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Síntese biogênica, caracterização e avaliação do potencial antibacteriano de nanopartículas de óxido de cobre contra Escherichia coli

Resumo


O desenvolvimento de resistência aos antibióticos usados ​​no tratamento de infecções bacterianas, juntamente com a prevalência de resíduos de medicamentos, apresenta problemas de saúde pública significativos em todo o mundo. Os germes resistentes aos antibióticos resultam em infecções difíceis ou impossíveis de tratar. A diminuição da eficácia dos antibióticos exige o rápido desenvolvimento de antimicrobianos alternativos. A este respeito, nanopartículas (NPs) de óxido de cobre (CuO) manifestam uma nanoestrutura inorgânica latente e flexível com notável impacto antimicrobiano. A síntese verde de NPs de CuO foi realizada no estudo atual, que foi então dopado com quantidades variáveis ​​de gengibre ( Zingiber officinale , ZO) e alho ( Allium sativum , AS) extratos. Em doses baixas e altas, o composto sintetizado foi usado para medir a eficácia antimicrobiana contra Escherichia coli patogênica . A presente pesquisa demonstrou com sucesso uma técnica de síntese ecológica e renovável com materiais naturais que é igualmente aplicável a outros NPs de óxido de metal verde.

Introdução


As plantas herbáceas e condimentadas indígenas incluem propriedades antioxidantes e antibacterianas valiosas que são empregadas no tratamento humano e veterinário [1]. As plantas medicinais que contêm propriedades antimicrobianas incluem alho, gengibre, nim, açafrão, tulsi, etc. e, entre estes, o alho e o gengibre são famosos por seu uso medicinal [2]. Zingiber officinale comumente conhecido como gengibre é uma raiz de planta indígena pertencente à família Zingiberaceae. Ele contém gingerol, shogaol, curcumina e paradol como fitoquímicos importantes [3]. A atividade antimicrobiana contra uma ampla gama de micróbios tem se manifestado pelos extratos aquosos de gengibre, devido ao seu conteúdo fenólico de natureza terapêutica [4]. Allium sativum comumente conhecido como alho contém compostos fenólicos exibindo uma atividade antibacteriana de amplo espectro, mesmo contra bactérias MDR [5]. Allium sativum exibiu atividade antibacteriana de amplo espectro contra uma série de bactérias Gram-positivas e várias bactérias Gram-negativas [6].

Explorar o conhecimento da nanotecnologia em nível molecular e atômico serve como base para aplicar uma abordagem integrativa para desenvolver novos compostos com características únicas para uso em aplicações de amplo espectro [7]. Aplicações medicinais, agrícolas, conservantes de alimentos e cosméticas de nanopartículas devido às suas propriedades inerentes incomparáveis ​​levaram a uma maior exploração por pesquisadores [8, 9]. Várias aplicações biológicas de nanopartículas de óxido de cobre foram demonstradas com sucesso, incluindo potenciais antimicrobianos, compostos terapêuticos eficazes, transportadores de distribuição de drogas, fotocatalisadores, detecção de gás, estabilidade fotovoltaica, efeito de confinamento quântico e sondas biológicas [10,11,12,13,14]. A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é desencadeada por nanopartículas devido à sua natureza semicondutora, trazendo transformações oxidativas e degenerativas em nível celular resultando na destruição das paredes celulares bacterianas e liberação de conteúdos celulares [15]. Muitos métodos têm sido praticados para a síntese de nanopartículas, ou seja, síntese química, física e biológica [16]. A redução de compostos metálicos resulta na produção de nanopartículas utilizando qualquer bioquímico ou microorganismo, plantas ou seus extratos [17].

Escherichia coli ( E. coli ), um habitante natural do intestino e parte da flora intestinal, tem uma posição distinta no mundo microbiológico devido às suas propriedades potencialmente virulentas [18]. A existência de virulência depende do número de genes em E. coli isolados e, em alguns casos, transferência horizontal de genes de resistência também foi revelada [19, 20], o que pode criar um problema de saúde em seres humanos, animais [21] e um desafio para a segurança alimentar [22]. E. coli é o agente causador da mastite em vacas leiteiras e búfalas e foi considerado responsável por um grande declínio na produção de leite e consequentes perdas econômicas [23, 24], que desenvolveram genes de resistência, ou seja, β-lactamases de espectro estendido (ESBLs) ou sobre- cefalosporinases expressas (AmpCs) [25]. Falha de tratamento associada a E. coli infecções são consideradas como uma ameaça latente levando à resistência a múltiplas drogas em medicamentos humanos e veterinários [26].

