Fabricação, caracterização e citotoxicidade de nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas de casca de ouro conjugada em forma esférica para aplicações biomédicas

Resumo

A evolução do nanomaterial na ciência trouxe um aumento crescente nos campos da nanotecnologia, biomedicina e engenharia. Este estudo teve como objetivo a fabricação e caracterização de nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas da casca de ouro-berbigão (Au-CSCaCO ₃ NPs) para aplicação biomédica. A técnica sintética empregada utilizou o método de redução de citrato de nanopartículas de ouro e um método de precipitação simples acoplado ao uso mecânico de um moinho de bolas de rolo programável. O nanomaterial conjugado sintetizado foi caracterizado por suas propriedades físico-químicas utilizando microscópio eletrônico de transmissão (TEM), microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (FESEM) equipado com energia dispersiva de raios-X (EDX) e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). No entanto, a complexidade dos mecanismos celulares pode ser um desafio para nanomateriais como Au-CSCaCO ₃ NPs e, portanto, a necessidade de avaliação da citotoxicidade. As nanopartículas de formato esférico obtidas (púrpura verde-claro) têm um tamanho médio de diâmetro de 35 ± 16 nm, alta composição de carbono e oxigênio. O nanomaterial conjugado também possui um espectro único para o polimorfo de aragonita e ligação carboxílica, apoiando significativamente as interações entre as nanopartículas conjugadas. A carga de superfície negativa e a absorbância do espectro destacaram sua estabilidade. O Au-CSCaCO conjugado de forma esférica resultante ₃ NPs podem ser um ótimo nanomaterial para aplicações biomédicas.

Histórico

A produção de nanopartículas monodispersas emergiu significativamente em aplicações eletrônicas, ópticas, biomédicas e magnéticas [1,2,3,4]. Sua evolução e a dos biomateriais melhoraram favoravelmente os produtos farmacêuticos [5], os sistemas biomédicos [6], os sistemas de distribuição de drogas [7], os cosméticos e o tratamento de água [7,8,9]. No mesmo sentido, o desenvolvimento de materiais conjugados que são biocompatíveis, biogênicos e não tóxicos podem ter contribuições valiosas para os campos da biociência e biomedicina [10]. Além disso, bio e nanomateriais conjugados metálicos biocompatíveis podem contribuir para mais avanços científicos para aplicações biomédicas, como engenharia de tecidos [5], terapêutica [11] e distribuição de drogas [12]. Isso foi demonstrado em trabalhos recentes elaboradamente, como o uso de hidrogel híbrido de colágeno-ouro de automontagem injetável [13], nanoconjugados de núcleo-casca de colágeno de ouro coloidal [14] e nano drogas sem carreador co-montadas para terapia antitumoral [15]. Uma série de estudos também documentou que nanopartículas metálicas podem produzir eletrodos de enzima em biossensores eletroquímicos com materiais inorgânicos porosos não sílica [16]. Além disso, os nano-híbridos de óxido de grafeno-albumina sintetizados também exibiram seu benefício potencial para a terapia fotodinâmica aprimorada [17]. Ao todo, isso só despertou mais interesse com outras aplicações possíveis, como imagens biomédicas e sistemas biossensoriais [16, 18].

O carbonato de cálcio como mineral natural bruto tem sido usado em uma ampla gama de aplicações, incluindo biomédica, industrial e nanotecnologia [10, 19,20,21]. A aragonita como um polimorfo de carbonato de cálcio existe ricamente na casca do berbigão ( Anadara granosa ), um moluscos popularmente, também encontrado na Malásia [22]. A aragonita é biogênica, ao contrário de outros polimorfos de carbonato de cálcio de calcita e vaterita, constituindo até 95–98% da casca do berbigão. Carbonato de cálcio, um material inorgânico do polimorfo da aragonita, existe natural e comumente dentro da casca do berbigão [23]. O polimorfo aragonita tem atraído cada vez mais atenção no campo da pesquisa devido às suas propriedades de biocompatibilidade e potencial promissor no desenvolvimento de sistemas de liberação de drogas anticâncer [24] e imagens biomédicas [25, 26]. Atualmente, a maioria dos estudos de pesquisa anteriores revelou principalmente dois métodos de produção de carbonato de cálcio [26]. Eles incluem a co-precipitação ou decomposição dupla e carbonatação de CO ₂ gás através do hidróxido de cálcio em configurações controladas, que lamentavelmente nenhum produz carbonato de cálcio biogênico [26,27,28]. Portanto, os produtos contêm uma mistura de calcita e vaterita em grandes quantidades que são inadequadas para uso biomédico devido à sua não biocompatibilidade e relatórios de alta toxicidade [26].

