetona e centrifugado a 5000 rpm durante 20 min a 4 ° C. O excesso de ácido capróico foi removido lavando três vezes com metanol (50–60 ° C) e decantando, deixando-o secar por 3 dias no fogão. Este gel foi utilizado para a síntese de nanocompósitos.

Nanocompósitos

Um mililitro de HAuCl 10 mM ₄ ∙ 3H ₂ A solução foi adicionada a 2 ml de gel diluído a 0,33% em uma solução de HCl 0,1 M, agitando por 1 h. Finalmente, adicionando a isso os últimos 0,4 ml de NaBH 0,1 M ₄ solução fria recém-preparada durante a agitação, a formação de nanopartículas de ouro foi evidente com a cor rosa / vermelha virando antes de completar 2 h de agitação contínua (Fig. 2b).

Nanopartículas de ouro de oligossacarídeo de quitosana (COS @ n-AuNPs)

COS @ n-AuNPs foram preparados seguindo uma metodologia modificada relatada por Manivasagan et al. [20]. O oligossacarídeo de quitosana (COS) foi adicionado a 10 ml de HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ O e agitada durante 60 min a 80 ° C. Quatro sínteses foram realizadas variando a quantidade de COS (100 e 200 mg) e a concentração de ouro no HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ Solução O (0,003 e 0,017% em peso). A Tabela 1 mostra os parâmetros usados ​​na síntese AuNP para cada experimento. A formação de nanopartículas de ouro foi evidente com o giro da cor vinho-vermelho / rosa-vermelho, registrando mudança de cor em momentos diferentes em cada caso, dependendo da quantidade de agente redutor e precursor de ouro. Os nanocompósitos obtidos foram purificados por centrifugação a 12.000 g por 30 min (Fig. 2c – f).

Caracterização do nanocompósito

Espectroscopia de infravermelho

Quitosana usada para CO-AuNPs, quitosana acilada para Acil-CO-AuNPs e oligossacarídeo de quitosana para séries de COS @ n-AuNPs foram caracterizados por espectrometria FTIR (Spectrum One, Perkin Elmer) para confirmar a acilação do polímero Acil-CO comparando o intensidade de bandas características de grupos funcionais entre as amostras. O grau de substituição (SD) foi estimado a partir de informações de espectro de infravermelho, de acordo com Remant Bahadur et. al. [6].

ξ-Potencial

Zetasizer (Nano Z, Malvern) foi usado para avaliar o potencial de superfície do compósito. Potencial positivo é esperado para nanocompósitos para adesão bem-sucedida ao DNA para formar complexos. ξ- O potencial foi avaliado antes e depois da formação do complexo para confirmar as alterações após a adesão do DNA. 1,5 ml de amostras diluídas apropriadas foram usados ​​para medições de potencial de superfície, usando uma célula capilar (DTS 1060, Malvern).

Espectroscopia UV-Vis

Espectros de UV-Vis (UV-1800 m, Shimadzu), na faixa de 400 a 700 nm, foram obtidos para confirmação preliminar da formação de nanopartículas de ouro por meio da banda de ressonância plasmônica de superfície em torno de 530 nm. Complementarmente, os espectros de nanocompósitos preparados de fresco foram usados ​​para avaliar qualitativamente a fotoestabilidade das amostras; isso foi feito comparando com os espectros obtidos das mesmas amostras 150 dias após a síntese, seguindo as mudanças em torno da banda de ressonância do plasmon de superfície, escolhendo uma amostra para cada método e usando COS @ 2-AuNPs como o mais representativo para COS @ n-AuNP Series. Célula de quartzo foi usada como recipiente da amostra e água desionizada como branco.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

Microscopia TEM (JEM 1010, JEOL) foi usada para determinação da forma e distribuição do tamanho das partículas. Para imagens TEM, as amostras de nanocompósitos foram preparadas depositando 10 μl de solução sobre suporte de grade de cobre de 200 mesh, coberto com formvar e secando em temperatura ambiente por 15 min. Três imagens para cada amostra foram selecionadas e analisadas por meio de um programa de processamento de imagens caseiro desenvolvido no software Matlab®.

