Entrega Gênica Aprimorada Usando Nanopartículas de Ouro Funcionalizadas com Quitosana, Quitosana N-Acilada e Oligossacarídeo de Quitosana

Resumo

Nanopartículas de ouro (AuNPs) são cada vez mais usadas em pesquisa biomédica devido às suas propriedades ópticas únicas, alta densidade e facilidade de modificação superficial. Apresentamos uma plataforma de entrega gênica não viral que combina AuNPs com três polímeros derivados de quitosana: quitosana nativa (CO), quitosana N-acilada (Acyl‑CO) e oligossacarídeo de quitosana (COS). Duas rotas sintéticas foram exploradas: redução química convencional com borohidreto de sódio e síntese verde one-pot onde COS simultaneamente reduz e estabiliza AuNPs. Os nanocompósitos resultantes foram totalmente caracterizados por espectroscopia UV‑Vis, potencial ζ, FTIR e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Eletroforese em gel de agarose confirmou complexação robusta de DNA plasmidial (pDNA), e a eficiência de transfeção em células HEK‑293 foi avaliada via atividade de β‑galactosidase e fluorescência de EGFP. Taxas de transfeção de 27 %, 33 % e 60 % foram alcançadas com CO‑AuNPs, Acyl‑CO‑AuNPs e COS‑AuNPs, respectivamente, demonstrando que a formulação verde baseada em COS oferece desempenho superior de entrega gênica evitando agentes redutores tóxicos.

Fundamentação

A terapia gênica baseia-se na entrega de material genético terapêutico em células-alvo. Embora vetores virais forneçam altas eficiências de transfeção, sofrem de imunogenicidade, capacidade de carga limitada e complexidade de produção. Carreadores não virais, em contraste, são mais seguros, fáceis de produzir e mais estáveis durante armazenamento. Quitosana, um polissacarídeo natural derivado de quitina, emergiu como vetor não viral promissor devido à sua carga positiva, baixa toxicidade e capacidade de proteger DNA da degradação enzimática. No entanto, a quitosana nativa é pouco solúvel em pH fisiológico e altamente viscosa em soluções ácidas diluídas, limitando sua aplicação biomédica. Modificações químicas como N-acilação aumentam a hidrofobicidade e ajustam o grau de desacetilação, enquanto a oligomerização (COS) reduz a viscosidade e melhora a captação celular devido a cadeias mais curtas.

Nanopartículas de ouro, com tamanho ajustável, ressonância de plasmon de superfície e forte afinidade por grupos amina, tiol e cianeto, são candidatas ideais para construir nanocarreadores multifuncionais. Polímeros catiônicos como quitosana podem ser enxertados em AuNPs para criar superfícies carregadas positivamente que ligam eletrostaticamente DNA plasmidial, facilitando a internalização celular. Além disso, a alta densidade de AuNPs promove captação celular rápida, e suas propriedades ópticas permitem monitoramento em tempo real da entrega.

Estudos prévios demonstraram que conjugados quitosana‑AuNP podem alcançar eficiências de transfeção maiores que lipossomos ou nanopartículas poliméricas. No entanto, a maioria das sínteses depende de agentes redutores tóxicos como borohidreto de sódio ou brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB). Neste trabalho, introduzimos uma rota de síntese verde que usa COS como agente redutor e estabilizador, eliminando químicos perigosos enquanto preserva as propriedades físico-químicas favoráveis dos nanocomplexos.

Métodos

Síntese dos Nanocompósitos

Três formulações distintas de AuNPs foram preparadas. CO‑AuNPs e Acyl‑CO‑AuNPs foram sintetizados via redução química com NaBH₄, enquanto COS‑AuNPs foram produzidos por método verde one-pot onde COS simultaneamente reduz Au³⁺ e recobre as nanopartículas.

Materiais

Cloreto de ouro(III) tri-hidratado (HAuCl₄·3H₂O), borohidreto de sódio (NaBH₄), quitosana de baixo peso molecular (50–190 kDa, 75 % desacetilação) e COS (5 kDa) foram adquiridos da Sigma‑Aldrich. Toda vidraria foi limpa com água-régia por 24 h e enxaguada com água Milli‑Q para remover traços de metais.

CO‑AuNPs

CO (2 mg mL⁻¹) foi dissolvido em ácido acético 1 % e armazenado durante a noite. A solução foi filtrada (0,22 µm) e misturada com HAuCl₄ 10 mM (1 mL) sob agitação vigorosa por 30 min. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) foi adicionado gota a gota; a cor mudou de amarelo para vermelho-vinho, indicando formação de nanopartículas. A agitação continuou por 2 h.

Acyl‑CO‑AuNPs

Acilação de quitosana de baixo peso molecular foi realizada com cloreto de caproila seguindo protocolo modificado. O gel resultante foi precipitado com acetona, lavado com metanol e seco. O gel (0,33 % em HCl 0,1 M) foi misturado com HAuCl₄ 10 mM (1 mL) e agitado por 1 h. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) foi então adicionado, produzindo solução rosa-vermelha que se coloriu completamente dentro de 2 h de agitação.

COS‑AuNPs

Para a síntese verde, COS (100–200 mg) foi adicionado a HAuCl₄ (0,003–0,017 % p/p) e agitado a 80 °C por 60 min. Quatro variantes foram preparadas, diferindo na quantidade de COS e concentração de ouro (Tabela 1). Nanopartículas foram purificadas por centrifugação (12 000 g, 30 min).