Nanopartículas com suas características antimicrobianas características têm o potencial de matar cerca de 600 células em contraste com a capacidade do antibiótico de tratar apenas algumas doenças de origem infecciosa [27]. O presente estudo visa explorar, avaliar e comparar o possível potencial antimicrobiano de nanopartículas de CuO verdes e quimicamente sintetizadas e extratos de raízes de ervas comuns de Allium sativum (AS) e Zingiber officinale (ZO), contra E. patogênica coli como alternativas aos antibióticos para superar os desafios de resistência emergentes.

Métodos


O presente estudo teve como objetivo investigar a ação bactericida de NPs de CuO fitoquimicamente reduzidos contra raízes de ervas de Allium sativum (AS) e Zingiber officinale (ZO), um isolado de mastite bovina.

Materiais


Nanopartículas de CuO quimicamente fabricadas foram adquiridas da Sigma-Aldrich, enquanto as raízes ZO e AS foram adquiridas do mercado local de frutas e vegetais de Lahore, Paquistão. As raízes de ZO e AS foram secas à sombra para atingir o peso uniforme. Meio de crescimento para E. coli e produtos químicos de grau analítico foram utilizados sem modificação.

Extração aquosa de raízes ZO e AS


As raízes secas de ZO e AS foram moídas ultrafinas em pós finos que foram armazenados em potes herméticos. Agitação robusta de 30 min a 70 ° C para mistura de raízes em pó fino com água destilada-DIW foi realizada na proporção de 1:10. A filtração das soluções preparadas foi realizada usando papel de filtro Whatman No. 1 após o resfriamento das soluções e o armazenamento do filtrado foi realizado a 4 ° C para o próximo experimento [28] como exibido na Fig. 1a.

Visão geral de a extração aquosa de Zingiber officinale e Allium sativum raízes, b síntese verde de CuO NPs

Síntese Verde de CuO


Nitrato cúprico tetra-hidratado (0,1 M) foi misturado com diferentes concentrações, isto é, 3 mL, 6 mL e 12 mL de extratos de ZO e AS sob agitação contínua. NaOH (2 M) foi usado para manter o pH 12 da solução agitada durante 2 h a 90 ° C para a formação de precipitados. A centrifugação dos precipitados foi realizada a 10.000 rpm por 20 min, seguida por lavagem com água DI e secagem durante a noite em um forno de ar quente a 90 ° C [29], conforme retratado na Fig. 1b.

Caracterização


O espectrofotômetro de UV-visível GENESYS-10S foi usado para verificar o espectro de absorção de nanopartículas de CuO e extratos aquosos de ZO e AS entre comprimentos de onda de 200 a 500 nm [30]. A análise estrutural e de fase dos NPs de CuO foi realizada usando difração de raios-X (XRD) BRUKER D2 Phaser com 2 θ =(10 ° -80 °) equipado com radiação Cu Kα de λ =1,540 Å [31]. A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR) foi realizada para a análise de grupos funcionais em NPs de CuO e extratos aquosos de ZO e AS [31]. Microscopia eletrônica de varredura (JSM-6610LV SEM) acoplada a detector EDS foi realizada para a observação da constituição elementar e morfológica de NPs de CuO. Imagens TEM de alta resolução e padrões SAED foram obtidos usando o microscópio JEOL JEM-2100F [32].

E. coli Isolamento e identificação

Coleção de amostras


Vacas e búfalos com mastite clínica foram rastreados e identificados em várias fazendas de gado para a coleta de amostras de leite.

E. coli Isolamento


O ágar MacConkey foi usado para espalhar e cultivar leite em triplicado para isolamento de colônias purificadas de E. coli [33]. Difusões de disco de colônias distintas de E. coli foram avaliados para verificar a susceptibilidade contra antibióticos específicos observando as diretrizes do Comitê Nacional para Padrões de Laboratório Clínico (NCCLS) para isolar E. coli .

