Imunofluorescência Baseada em Nanopartículas de Ouro Permite Detecção Rápida e Sensível de Biomarcadores de Câncer Associados à Inflamação

Resumo

A detecção precoce de câncer depende da identificação de sinais inflamatórios que precedem a malignidade. Avaliamos nanopartículas de ouro (AuNPs) conjugadas com anticorpos primários como agentes de contraste direcionados para inflamação crônica em modelos de colite ulcerativa (CU) e esteatohepatite, condições que predispõem a câncer colorretal e hepático. AuNPs (7,1 nm) foram sintetizados via rota econômica e ecológica e conjugados com anti-COX-2, anti-MIF e Alexa Fluor® 488 (ALEXA). Três protocolos de imunofluorescência (IF) — incubação de 30 min e overnight, mais um protocolo de amplificação — foram comparados ao fluxo de trabalho padrão de IF ALEXA. Citometria de fluxo (FC) usou AuNPs para marcar macrófagos M2. A conjugação foi alcançada por adsorção direta, confirmada por intensidade de fluorescência comparável à ALEXA. O protocolo AuNP de 30 min reduziu o tempo total de IF de 23 h para 5 h e o tempo de FC de 4 h para 1 h, oferecendo uma alternativa que economiza mão de obra e clinicamente viável para diagnósticos de câncer impulsionados por inflamação.

Introdução

Nanopartículas de ouro (AuNPs) emergiram como sondas versáteis para imagem óptica, oferecendo propriedades ópticas ajustáveis por tamanho, alta biocompatibilidade e facilidade de funcionalização. Conjugados anticorpo-AuNP permitem detecção em tempo real de captação de ouro em células vivas, facilitando quantificação precisa de distribuição de nanopartículas em estados de doença. Historicamente, ouro coloidal foi empregado para microscopia eletrônica de antígenos bacterianos, e depois estendido a diversas aplicações biomédicas, incluindo genômica, biossensores e terapia fototérmica. Em oncologia, AuNPs amplificam sinais de fluorescência e atenuação de raios X, melhorando sensibilidade de imagem de tumores.

Baseando-se em nosso trabalho anterior demonstrando anticorpos conjugados a AuNPs para imagem de carcinoma colorretal, este estudo introduz três protocolos IF que substituem fluoróforos convencionais por AuNPs, acelerando a coloração e reduzindo consumo de reagentes. Também validamos AuNPs em FC para marcação de macrófagos M2, jogadores-chave na inflamação associada a tumores.

Métodos

Objetivo

Demonstrar que AuNPs podem substituir fluoróforos convencionais em IF e FC, fornecendo coloração mais rápida, igualmente confiável para biomarcadores de câncer impulsionados por inflamação.

Reagentes

AuCl₃, PVP (PM 10.000), NaOH, glicerol, PBS, BSA (5%), anti-COX-2, anti-MIF, anticorpo secundário Alexa Fluor® 488 e Fluoroshield com DAPI.

Síntese e Caracterização de AuNPs

AuNPs esféricas (7,1 nm) foram preparadas pela redução de AuCl₃ na presença de PVP, glicerol e NaOH, produzindo um coloide vermelho profundo. Espectros UV-vis e medidas de fluorescência confirmaram monodispersidade e ressonância plasmônica de superfície. Anticorpos foram adsorvidos diretamente sobre AuNPs, alcançando conjugados estáveis.

Modelos Animais

CU induzida por ácido acético em ratas Wistar fêmeas (n = 5) e esteatohepatite induzida por álcool em ratos Wistar machos (n = 5) foram estabelecidos per protocolos padrão. Tecidos foram fixados, incluídos e seccionados (4 µm) para IF.

Protocolos de Imunofluorescência

Três protocolos baseados em AuNP foram avaliados:

• NP1 (30 min): Anticorpo primário (1:500 COX-2, 1:400 MIF) incubado 30 min, seguido de 30 min adição de AuNP.
• NP2 (overnight): Anticorpo primário incubado 18 h, então 1 h incubação com AuNP.
• NP3 (amplificação): ALEXA diluído (1:200–1:800) misturado com AuNPs; 1 h incubação.