Formação Complexa e Grau de Adesão

Nanocompósito-pDNA

pSV-β-Gal (6,82 kb) e pIRES2-EGFP (5,3 kb) (pDNA) foram isolados de DH5α transformada Escherichia coli . A purificação do plasmídeo foi realizada por lise alcalina, utilizando o kit Mo Bio® UltraClean Microbial DNA Isolation. A eletroforese em gel de agarose foi utilizada para verificar a integridade estrutural dos plasmídeos, por meio de um transiluminador ultravioleta de alto desempenho, adquirindo imagens com um Kodak Gel Logic 100 Digital Imaging System. A concentração e a pureza do DNA de plasmídeo foram validadas com o leitor de microplaca Multi-Detection Synergy ™ 2 usando o programa Gen5. Os complexos foram obtidos misturando DNA de plasmídeo (pDNA) com cada tipo de nanocompósitos de nanopartículas de ouro-quitosana em meio de Eagle modificado por Dulbecco sem soro (DMEM, Sigma-Aldrich) em quantidades de plasmídeo entre 200 e 400 ng. A adesão do pDNA ao nanocompósito foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 0,8% e voltagem de 90 V por 60 min.

Transfecção do complexo de nanopartícula-pDNA de quitosana-ouro em células HEK-293

Cultura de células

HEK-293 Homo sapiens (humano) - morfologia epitelial - células embrionárias de feto de rim foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco com soro bovino fetal (SFB, Sigma-Aldrich) a 37 ° C sob 5% de CO ₂ -contendo atmosfera. Para a transfecção de pDNA, células HEK-293 foram semeadas em 12.000 células por poço em uma placa de 96 poços e incubadas por 24 h a 37 ° C em 5% de CO ₂ -contendo atmosfera, obtendo 90% de confluência.

Eficiência de transfecção com pIRES2-EGFP

A funcionalização de nanocompósitos de pDNA in vitro foi realizada despejando meio de cultura dos poços até cobrir apenas as células e adicionando a solução complexa em cada poço (15 μl de nanocompósitos e 200 ng de DNA), incubando por 2 h nas mesmas condições de cultura. Depois disso, 500 μl de DMEM completo foram adicionados para incubação por 48 h. A transfecção de pIRES2-EGFP foi avaliada diretamente por microscopia de fluorescência (Axio Vert.A1, Carl Zeiss).

Eficiência de transfecção com pSV-β-Gal

A histoquímica de X-gal foi usada para avaliar a atividade β-galactosidase, modificando a expressão do plasmídeo pSV-β-Gal na linha celular HEK-293; nesta metodologia, as células transfectadas ficaram azuis. A funcionalização do nanocompósito de pDNA in vitro foi realizada conforme explicado acima, incubando por 2 h nas mesmas condições de cultura. Depois disso, 500 μl de DMEM completo foram adicionados para incubação por 24 h, trocando o meio e incubando por mais 24 h. Os poços foram lavados duas vezes com 50 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril 1 × após a remoção do meio de cultura, em seguida, as células foram fixadas com uma mistura de formaldeído a 2% e glutaraldeído a 0,2% por 5 min; em seguida, foram lavadas duas vezes com 50 μl de PBS 1 ×. O fixador foi removido antes da lavagem duas vezes com 50 μl de PBS 1 × e, em seguida, com uma mistura de 0,4 mg / ml X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo, Sigma-Aldrich) diluído em ferrocianeto de potássio 5 mM (Meyer) e cloreto de magnésio 2 mM (Meyer) em PBS 1 ×. Em seguida, as células foram incubadas por 24 h em temperatura ambiente. A expressão da β-galactosidase foi observada por microscopia de campo claro (AE2000, Motic), tomando 5 campos por poço com objetiva de 40 ×, esperando que as células transfectadas ficassem azuis. A eficiência da transfecção foi avaliada comparando as células com expressão de β-galactosidase (mudou para azul) contra o total de células por campo. LipofectAMINE ^TM 2.000 (30 μl) foi usado como controle positivo para todos os testes.