Identificação de E. coli


Identificação e confirmação de E. coli as colônias foram realizadas com base na coloração de Gram; distinguir caracteres morfológicos e testes bioquímicos, ou seja, vermelho de metila e testes de catalase com perspectiva para o Manual de Bacteriologia Sistemática de Bergey. A cultura de isolados em ágar eosina azul de metileno (EMB) foi realizada para E. coli distinção e ratificação de mastitógenos Gram-negativos relacionados.

Avaliação do potencial antibacteriano in vitro de CuO NPs contra E. coli


Uma série de experimentos foram realizados para avaliar in vitro potencial antibacteriano de NPs CuO dopados com extrato contra E. coli . In vitro os ensaios foram conduzidos usando 10 patogênicos E. coli isolados para a avaliação do potencial antibacteriano de CuO NPs. A avaliação do método de difusão em disco foi usada para avaliar in vitro potencial antimicrobiano. As placas de Petri foram esfregadas com crescimento ativado de E. coli 1,5 × 108 CFU / mL (0,5 Mcfarland padrão) em ágar MacConkey [34]. Uma broca de cortiça estéril foi usada para preparar poços de 6 mm de diâmetro nas placas de Petri. Extratos aquosos de ZO e AS , juntamente com extratos dopados verdes e nanopartículas de óxido de cobre sintetizadas quimicamente em diferentes concentrações, foram aplicados nos poços. O potencial antimicrobiano de extratos aquosos de ZO e AS juntamente com extratos dopados verdes e nanopartículas de óxido de cobre sintetizadas quimicamente foi avaliado incubando aerobicamente as placas de Petri a 37 ° C durante a noite medindo as zonas de inibição (mm) usando o compasso Vernier. A análise estatística das zonas de inibição (mm) foi realizada usando ANOVA de uma via e visualizando ( p <0,05).

Resultados e discussão


A espectroscopia UV-Vis de NPs CuO dopados e extratos aquosos de ZO e AS foi realizada para investigar o comportamento óptico, conforme mostrado nas Fig. 2a, b. Para a formação subsequente de CuO NPs, a mudança gradual de cor do vinho para o negro de carvão foi observada enquanto a otimização de NPs sintetizados por meio de extratos acústicos abobadados foi realizada. Picos de absorção dos extratos aquosos ZO e AS em 275 e 280 nm foram observados. Resultados descritos λ máximo para CuO dopado com ZO e AS a 250 nm, representando a proporção de 6 mL:1 com redshifts e blueshifts característicos, respectivamente [35]. Picos amplos especificaram aglomerados de partículas e transição de elétrons para bandas de condução da fase de valência com extratos concentrados em CuO conforme divulgado por fortes bandas de absorção [36]. Em NPs de CuO sintetizados verdes, a absorção reduzida foi observada pelo aumento ou redução do volume do extrato, além do valor otimizado (6 mL:1).

Espectros de absorção de NPs CuO dopados com a ZO b Extrato de AS e NPs de CuO espectros PL com c ZO e d Extratos AS, respectivamente

Além disso, foi notável observar que as estruturas semicondutoras confirmaram suas características físicas para os efeitos de tamanho quântico nanométrico existentes. Os espectros de PL de NPs de CuO dopados com ZO e AS com comprimento de onda de UV excitante de 300 nm são apresentados na Fig. 2c, d. Os três picos de emissão em 418, 561 e 664 nm foram representados em cada gráfico PL puro e dopado de CuO (região UV) [37]. Uma banda de luz violeta-azul encontrada em 418 nm é um pico de emissão de CuO padrão próximo à borda da banda [38, 39]. Em 430 nm, a borda do ombro pode ser devido a vacâncias de CuO, que é um semicondutor do tipo p. A borda verde amarelada é responsável pelos defeitos de profundidade em baixas temperaturas a 561 nm. Os picos de emissão vermelha em 664 nm são responsáveis ​​por diferentes condições de cobre ou a presença de vacâncias individuais de oxigênio ionizado [40, 41]. A existência diversa de emissões visíveis no espectro violeta-azul, amarelo-verde e vermelho indica que as partículas de CuO estudadas têm uma alta relação volume-superfície e uma infinidade de condições superfície-volume e defeitos (vazios ou intersticiais) que produzem faixas de armadilha para emissão [40, 42].