No entanto, com o uso crescente da nanotecnologia em aplicações biomédicas, o presente estudo está focado na síntese de nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas da casca do berbigão (CSCaCO ₃ NPs) com tamanho e formato únicos usando dodecil dimetil betaína (BS-12) [29]. Isso é inspirado por trabalhos anteriores que utilizam BS-12 como catalisador de bio mineralização na síntese de CSCaCO ₃ NPs que podem ser facilmente manipulados para bioaplicações, com baixo custo e nanopartículas relativamente puras [30]. A morfologia e o tamanho das nanopartículas sintetizadas são cruciais na determinação de suas propriedades físico-químicas, com foco nas nanopartículas metálicas devido ao seu vasto potencial de aplicações biomédicas [31]. Nanopartículas de ouro (AuNPs) têm sido continuamente utilizadas devido às suas propriedades ópticas, diferentes faixas de tamanho e cor que dependem das variações máximas de absorção ou do método de síntese empregado [32]. O tamanho e a forma dos AuNPs afetam suas características de absorção e emissão no espectro de luz visível, fazendo-os variar de regiões visíveis a próximas do infravermelho. Portanto, devido à sua síntese [33], propriedades físico-químicas [34], biocompatibilidade [35] e funcionalização de superfície [36], eles podem ser manipulados para diferentes e particulares aplicações [37]. Além disso, também foi afirmado que em diagnósticos médicos, eles não são totalmente usados ​​e seu valor possivelmente obscuro [37].

Portanto, talvez com a funcionalização apropriada, eles poderiam ser reprojetados para imagens do câncer [38], tratamento do câncer [39], administração de drogas [40] e dispositivos sensoriais [41]. Um revestimento é essencial para fabricar biomaterial nano-híbrido com propriedades funcionalizadas como nanopartículas de ouro (AuNPs) conjugadas com nano-esferas de carbonato de cálcio poroso [16, 42]. O nanomaterial de carbonato de ouro-cálcio conjugado resultante ou híbrido de nano-compósito, que poderia reter as características parentais vantajosas, como biocompatibilidade, boa solubilidade e dispersibilidade em solução [16]. Nanopartículas de ouro conjugadas que exibem forte mudança de cor e ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR) podem ser excelentes candidatos para sistemas de múltiplos receptores potenciais, como aptâmeros, peptídeos e anticorpos [35, 43,44,45]. A fabricação de polímeros conjugados solúveis em água e suas aplicações em biossensores, imagens de fluorescência e entrega de drogas foram realizadas com sucesso [46,47,48]. No entanto, as nanopartículas conjugadas ou nanomaterial têm vantagens progressivamente melhoradas, como fotoestabilidade [48, 49] e baixa citotoxicidade [50] ao longo dos anos, exceto para uma preparação mais amigável [51] e recursos de separação [48].

Com isto, os AuNPs e CSCaCO ₃ NPs são sintetizados de forma controlável e usados ​​para fabricar e caracterizar nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas de casca de ouro-berbigão conjugadas biogênicas (Au-CSCaCO ₃ NPs) cujo tamanho de diâmetro varia de 19–51 nm. Inicialmente, a preparação AuNPs é inspirada no método clássico de Turkevich [52] e nas nanopartículas derivadas da casca de berbigão usando a abordagem sintética de dodecil dimetil betaína [26]. As modificações nos parâmetros sintéticos, como concentração, podem diminuir ou aumentar de forma proficiente seu tamanho. Consequentemente, o nanomaterial sintetizado foi caracterizado e investigado quanto à citotoxicidade. O Au-CSCaCO ₃ As vantagens adicionais da preparação de NPs são; síntese fácil e eficiência de custos.