Viabilidade celular pelo método de exclusão de corante

As microculturas foram utilizadas 24 horas após a passagem das células. O meio de cultura foi removido e as células foram lavadas com PBS 1 × antes de adicionar 40 μl de solução complexa. Depois disso, as células foram incubadas por 2 h a 37 ° C a 5% de CO ₂ -contendo atmosfera. Para a exclusão do corante, a solução do complexo foi lavada das células com 50 μl de PBS 1 × e 20 μl de azul de tripano (0,2% em PBS 1 ×) foram incorporados. Com esta última mistura, as células foram incubadas por 10 min a 37 ° C e 5% de CO ₂ -contendo atmosfera. Após esta última incubação, o corante foi retirado dos poços e limpo por lavagem duas vezes com 50 μl de PBS 1 ×. As células foram observadas por microscopia de campo claro, contando as células tingidas de azul (mortas ou danificadas) contra o total de células por campo. Testes de viabilidade celular foram obtidos para diferentes concentrações de complexos em água, de 0,1 mM a 3 mM, CO-AuNPs e Acil-CO, a 3 mM; COS @ 3-AuNPs e COS @ 4-AuNPs, a 0,5 mM; e a concentração mais baixa (0,1 mM) para COS @ 1-AuNPs e COS @ 2-AuNPs.

Software Imagem J ( Software de código aberto ( OSS ) licença ) junto com o plugin Ferramenta baseada em imagem para contagem de núcleos-ICTN foram usados ​​para contar células para transfecção e testes de viabilidade.

Resultados e discussões

Síntese e caracterização de nanocompósitos

Dentre os três tipos de complexos sintetizados neste trabalho, o COS @ n-AuNP merece atenção especial, uma vez que foram sintetizados sem a utilização de reagentes tóxicos, como borohidreto de sódio ou brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB). Foi relatado que a quitosana é adequada como agente redutor e estabilizador e concentração ideal para sintetizar complexos AuNP em tamanhos e formas desejados, dependendo de vários fatores:tempo de reação, temperatura e grau de desacetilação da quitosana e seu peso molecular, entre outros [38 , 40]. Sob esta consideração, o peso molecular da quitosana foi mantido constante em 5 kDa para as quatro sínteses COS @ n-AuNP, tomando HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ Soluções de O e quitosana em diferentes concentrações.

A Figura 3 mostra os espectros de absorção de UV-Vis de nanocompósitos de AuNPs-quitosana sintetizados neste trabalho. Bandas de plasma centradas em 534 nm para quitosana (CO-AuNPs), 507 nm para quitosana acilada (Acil-CO-AuNPs) e para os vários oligossacarídeos de quitosana em 533 nm (COS @ 1-AuNPs), 530 nm (COS @ 2 -AuNPs), 535 nm (COS @ 3-AuNPs) e 536 nm (COS @ 4-AuNPs) confirmam a presença de nanopartículas de ouro. As inserções nesta figura mostram imagens dos nanocompósitos obtidos, cuja coloração depende da concentração, tamanho, forma e funcionalização da superfície das nanopartículas.

Espectros de UV-Vis para nanocompósitos. Os valores nas inserções correspondem ao comprimento de onda máximo da ressonância de plasmon de superfície localizada. Estes máximos foram os seguintes:para CO-AuNPs a 534 nm (0,1 M NaBH ₄ ) ( a ), para Acil-CO-AuNPs a 507 nm ( b ), e para o oligossacarídeo de quitosana COS- @ n-AuNP em 533, 530, 535, 536 nm para cada em 1-4 preparações de nanocompósitos de espessura diferente ( c )

Estabilidade de nanocompósitos

A Figura 4 mostra a comparação entre os espectros de absorção de UV-Vis de nanocompósitos recentemente sintetizados e 150 dias após a síntese; como pode ser observado, os dois espectros para cada caso permanecem essencialmente os mesmos, sem deslocamento significativo do máximo de bandas de ressonância e sem evidência de picos adicionais. Esses resultados sugerem qualitativamente alta estabilidade dos nanocompósitos obtidos.