O XRD foi realizado para avaliar a estrutura cristalina, composição e escala de NPs de CuO conforme apresentado na Fig. 3a, dopado com ZO e AS, respectivamente. O aumento da cristalinidade foi demonstrado por picos detectados em 2 θ =38,7 °, 48,6 °, 53,5 °, 58,3 °, 61,7 ° e 66,2 ° com os planos de cristal correspondentes (111), (−202), (020), (202), (−113) e (022), respectivamente. Os picos detectados garantiram a presença da fase monoclínica CuO sincronizada com o cartão JCPDS nº:00–002–1040 [43]. O tamanho de cristalito característico medido usando D =0,9 λ / β cos θ verificou-se ser 24,7 e 47,6 nm para CuO dopado com ZO e AS, respectivamente, e o tamanho do cristalito da amostra original foi de 27,4 nm. Vários produtos naturais foram identificados como agentes de cobertura e redução do tamanho médio de cristalito em extratos AS e ZO [44].

Padrões de XRD de CuO NPs sem e com dopagem de a AS b ZO

Os grupos funcionais de AS e ZO extrato dopado CuO NPs foram examinados com FTIR como ilustrado na Fig. 4a, b, correspondentemente. O pico amplo em 3314 cm −1 endossou a presença de grupo hidroxila e a amplitude do pico representa C =O direto com (N – H) aminas [45]. O pico intenso em 1638 cm −1 correspondeu a CH 2 –OCH 3 grupo existente em 6-snogal e 6-gingerol de ZO encontrou redução substancial de CuO. As ligações simples típicas de Cu – O vistas em 478,8 cm −1 na forma de torção foram devido a fortes modos de vibração [46]. Todos os picos sugerem que os grupos álcool, amina e cetona resultaram em quelação e proteção de flavonóides, substâncias químicas vegetais e proteínas [47].

Espectros FTIR de a AS b NPs CuO dopados com ZO

FE-SEM foi usado para estudar as características de superfície e escala de CuO NPs dopados com ZO e extrato de AS, como mostrado na Fig. 5a-d ′. As imagens FE-SEM mostram que os NPs de CuO são extremamente aglomerados na morfologia esférica. A interferência magnética e a conformidade dos polímeros entre as partículas podem apresentar aglomeração entre as partículas [48]. A dopagem de ZO e AS com CuO foi evidente pelas imagens que mostram a formação de aglomerados e o tamanho de partícula parece <1 μm, conforme ilustrado na Fig. 5b – d ′.

Imagens CuO NPs tiradas com FESEM a CuO, b - d CuO dopado com ZO e b ′ - d ′ NPs CuO dopados com AS, respectivamente

A espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDS) ilustrou a composição química com investigação elementar de amostra pura e NPs de CuO dopados com extratos de raiz ZO e AS por fases inveteradas de CuO, como mostrado na Fig. 6a-d ′. Três picos correspondentes à alta pureza do Cu confirmado por EDS das amostras testadas em comparação com o oxigênio precursor entre 1 e 10 keV. A ressonância de plasmão de superfície (SPR) de CuO NPs resultou em picos de absorção [49]. 83,7%, 15,2% e 0,6% foram observados para peso atômico por meio de espectros de Cu, O e Ca, respectivamente, para a amostra de controle, enquanto 82,8%, 14,8% e 2,4% para a amostra dopada com ZO e otimizada (6 mL:1) observados através de espectros para Cu, O e Zn, respectivamente. Da mesma forma, foram encontrados 65,3, 29,6 e 4,6 para Cu, O e S com dopagem AS, respectivamente. Os compostos atômicos suplementares que aparecem em EDS responderam ao suporte de amostra SEM usado durante a análise [50].