Métodos / Experimental

Materiais e reagente químico

O sal de ouro (ácido tetra-cloroáurico contendo solução de ouro a 49%) e o citrato trissódico foram adquiridos na prima nexus Sdn Bhd (Malásia). A casca de berbigão fresca foi obtida no mercado local (Pasar borong, Seri Kembangan, Selangor, Malásia). Dodecil dimetil betaína (BS-12) e corante verde de indocianina (ICG) foram adquiridos na Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino (FBS), combinação de antibióticos (glutamina 100 mmol / L, penicilina 100 U / mL e estreptomicina 100 μg / mL), solução salina tamponada com fosfato (PBS), dimetilsulfóxido (DMSO ), e MTT (corante brometo de 3-dimetiltiazo-2, 5-difiniltetrazólio) foram adquiridos de Naclai tesque, Inc., Kyoto, Japão. Todos os outros reagentes usados ​​eram de grau analítico.

Síntese de nanopartículas de ouro

A síntese foi alcançada usando um método anteriormente descrito por Verma et al. [53] com ligeiras modificações nas concentrações, 1% de ácido tetracloroáurico contendo 49% de solução de ouro. Aproximadamente 0,1% da solução de ouro foi preparada e diluída em uma série de concentrações de 15, 25 e 20 mM em diferentes frascos cônicos, respectivamente. As soluções foram então aquecidas a 100 ° C em uma placa quente acoplada à agitação magnética (6 posicionados, WiseStir ® Coréia). Então, cerca de 1% de citrato de tri-sódio foi adicionado à solução em ebulição com agitação magnética contínua até a transição de cor (a solução de ouro amarelado tornou-se incolor e depois para preta e finalmente tornou-se vermelha brilhante). O aquecimento foi desligado após 15 min e deixado resfriar à temperatura ambiente. As nanopartículas de ouro sintetizadas foram então armazenadas a - 4 ° C para uso posterior. A reação foi mostrada na equação abaixo:
$$ 2 {\ mathrm {H} \ mathrm {AuCl}} _ 4 + 3 {\ mathrm {C}} _ ​​6 {\ mathrm {H}} _ 8 {\ mathrm {O}} _ 7 \ left (\ mathrm {citric} \ \ mathrm {acid} \ right) \ a 2 \ mathrm {Au} +3 {\ mathrm {C}} _ ​​3 {\ mathrm {H}} _ 6 {\ mathrm {O}} _ 5 \ left (3- \ mathrm {cetoglutárico} \ \ mathrm {ácido} \ direita) +8 \ mathrm {HCl} +3 {\ mathrm {C} \ mathrm {O}} _ 2 $$

Preparação e síntese de nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas da casca de berbigão (CSCaCO ₃ NPs)

Três quilogramas de cascas de berbigão recém-obtidas foram cuidadosamente limpos, esfregados e lavados. O pó de casca de berbigão foi produzido de acordo com o método descrito por Islam et al. [54]. A casca do berbigão limpa foi seca em um forno (Memmert UM500, GmbH Co, Alemanha) a 50 ° C durante 7 dias. As cascas de berbigão foram moídas em pó em um liquidificador (Blender HCB, 550, EUA) e peneiradas em uma peneira de laboratório de inox (Endecott Ltd., fabricada em Londres, Inglaterra) com abertura de 90 μm para a obtenção de um pó micron. O pó foi seco durante 7 dias a 74 ° C no forno. O pó foi posteriormente embalado em saco plástico de polietileno hermético para uso posterior. As nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas da casca do berbigão foram sintetizadas de acordo com a abordagem descrita por Islam et al. [55], com pequenas modificações no método e nos parâmetros de síntese. Dois gramas de pó de casca de berbigão foram colocados em um frasco cônico de 250 ml seguidos por 50 ml de água duplamente desionizada, e uma concentração de 0,5 ml de BS-12 foi adicionada ao frasco cônico. A mistura no frasco cônico foi agitada vigorosamente a 1000 rpm, com uma temperatura de 50 ° C por 135 min, usando uma placa multi-quente sistemática e agitador magnético com pequena barra magnética. A amostra preparada foi separada do líquido mãe usando papel de filtro de anel duplo de tamanho 125 mm (Filtres Fioroni, China). O resíduo foi então lavado minuciosamente para remover o excesso de BS-12. Os produtos finais, CSCaCO ₃ NP em pó, foram embalados em um recipiente limpo a seco e secos por 3 dias (Oven Memmert UM500, GmbH Co, Alemanha) a 74 ° C. O recipiente foi devidamente embalado e selado com filme de Para após a adição de várias pequenas bolas de mármore em seu interior. O recipiente foi colocado em um moinho de bolas rolantes programáveis ​​(BML-6, Wisemix ® Coréia) na velocidade de 200 rpm por 5 dias. A amostra foi armazenada em polietileno hermético em forno para posterior utilização.