Caracterização

FTIR

Espectros FTIR (Perkin Elmer Spectrum One) confirmaram a presença de bandas de amida e a acilação bem-sucedida de Acyl‑CO. O grau de substituição (DS) foi calculado como 75 % usando a razão de absorbâncias a 1651 cm⁻¹ e 3350 cm⁻¹.

Potencial ζ

Medidas de potencial zeta (Malvern Nano Z) revelaram cargas superficiais positivas (43–55 mV) para todos os compósitos, confirmando sua adequação para ligação de DNA. Valores pós-complexação caíram, indicando adsorção bem-sucedida de plasmídeo.

UV‑Vis

Espectros UV‑Vis (400–700 nm) exibiram picos de ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) a 534 nm (CO‑AuNPs), 507 nm (Acyl‑CO‑AuNPs) e 533–536 nm (COS‑AuNPs). Espectros permaneceram inalterados após 150 dias, evidenciando estabilidade coloidal.

TEM

Imagens de TEM (JEOL JEM‑1010) revelaram nanopartículas esféricas com diâmetros de 3 a 15 nm. Distribuições de tamanho foram mais estreitas para COS‑AuNPs, refletindo monodispersidade superior.

Formação de Complexo e Ligação a DNA

Plasmídeos pSV‑β‑Gal (6,82 kb) e pIRES2‑EGFP (5,3 kb) foram purificados via lise alcalina. DNA (200–400 ng) foi misturado com cada nanocompósito em DMEM, e eletroforese em gel de agarose (0,8 % agarose, 90 V, 60 min) demonstrou retenção completa de DNA nos poços, confirmando complexação eletrostática.

Transfeção Celular

Cultura Celular

Células HEK‑293 foram semeadas a 12 000 células por poço em placas de 96 poços, atingindo ~90 % de confluência após 24 h.

Transfeção EGFP

Complexos (15 µL, 200 ng DNA) foram adicionados às células por 2 h, seguidos de 48 h de incubação em DMEM completo. Expressão de GFP foi quantificada por microscopia de fluorescência (Carl Zeiss Axio Vert.A1).

Transfeção β‑Galactosidase

Após 24 h de incubação, células foram fixadas e incubadas com solução de X‑gal. Coloração azul, indicativa de atividade de β‑galactosidase, foi observada por microscopia de campo claro (Motic AE2000). LipofectAMINE™ 2000 serviu como controle positivo.

Viabilidade Celular

Exclusão de azul de tripano (0,2 %) avaliou viabilidade 2 h pós-transfeção. Faixas de concentração foram 0,1–3 mM para CO‑AuNPs e Acyl‑CO‑AuNPs, 0,5 mM para COS@3‑AuNPs e COS@4‑AuNPs, e 0,1 mM para COS@1‑AuNPs e COS@2‑AuNPs.

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterização dos Nanocompósitos

Os COS‑AuNPs verdes foram produzidos sem reagentes perigosos, demonstrando a viabilidade de uma rota de síntese totalmente biocompatível. Espectros UV‑Vis confirmaram a formação de AuNPs, com picos LSPR consistentes em todas as formulações. Testes de estabilidade após 150 dias não mostraram deslocamento espectral, indicando excelente robustez coloidal.

Estabilidade

Espectros UV‑Vis após 150 dias para CO‑AuNPs, Acyl‑CO‑AuNPs e COS‑AuNPs confirmaram estabilidade a longo prazo.

FTIR

Espectros FT‑IR de quitosana, Acyl‑quitosana e COS mostraram bandas-chave: 1651 cm⁻¹ (amida I), 1591 cm⁻¹ (amida II).

Potencial ζ

Valores de potencial ζ: CO‑AuNPs 43,3 mV, Acyl‑CO‑AuNPs 40,2 mV, COS‑AuNPs 46,3–55,3 mV. Todos permaneceram positivos após ligação a DNA, confirmando complexação.

TEM

Micrografias de TEM: Acyl‑CO‑AuNPs 4,7 nm, CO‑AuNPs 3,5 nm, COS‑AuNPs 7,4–15,6 nm.

Complexação de DNA

Géis de agarose mostraram retenção completa de DNA em todos os nanocomplexos, enquanto plasmídeo livre migrou para o fundo. COS‑AuNPs exibiram a ligação mais forte, retendo até 350 ng de plasmídeo antes de saturação.

Eficiência de Transfeção

Em células HEK‑293, COS‑AuNPs alcançaram as maiores taxas de transfeção: 60 % com β‑galactosidase e 48 % com EGFP. Acyl‑CO‑AuNPs e CO‑AuNPs atingiram 33 % e 27 %, respectivamente. O desempenho superior de COS‑AuNPs é atribuído à sua maior razão quitosana/ouro e tamanho de partícula ótimo.

Viabilidade Celular

Exclusão de azul de tripano revelou alta viabilidade (>90 %) para COS‑AuNPs, enquanto LipofectAMINE™ 2000 e CO‑AuNPs mostraram menores taxas de sobrevivência (61 % e 78 %). COS‑AuNPs combinam, portanto, alta eficiência de transfeção com citotoxicidade mínima.

Conclusões

Fabricamos com sucesso conjugados de nanopartículas de ouro‑quitosana via rotas convencional e verde. Os COS‑AuNPs, sintetizados sem reagentes tóxicos, exibiram eficiência de transfeção superior (até 60 %) e excelente citocompatibilidade (>93 %). Sua distribuição estreita de tamanho e carga superficial positiva permitem ligação robusta de plasmídeo e captação celular eficiente. Esses achados posicionam COS‑AuNPs como plataforma promissora de entrega gênica ambientalmente amigável, adequada para desenvolvimento pré-clínico adicional.