Espectros EDS de CuO NPs a CuO puro b - d CuO dopado com ZO e b ′ - d ′ NPs CuO dopados com AS, respectivamente

A estrutura exclusiva e característica de CuO NPs foi posteriormente avaliada usando HR-TEM a 50 nm, conforme exibido na Fig. 7a-l. Imagens HR-TEM revelaram nanopartículas adornadas semelhantes às imagens FE-SEM, junto com maior aglomeração enquanto o tamanho mede menos de 50 nm. A presença de fitoquímicos em NPs CuO dopados com ZO e AS também foi confirmada com imagens HR-TEM [51]. Nenhuma imperfeição ou deformidade foi observada na estrutura de rede integral de NPs CuO dopados com ZO e AS [52]. Micrografias filtradas foram apresentadas pelos resultados de HR-TEM juntamente com a transformada rápida de Fourier [FFT] da área especificada representada pelo quadrado amarelo na Fig. 7b, d, f, h, j, l apresentando características estruturais e atômicas de alta resolução. As dimensões médias de partículas HR-TEM são precisamente combinadas com os tamanhos de cristalitos observados durante a análise de XRD e SEM [53].

a , b HR-TEM, a - f franjas de rede de 3 mL, 6 mL e 12 mL de CuO dopado com ZO g - l franjas de rede de 3 mL, 6 mL e 12 mL de NPs de CuO dopados com AS, respectivamente

A análise XPS de CuO dopado com Gi e Ga CAE representando C 1 s e Cu 2 p espectro é mostrado na Fig. 8a, b. O C1 s intervalo indicou a presença de quatro picos distintos Fig. 8a com grupos funcionais distintos como C (H, C) (284,39 eV), C (N) (285,6 eV), C (O, =N) (287,0 eV) e C – O –C (288,75 eV) [54,55,56]. Principalmente, a Fig. 8b representou Cu 2 p padrão de CuO dopado com picos em energias de ligação de 933,3 e 953,3 eV correspondentes a Cu 2 p 3/2 e Cu 2 p 1/2 a órbita do spin indica o estado de oxidação divalente da amostra preparada. Os picos relevantes em 942,2 e 962 eV referem-se a picos de satélite de Cu 2 p 3/2 e Cu 2 p 1/2 que parecia principalmente devido ao 3 d parcialmente preenchido 9 orbital em estado de oxidação bivalente [57].

a , b Análise XPS de NPs CuO dopados a C1s b Cu 2p

O método de difusão em poço foi aplicado para a avaliação do potencial bactericida de extratos aquosos de ZO e AS e NPs de CuO sintetizados medindo as áreas de inibição após incubar as placas de Petri por 24 h, conforme mostrado na Fig. 9a-d, Arquivo adicional 1:Fig. S1 e tabulado na Tabela 1. Os resultados revelaram que a concentração de NPs e as zonas de inibição responderam sinergicamente. Zonas de inibição significativas encontradas para a amostra 1 (3 mL:1), amostra 2 (6 mL:1) e amostra 3 (12 mL:1) foram (1,05-1,85 mm) e (1,85-2,30 mm) usando diminuição (↓) e concentrações aumentadas (↑), respectivamente, para nanopartículas de CuO dopadas com ZO ( p <0,05), Fig. 9a. Da mesma forma, NPs dopados com AS exibiram zonas de inibição (0,65-1,00 mm) apenas na concentração máxima, Fig. 9b. NPs dopados com AS demonstraram eficácia zero contra E. coli em concentrações mínimas. O extrato ZO representou o efeito na concentração diminuída (↓) em comparação com a concentração aumentada (↑) mostrando zona de 1,55 mm, da mesma forma, nenhum efeito antibacteriano dos extratos de AS foi encontrado em ambas as concentrações diminuídas (↓) e aumentadas (↑). O controle positivo tratado com ciprofloxacina apresentou zona de 4,25 mm, enquanto o controle negativo tratado com DIW exibiu 0 mm. A eficácia bactericida% idade foi elevada de 24,7 para 43,5% e 43,5-54,1% para NPs dopados com ZO em concentrações mínimas e máximas, respectivamente (Fig. 9c). Da mesma forma, 15,3-23,5% de eficácia resultou na concentração máxima apenas para NPs dopados com AS (Fig. 9d). Em resumo, CuO dopado com extrato de ZO e otimizado a 6 mL:1 manifestou maior potencial bactericida contra E. coli de origem de mastite bovina ( p <0,05) como mostrado na Fig. 9a, b.

a - d Atividade antibacteriana in vitro de CuO NPs a dopado com ZO na dose ↓ e ↑, b dopado com AS em ↓ e ↑ doses, respectivamente, c eficácia% idade dopada com ZO e d eficácia% idade dopada com AS