Síntese de nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas da casca de ouro-berbigão conjugado (Au-CSCaCO ₃ NPs) e Incooperação de Corante do Infravermelho Próximo (NIR)

Neste procedimento, 0,2 g de CSCaCO ₃ NPs e 5 mg de corante verde de indocianina (ICG) no infravermelho próximo (NIR) foram dispersos em 20 ml de solução colóide de ouro (pH 7) (solução de AuNPs), conforme descrito de forma semelhante por Cai et al. [16], em um frasco cônico vazio e limpo. Outras modificações de síntese foram feitas, onde a amostra foi sonicada por 20 min e incubada em um agitador magnético com uma pequena barra magnética a 200 rpm por 3 dias. A amostra foi ultra-centrifugada a uma velocidade de 10.000 rpm por 10 min para obter luz-verde-púrpura, Au-CSCaCO ₃ Composto NP. O sobrenadante foi decantado e o sedimento lavado com uma série de água desionizada. O material compósito preparado foi seco em estufa por 4 dias e armazenado em estufa de polietileno hermeticamente fechado para posterior análise.

Caracterização de nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas de casca de ouro conjugado (Au-CSCaCO ₃ NPs)

O tamanho de partícula e a morfologia do nanomaterial foram analisados ​​usando microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O nanomaterial foi disperso em álcool absoluto e sonicado por 40 min. Aproximadamente, 5 μl da solução de amostra suspensa foram pipetados para a montagem de amostra com garra de cobre. A amostra foi visualizada em TEM (Hitachi H-7100). O microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (FESEM) (modelo JOEL 7600F) operava com tensão de 5 KV e era equipado com unidade de espectroscopia de raios-X dispersiva de energia (EDX). Isso foi usado para caracterizar as características da superfície do Au-CSCaCO ₃ NPs. O material foi disperso em álcool absoluto e sonicado por 1 h. Cerca de 50 μl da solução de amostra suspensa foram pipetados para a montagem de amostra com garra de cobre, secas durante a noite e digitalizadas usando os feixes de elétrons. Além disso, o espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) também foi utilizado para a análise funcional do nanomaterial conjugado sintetizado; o nanomaterial foi calibrado em 1% em peso em Ker (FTIR Modelo 100, Perkin Elmer) na faixa de 400–4000 cm ⁻¹ . Além disso, a análise do tamanho do nanoconjugado sintetizado e do potencial zeta foi feita usando zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments). O material foi suspenso em água desionizada e sonicado por 50 min; a suspensão homogênea foi depositada na cubeta zetasizer e examinada quanto ao tamanho de partícula e potencial zeta. A presença de diferentes analitos do nanocomposto conjugado foi monitorada usando espectrofotômetro Uv-Vis (UV - 2600) em diferentes comprimentos de onda variando de 300 a 800 nm.

Cultura de células e estudos de citotoxicidade

A linha de células de adenocarcinoma de mama humano (JCRB:MCF-7) e a linha de células de fibroblastos de camundongo (JCRB:NIH3T3) foram cultivadas em DMEM (alta glicose) suplementado com 10% de FBS e combinação de antibióticos (glutamina 100 mmol / L, penicilina 100 U / mL e estreptomicina 100 μg / mL). Os frascos de cultura (cultura Eppendorf T-25 e T-75) foram incubados em dióxido de carbono 5% a 37 ° C, e as células a 80–90% de confluência foram usadas para o processo de semeadura e tratamento.