Estabilidade de nanocompósitos de nanopartículas de ouro por espectros de absorção de UV-Vis obtidos 150 dias após a síntese:CO-AuNPs quimicamente sintetizados ( a ) e Acil-CO-AuNPs ( b ) e síntese verde / one-pot para COS @ 2-AuNPs ( c )

Espectroscopias de infravermelho para as três amostras diferentes de quitosana são mostradas na Fig. 5. Esta técnica foi usada para a identificação da quitosana acilada comparando suas bandas de absorção dentro da região infravermelha (IR) (que são características da estrutura química) com o IR base de dados. Algumas bandas IR características devem ser apontadas:bandas de quitosana (50–190 kDa, 75% de grau de desacetilação) a 1656 cm ⁻¹ , 1593 cm ⁻¹ e 1373 cm ⁻¹ correspondem a grupos amida (amidas I, II e III, respectivamente); a banda em 2895 cm ⁻¹ corresponde a ligações C-H, e aquelas entre 3200-3500 cm ⁻¹ às ligações N-H e O-H. Para a quitosana acilada, as bandas IR foram obtidas a 1651 cm ⁻¹ , 1591 cm ⁻¹ e 1369 cm ⁻¹ correspondem a grupos amida (amidas I, II e III, respectivamente), e aqueles dentro de 3200-3500 cm ⁻¹ correspondem às ligações N-H e O-H. A acilação de quitosana foi confirmada de acordo com dados de espectroscopia de IV [7]:a banda em 1591 cm ^-1 foi menor para a quitosana acilada em comparação à quitosana nativa devido a um maior número de amidas secundárias na quitosana acilada. Bandas dentro de 3200–3500 cm ⁻¹ , característico das vibrações N-H e O-H na quitosana nativa, desaparece para a quitosana acilada e o oligossacarídeo de quitosana devido à redução da amida primária.

Espectros FT-IR de quitosana, acil-quitosana e oligossacarídeo de quitosana. Banda em 1591 cm ⁻¹ corresponde a amidas secundárias; 3200–3500 cm ⁻¹¹ regiões correspondem às vibrações N-H e O-H

O grau de substituição da quitosana acilada foi estimado, de acordo com Bahadur et. al. [6], pela seguinte expressão:
$$ \% DS =\ left (\ left (\ frac {A_ {1651}} {A_ {3350}} \ right) -0,25 \ right) \ times 100 =75,16781 \% $$
onde A ₁₆₅₁ =1,973965 e A ₃₃₅₀ =1,977278 correspondem à absorbância (para vibração de amida I e OH, respectivamente) de quitosana acilada a 1631 cm ⁻¹ e 3350 cm ⁻¹ , respectivamente, e 0,25 corresponde aos grupos de aminas livres. Foi obtido um grau de N-acilação de 75%.

ξ Potencial

Os valores ξ-Potenciais foram obtidos para cada composto da seguinte forma (Tabela 2, coluna "ξ-Potencial"):43,3 mV (CO-AuNPs), 40,2 mV (Acil-CO-AuNPs), 52,2 mV (COS @ 1-AuNPs) , 55,3 mV (COS @ 2-AuNPs), 51,6 mV (COS @ 3-AuNPs) e 46,3 mV (COS @ 4-AuNPs). O potencial para todos os nanocompósitos foi positivo devido aos grupos amina da quitosana, uma vez que foi planejado para conseguir a formação do complexo de DNA por forças eletrostáticas. Após a formação do complexo, a redução dos valores do potencial ξ confirmou o sucesso da adesão do DNA (Tabela 2, coluna “Potencial ξ / DNA”).