O potencial bactericida das nanopartículas depende do tamanho das NPs, da estrutura morfológica e da razão entre a superfície e a massa. As espécies reativas de oxigênio (ROS) são consideradas responsáveis ​​pela formação de zonas de inibição por nanopartículas de CuO [58, 59]. A desnaturação da proteína celular resultou através da geração de espécies reativas de oxigênio prejudiciais (ROS) [60]. Algumas espécies reativas exibiram papéis importantes na fotocatálise, como radicais hidroxila e superóxido e buracos [61]. Síntese de espécies reativas de oxigênio (ROS) e liberação de íons metálicos são as principais características que manifestam as mudanças estruturais de enzimas e proteínas, resultando em danos irreparáveis ​​ao DNA e subsequente morte bacteriana [62]. Da mesma forma, o estresse oxidativo produzido por espécies reativas de oxigênio (ROS) é considerado o principal contribuinte para a fotocatálise [63]. A produção de ROS é inversamente proporcional ao tamanho das nanopartículas, ou seja, quanto menor o tamanho das NPs, maior é a produção de ROS que, consequentemente, danifica a membrana bacteriana, resultando na extrusão do conteúdo citoplasmático e degradação do DNA levando à explosão bacteriana, conforme retratado na Fig. 10. Ao mesmo tempo, o Cu carregado positivamente interage eletrostaticamente com a membrana bacteriana carregada negativamente, resultando na desintegração celular e, finalmente, na destruição bacteriana [58, 64, 65]. Duas respostas têm sido propostas como potenciais para o mecanismo bactericida de nanoestruturas. Um envolve uma melhor ligação entre os cátions Cu 2+ e células bacterianas, levando à formação de seções negativizadas e eventual colapso. O outro envolve a excitação eletrônica da superfície da banda de saia de CuO por meio de excitação. Além disso, o elétrico O 2 a reação produz O 2− radicais, levando à formação de H 2 O 2 . O O 2− gerado as espécies são essenciais para a quebra de moléculas de lipídios ou proteínas na membrana celular externa das bactérias [58, 66].

Ilustração da ação bactericida de NPs de CuO

Conclusões


Potencial bactericida de NPs de CuO dopados com Zingiber officinale e Allium sativum extratos contra E. patogênica coli foi avaliada neste estudo, produzida com o objetivo de antimicrobianos alternativos, econômicos e eficazes. O papel significativo dos ingredientes fitoquímicos dos extratos ZO e AS foi revelado na síntese biogênica de NPs de CuO, enquanto os efeitos sinérgicos dos flavonóides com CuO foram encontrados para ser dependente da concentração, explorando o potencial bactericida contra o patogênico E. coli . O FTIR foi realizado para confirmação da dopagem dos extratos ZO e AS e os picos de DRX confirmaram a fase monoclínica e a estrutura esférica com tamanhos médios de 24,7 nm (dopado com ZO) e 47,6 nm (dopado com AS). A morfologia esférica foi confirmada com imagens FESEM juntamente com um conglomerado exorbitante de NPs de CuO. Nanopartículas embelezadas revelaram maior aglomeração em imagens TEM com tamanho inferior a 50 nm. Para amostras dopadas com extratos de raiz, o espaçamento entre camadas de nanopartículas de CuO medido como 0,23 nm foi considerado compatível com os padrões de XRD. Os resultados deste estudo sugerem que o potencial antibacteriano de NPs CuO sintetizados em verde pode ser antecipado como agentes bactericidas alternativos para corrigir as preocupações relacionadas à resistência a antibióticos e resíduos. Pode-se concluir que os NPs de CuO dopados com ervas nativas são agentes antibacterianos econômicos, eficazes e amigos da natureza.

Disponibilidade de dados e materiais


Todos os dados estão totalmente disponíveis sem restrição.

Abreviações

EDS:

Espectroscopia de raios-X de dispersão de energia
fcc:

Cúbico centrado no rosto
FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
G + ve:

Gram positivo
G −ve:

Gram negativo
JCPDS:

Comitê conjunto sobre padrões de difração de pó
CuO:

Óxido de cobre
nm:

Nanômetro

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