Semeadura e tratamento de células

As células foram semeadas em placas estéreis de 96 poços a uma densidade de 5 × 10 ³ células por poço e incubadas por 24 h durante a noite. Os meios em cada poço foram removidos e as células foram tratadas e co-cultivadas em réplicas com suspensão de nanocompósito conjugado (Au-CSCaCO ₃ NP) por um período de 24, 48 e 72 h. Após a exposição ao tratamento ter sido concluída, os meios nos poços foram aspirados e lavados com PBS antes de serem substituídos por outro meio fresco antes dos tratamentos experimentais.

Preparação de Au-CSCaCO ₃ NPs para tratamento

Solução estoque de Au-CSCaCO ₃ NPs a uma concentração de 1 mg / ml em meio DMEM livre de soro a 10% foram preparados. Após a semeadura celular de células MCF-7 e células NIH3T3 em placas de 96 poços, as placas foram tratadas e incubadas com diferentes concentrações em microgramas (100-1,56) do Au-CSCaCO ₃ Soluções NPs.

(MTT) 3-Dimetiltiazo-2, 5-difiniltetrazólio Reagente de preparação e protocolo de brometo

Normalmente, 5 mg de pó de reagente MTT foram dissolvidos em 1 ml de PBS facilitado por vórtice sonicador para mistura uniforme. Após a semeadura e o tratamento das células, as placas dos poços foram limpas e 20 μl de reagente MTT foram adicionados a cada poço. Imediatamente depois, as placas foram incubadas por 3-4 h para permitir a ligação do MTT à mitocôndria das células. Após a incubação, 1 ml de DMSO foi adicionado a cada um dos poços que liberou o produto de cor na solução. As placas foram mantidas em uma sala escura por 30 min, e a densidade óptica (DO) da solução foi medida com um leitor de microplacas no comprimento de onda de 570 nm [56]. Os experimentos foram conduzidos em triplicata para cada linha celular, e os valores médios foram registrados. A porcentagem de viabilidade celular foi determinada usando a fórmula abaixo.
$$ \ mathrm {Porcentagem} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {célula} \ \ mathrm {viabilidade} =\ esquerda (\ A \ Amostra / A \ Controle \ direita) \ vezes 100 $$
onde A _Amostra foi a leitura OD média de diferentes células tratadas incubadas de ambas as linhas de células e A _Controle foi a leitura OD média das diferentes células incubadas apenas em meio de cultura completo. A citotoxicidade das células foi então avaliada a partir dos valores triplicados médios e exibida como média ± desvio padrão (DP).

Análise estatística

A análise estatística dos dados foi realizada com o software SPSS (Versão 10, Chicago, EUA). Os experimentos foram realizados em triplicata e expressos como média ± desvio padrão (M ± DP). O limite de significância foi p <0,01.

Resultados e discussão

Propriedades físico-químicas do Au-CSCaCO conjugado ₃ NPs

Microscópio Eletrônico de Transmissão

O objetivo das micrografias TEM era avaliar o tamanho do Au-CSCaCO conjugado sintetizado ₃ NPs que mostram nanopartículas bem dispersas com tamanho médio de diâmetro de 35 ± 16 nm dentro da faixa de (19–51 nm). As diferenças de tamanho atribuídas às condições de síntese foram mostradas na Fig. 1.

TEM ( a , b ) imagens do Au-CSCaCO ₃ NPs caracterizando seus diferentes tamanhos de nanopartículas

Micrografias TEM do nanoconjugado mostraram diâmetro variando de 19-51 nm e nanopartículas dispersas. O nano-tamanho obtido exclusivamente pode ser atribuído às condições sintéticas controladas empregadas. Outra possível explicação para a dispersão das nanopartículas pode ser devido à camada carregada negativamente de íons citrato que auxiliou nas repulsões das nanopartículas umas das outras e também, devido à repulsão eletrostática e a camada superficial de hidratação do conjugado impedindo a agregação e aumentando a estabilidade do conjugado, conforme relatado de forma semelhante por Jazayeri et al. [56]. Além disso, o reagente de capeamento de citrato desempenha um papel na síntese, o que permitiu mais dispersão e estabilidade do conjugado de nanopartículas, conforme relatado por Rawat et al. [57]. O tamanho de partícula exclusivo mostrou as diferentes nanopartículas de ouro absorvidas dentro da matriz nanoesfera de carbonato de cálcio semelhante ao trabalho realizado por Cai et al. [16], contribuindo para o tamanho de partícula resultante observado mostrado. No entanto, este resultado também confirma relatos de que a calcita tem pouca capacidade para acomodar nanopartículas de ouro [16].