Protocolos padrão ALEXA (A1 overnight, A2 30 min) serviram como controles. Secções foram imageadas em um Zeiss Observer z.1 com análise quantitativa de fluorescência pixel a pixel.

Marcação de Macrófagos M2 e Citometria de Fluxo

Células RAW 264.7 foram polarizadas para M2 com IL-4 (20 ng mL⁻¹) por 48 h. Células foram incubadas com anticorpos primários COX-2/MIF e marcadas com ALEXA ou AuNPs (protocolo N1). Após fixação, amostras foram analisadas em um BD FACSCanto II; dados processados com FlowJo.

Análise Estatística

ANOVA com pós-hoc Bonferroni (IF) e teste de Dunn (FC) avaliaram significância; p < 0,05 considerado significativo.

Resultados

Microscopia

Imagens H&E confirmaram patologia inflamatória esperada. Intensidade de fluorescência de NP1 e NP2 igualou A1, e NP3 amplificou sinal, permitindo diluição dupla de ALEXA sem perda de brilho. Protocolos de curto tempo (30 min) (A2, NP1) produziram coloração comparável aos padrões overnight, demonstrando viabilidade para diagnósticos rápidos.

Citometria de Fluxo

Células RAW polarizadas por IL-4 exibiram CD163 elevado (marcador M2) e CD86 inalterado (M1). COX-2/MIF marcados com AuNP produziram intensidades de fluorescência comparáveis à ALEXA, confirmando ligação de superfície eficiente e uso mínimo de reagentes.

Espectroscopia de Fluorescência

AuNPs exibiram emissão em 650–900 nm sob excitação de 320 nm. Adsorção de anticorpo aumentou fluorescência em ~12 a.u., indicando conjugação bem-sucedida e sinal amplificado devido a redução de quenching por oxigênio.

Discussão

AuNPs possuem fluorescência intrínseca e atuam como amplificadores de sinal bloqueando acesso de oxigênio a elétrons de superfície, aumentando assim a ressonância plasmônica de superfície. Conjugação via adsorção direta fornece abordagem simples, escalável, evitando química covalente e preservando atividade do anticorpo. O protocolo NP1 reduz fluxo de trabalho total de IF em 18 h, enquanto tempo de FC cai de 4 h para 1 h, oferecendo eficiências substanciais de fluxo de trabalho. Importante, AuNPs mantêm sensibilidade para COX-2 e MIF, biomarcadores-chave em câncer colorretal associado a CU e carcinoma hepatocelular relacionado a esteatohepatite induzida por álcool. Dada a alta prevalência de inflamação crônica no risco de câncer, métodos de detecção rápidos e custo-efetivos são essenciais.

Conclusões

Protocolos IF e FC baseados em AuNP entregam intensidades de fluorescência em par com fluoróforos convencionais, enquanto reduzem drasticamente tempos de incubação e consumo de reagentes. Essas descobertas abrem caminhos para adoção clínica de AuNPs em patologia diagnóstica e potencialmente em direcionamento terapêutico de macrófagos M2.

Abreviações

A1

Protocolo padrão ALEXA

A2

Protocolo ALEXA modificado

ALD

Doença hepática alcoólica

ALEXA

Alexa Fluor® 488®

AuNP

Nanopartículas de ouro

BSA

Albumina sérica bovina

COX-2

Cicloxigenase-2

FC

Citometria de fluxo

FI

Imagem de fluorescência

IF

Imunofluorescência

MDA

Malondialdeído

MIF

Fator inibidor de migração de macrófagos

NP1

Protocolo de nanopartículas 1

NP2

Protocolo de nanopartículas 2

NP3

Protocolo de nanopartículas 3

SPR

Ressonância plasmônica de superfície

UC

Colite ulcerativa