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

A Figura 6 mostra as micrografias TEM representativas para cada nanocompósito, juntamente com histogramas de tamanho de nanopartícula para cálculo de distribuição de tamanho. As distribuições de tamanho para cada nanocompósito foram obtidas da seguinte forma:três imagens TEM para cada amostra foram obtidas e analisadas com um software de processamento de imagem caseiro desenvolvido com Matlab® e a contagem de nanopartículas foi de 500 para Acyl-CO-AuNPs, 1000 para CO-AuNPs e 100 para a série COS @ n-AuNP. O tamanho médio para cada amostra está resumido na Tabela 2, coluna "Diâmetro TEM médio (nm)." Vale ressaltar que AuNPs sintetizados com oligossacarídeo de quitosana resultaram em forma esférica, com melhor distribuição de tamanho quando comparados aos semelhantes obtidos com outras metodologias de síntese verde relatadas na literatura [36, 38, 41,42,43].

Micrografias TEM de a AuNPs de quitosana acilada 4,7 nm, b AuNPs de quitosana de 3,5 nm (NaBH 0,1 M ₄ ), c Oligossacarídeo quitosana AuNPs (COS @ 1), d 15,6 nm oligossacarídeo quitosana AuNPs (COS @ 2), e 10 nm de oligossacarídeo quitosana AuNPs (COS @ 3), e f 14 nm oligossacarídeo quitosana AuNPs (COS @ 4)

Formação complexa e grau de adesão:nanocompósito-pDNA

Foram realizados eletroferogramas de todos os complexos de pDNA e DNA puro, tomando diferentes concentrações do plasmídeo; os resultados são mostrados na Fig. 7. A Figura 7a mostra os eletroferogramas correspondentes para o plasmídeo puro e todos os complexos transportados com 200 e 300 ng do plasmídeo. A distribuição das amostras de nanocompósitos para esses eletroferograma é a seguinte:Acil-CO-AuNPs (300 e 200 ng) nas pistas 1 e 2, CO-AuNPs (300 ng) na pista 3, COS @ 1-AuNPs (300 e 200 ng) em 4 e 5, COS @ 2-AuNPs (300 e 200 ng) em 6 e 7, COS @ 3-AuNPs (300 e 200 ng) em 8 e 9, COS @ 4-AuNPs (300 e 200 ng) em 10 e 11, e 300 ng de pDNA puro na pista 12. Para todos os testes, foram usados ​​10 μl de solução complexa. Esta figura mostra que apenas o pDNA viaja no gel (como evidente na pista 12) e os outros complexos de pDNA permanecem em seus poços correspondentes, confirmando desta forma a adesão do pDNA em todos os complexos. Isso se deve à interação das cargas positivas dos grupos amino da quitosana, que permanecem na superfície das nanopartículas de ouro, e das cargas negativas dos grupos fosfato das hélices do DNA.

a Eletroferogramas para nanocomplexos com concentrações de 200 e 300 ng de pDNA. A faixa 12 corresponde a pDNA puro. b CO-AuNPs e Acil-CO-AuNPs com 300 ng de pDNA, pDNA puro na pista 3. c Nanocomplexo COS @ 2-AuNPs com 300 e 350 ng de DNA, 400 ng de pDNA puro na pista 3. d mesmos CO-AuNPs e Acil-CO-AuNPs na diluição 1:10, com controle de DNA puro, respectivamente, na pista 3

To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells

As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE ^TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. al. [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells

Dye Exclusion Test

Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE ^TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.

Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells

Conclusions

Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.

Disponibilidade de dados e materiais

All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.

Abreviações

Acyl-CO:

Acylated chitosan

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

CO:

Quitosana

COS:

Chitosan oligosaccharide

DMEM:

Meio Eagle modificado por Dulbecco

FTIR:

Transformada de Fourier Infra-vermelho

PBS:

Salina tamponada com fosfato

pDNA:

Plasmid Deoxyribonucleic acid

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

Síntese em uma etapa de carbonos mesoporosos hidrofílicos dopados com nitrogênio a partir do sistema triconstituinte à base de quitosana para liberação de drogas Preparação in situ fácil e atividade antibacteriana in vitro de micelas de copolímero com prata à base de PDMAEMA