Microscopia Eletrônica de Varredura de Emissão de Campo (FESEM) e Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X (EDX)

A micrografia FESEM avaliou a morfologia e a forma das nanopartículas sintetizadas que mostram Au-CSCaCO em formato esférico e em cadeia ₃ Nanopartículas NPs com um pequeno grau de agregação, conforme mostrado na Fig. 2. O espectro elementar (Fig. 2b) analisou a composição elementar das nanopartículas conjugadas que exibe 64,98% de carbono, 13,53% de oxigênio, 0,02% de cálcio, 17,63% de cobre e 3,85% de ouro conforme apresentado na Tabela 1.

FESEM a Micrografia FESEM do Au-CSCaCO ₃ NPs que descrevem a morfologia. b Espectros EDX do Au-CSCaCO ₃ NPs

Micrografias FESEM descreveram a morfologia única como forma esférica, superfície suavizada e nanopartículas conjugadas estruturadas em forma de cadeia, cujas propriedades físicas ou químicas poderiam ser explicadas como resultado das condições de preparação e métodos sintéticos [58]. Da mesma forma, a natureza estrutural esférica exibida pelas nanopartículas conjugadas foi semelhante àquelas relatadas por Verma et al. [53], mas ao contrário do pequeno grau de agregação apresentado. Uma possível explicação para este resultado poderia ser devido às interações hidrofóbicas e eletrostáticas entre as nanopartículas de ouro e nanopartículas de carbonato de cálcio derivadas da casca do berbigão, levando a uma forte ligação [48]. Além disso, o papel do BS-12 empregado na síntese foi refletido na quebra das nanopartículas em forma esférica análoga ao trabalho documentado por Islam et al. [55]. O perfil elementar (Tabela 1) não revelou alterações significativas ao contrário do resultado esperado. Da mesma forma, os resultados observados com a composição química das nanopartículas conjugadas são documentados como mostrado anteriormente em trabalhos anteriores [26, 54].

Carga de superfície e distribuição de tamanho por intensidade

O potencial zeta das nanopartículas conjugadas foi feito, a fim de avaliar sua carga superficial, estabilidade e distribuição de tamanho por intensidade que revela carga negativa de - 16,4 ± 3,81 mV e tamanho médio das nanopartículas conjugadas de 57,97 nm, conforme revelado na Fig. 3 e Mesa 2.

a Distribuição de tamanho de partícula por intensidade do Au-CSCaCO ₃ NPs. b Potencial Zeta do Au-CSCaCO ₃ NPs mostrando a carga superficial

O potencial zeta é um ensaio importante na avaliação da carga eletrostática da superfície das nanopartículas, que foi determinada usando zeta sizer. Isso explica ainda mais a dispersão do nanomaterial em solução, permitindo-nos compreender a estabilidade geral, a vida útil das nanopartículas, as interações das partículas entre as partículas carregadas e suas implicações [59]. A avaliação do potencial zeta do nanomaterial conjugado indicou estabilidade das nanopartículas a -16,4 mV e um índice de polidispersidade (PdI) inferior a 0,5. Uma possível explicação poderia ser atribuída à presença de mais eletro-repulsão entre as partículas em suspensão durante a medição. Além disso, as tendências de aglomeração também podem ter influenciado a distribuição de tamanhos levando a maiores tamanhos devido aos métodos sintéticos. Estudo prévio de Hoque et al. documentou de forma semelhante [60] que o potencial zeta altamente positivo ou negativo diminui a agregação e aumenta a estabilidade. Além disso, as diferenças físico-químicas das nanopartículas sintetizadas podem ser atribuídas aos métodos de síntese utilizados. Os trabalhos de Kanaujia e colegas de trabalho [61] também enfatizaram que maiores valores negativos ou positivos de potencial zeta indicam estabilidade e evitam a agregação de partículas, por causa da repulsão elétrica que estabiliza eletricamente a dispersão de nanopartículas também relatada por Isa et al. [62].

Espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)

O espectro FTIR de Au-CSCaCO ₃ NPs mostram que o pico mais notável apareceu em 1455,09 cm ⁻¹ seguido por picos observados em 1059,12 cm ⁻¹ , 854,80 cm ⁻¹ e 464,16 cm ⁻¹ , respectivamente. Além disso, picos fracos foram observados em 706,40 cm ⁻¹ e 1785,68 cm ⁻¹ conforme apresentado na Fig. 4.

Espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier dos principais picos característicos de Au-CSCaCO ₃ NPs. Todas as marcas correspondem às frequências discutidas no texto

O espectro FTIR de Au-CSCaCO ₃ NPs conforme apresentados mostraram que o pico mais notável apareceu em 1455,09 cm ⁻¹ , atestando as ligações oxigênio-hidrogênio (O – H) presentes em grupos carboxílicos de nanopartículas de ouro [14] e nanopartículas de casca de berbigão, seguidas por picos que melhor mostraram a presença de marcador polimorfo de aragonita observado em 1059,12 cm ⁻¹ , 854,80 cm ⁻¹ e 706,40 cm ⁻¹ , que são conhecidos por relatar o grupo alquil ocorrendo nas nanopartículas derivadas da casca do berbigão que eram consistentes com os picos do espectro [55]. Da mesma forma, o pico fraco foi observado em 1785,68 cm ⁻¹ devido à presença de grupo carboxílico [54], e um pico adicional foi observado em 464,16 cm ⁻¹ . Todos os picos mostraram características significativas da presença de ligações covalentes, ligações carbono-carbono (C – C), carbono-oxigênio (C – O) e carbono-nitrogênio (C – N), cujos grupos funcionais apropriados estavam presentes em nosso conjugado nanopartículas. O FTIR essencialmente identificou os grupos funcionais presentes, obtendo os picos do espectro infravermelho do nanomaterial conjugado e, simultaneamente, coletando dados de alta resolução espectral ao longo de uma ampla faixa espectral (400-4000 cm ⁻¹ ) [63]. No entanto, é relatado que o polimorfo de calcita de carbonato de cálcio tem picos variando de 2.000 a 2.900 cm ⁻¹ com as nanopartículas fabricadas pelo método de carbonatação [64].

Espectrofotômetro Uv-Vis

As nanopartículas conjugadas sintetizadas mostram um pico de absorção pesado a 530 nm, como mostrado na Fig. 5.

Espectro de absorbância do espectrofotômetro Uv-Vis do Au-CSCaCO ₃ NPs conforme discutido no texto

As nanoestruturas de ouro têm uma ampla absorvância de luz devido ao efeito de ressonância de plasmon de superfície localizada de AuNPs [65, 66]. Uma série de relatórios têm mostrado que as partículas de ouro freqüentemente têm um pico de absorbância nítido observado entre 500-520 nm [66,67,68,69]. Esta técnica permitiu uma avaliação adicional do conjugado Au-CSCaCO ₃ Tamanho, concentração e nível de agregação das NPs [65]. A banda de absorbância também é conhecida por mudar para comprimentos de onda menores, indicando a redução nos tamanhos de partícula, e a forma simétrica do espectro de absorção indica uma distribuição de tamanho de partícula estreita [70], confirmando assim nosso Au-CSCaCO conjugado ₃ NPs que exibiram um pico de absorção mais amplo entre 500-550 nm e o ponto mais alto no comprimento de onda de 530 nm. Aceitavelmente, na região do espectro visível no infravermelho próximo, na qual a luz é facilmente atenuada pelo tecido e o pico de absorção muda significativamente para um comprimento de onda mais longo [71]. Uma possível explicação para isso poderia ser devido à síntese e conjugação do nanomaterial. Também consistente com Srinath et al., Que revelou que a posição da banda de absorção depende principalmente da variação de cor, agregação e espécies adsorvidas na superfície [72]. Além disso, o espectro de absorção das nanopartículas pode mudar dependendo da cor, morfologia e tamanho devido à propriedade de ressonância do ouro plasmon [73]. Nanoestruturas com propriedades fototérmicas NIR têm capacidade de espalhar luz fortemente, o que tem aplicações significativas em imagens biomédicas [74, 75].

Estudos de Citotoxicidade

MTT (brometo de 3-dimetiltiazo-2, 5-difiniltetrazólio)

Estudos de citotoxicidade em células de carcinoma de mama humano (MCF-7) e células de fibroblastos embrionários de camundongo (NIH3T3) revelam que o Au-CSCaCO ₃ NPs inibiram mais de 70% da proliferação celular, causando morte de células cancerosas e quase 40% de inibição de células de fibroblastos na dosagem de 100 μg. O IC ₅₀ e doses de concentração mais baixas, como 25 μg, também se mostraram tóxicas para as células cancerosas, revelando baixa viabilidade celular e também inibindo mais de 50% da proliferação celular das células cancerosas para as nanopartículas. Por outro lado, dosagens de concentração idênticas para as células de fibroblastos mostraram viabilidade celular aumentada e consistente das células de fibroblastos. O IC ₅₀ exibiu até 80% de viabilidade celular das células de fibroblastos, conforme apresentado na Fig. 6.

Avaliação da citotoxicidade do Au-CSCaCO tratado com MCF-7 e NIH3T3 ₃ Células NPs usando o ensaio MTT dando a porcentagem de viabilidade celular

3-Dimethylthiazo-2,5-diphynyltetrazolium Bromide (MTT) is a colorimetric assay acceptably used to determine cell viability [76]. Utilizing mitochondrial enzymes in the electron transport chain [77], viable cells with active metabolism converted MTT into purple-colored formazon crystals in the cellular cytosol [78]. The crystals were dissolved after cell lysis on adding an organic solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) which is proportional to live cell number, unlike dead cells, due to cytotoxicity that are unable to carry out the reaction [79]. The conjugated nanoparticles displayed consistent cell death against the cancer cells and reliable cell viability of the fibroblast cells with concentration doses ranging from 25–100 μg. Furthermore, attesting low cytotoxicity and highlighting the biocompatibility of Au-CSCaCO₃ NPs and potential usefulness for biomedical applications, the cytotoxicity could be due to the internalization of the nanoparticles which possibly triggered intracellular responses and thus induced cellular damage because of interaction with cell organelles. Despite contrary cytotoxicity findings with works done on HeLa cells (human cervical cancer cell line) due to nanoparticles inducing oxidative damage [35, 80], Zhang et al. demonstrated the biocompatibility of the nanoparticles and its likely use for drug delivery systems [80]. Similarly, reports of gold nanoparticles confirmed nontoxic dependent on their size [81] and concentration [39]. Studies strongly confirmed that biogenic gold conjugates are stable and nontoxic nanocarrier used in biomedical application [35, 39] suggesting use for biomedical applications such as drug delivery and cancer therapy [82].

Conclusions

Spherical-shaped conjugated gold-cockle shell-derived calcium carbonate nanoparticles (Au-CSCaCO₃ NPs) were obtained. The conjugated nanoparticles were synthesized using a simpler, environmental friendly, and cost-efficient synthetic approach. Furthermore, based on the results, the obtained conjugated nanoparticles were relatively pure and stable. The source of material used for the cockle shell-derived nanoparticles is biogenic, readily available, and naturally occurring as seawater mollusca cockle shell. Based on the presented evidences, the conjugated Au-CSCaCO₃ NPs could be a good biomaterial for biomedical applications.

Abreviações

Au-CSCaCO₃ NPs :

Synthesized Conjugated Gold-Cockle Shell Derived Calcium Carbonate Nanoparticles

AuNPs:

Gold nanoparticles

BS-12:

Dodecyl dimethyl betaine

C–C:

Carbon-carbon bond

C–N:

Carbon-nitrogen bond

C–O :

Carbon-oxygen bond

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

EDX:

Energy dispersive X-ray

FBS:

Fetal bovine serum

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FRGS:

Fundamental Research Grant Scheme

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

HeLa cells:

Human cervical cancer cell line

IC₅₀ :

50% inhibition concentration

ICG:

Indocyanine green dye

JCRB:

Japanese Collection Research Bioresource

LSPR:

Ressonância de plasmon de superfície localizada

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

MTT:

3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazolium Bromide Dye

NIH-3T3:

Mouse embryonic fibroblast cell line

NIR:

Near infrared

O–H:

Oxygen-hydrogen bond

OD:

Optical density

PBS:

Phosphate-buffered saline

TEM:

Transmission electron microscope

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