Fabricação de nanoestruturas híbridas baseadas em nanoaglomerados de Fe3O4 como agentes teranósticos para imagens de ressonância magnética e administração de medicamentos

Resumo

Combinar drogas anticâncer com nanocristais inorgânicos para construir nanoestruturas híbridas multifuncionais tornou-se uma ferramenta poderosa para o tratamento do câncer e supressão tumoral. No entanto, continua sendo um desafio crítico sintetizar nanoestruturas compactas multifuncionais com funcionalidade e reprodutibilidade aprimoradas. Neste estudo, relatamos a fabricação de nanoestruturas híbridas de magnetita empregando Fe ₃ O ₄ nanopartículas (NPs) para formar nanoclusters de magnetita multifuncionais (NCs), combinando um conjunto de microemulsão de óleo em água e um método de camada por camada (LBL). The Fe ₃ O ₄ Os NCs foram inicialmente preparados por meio de uma técnica de auto-montagem em microemulsão. Em seguida, camadas de polieletrólito compostas de poli (cloridrato de alilamina) (PAH) e poli (4-estirenossulfonato de sódio) (PSS) e cloridrato de doxorrubicina (DOX) foram tampadas em Fe ₃ O ₄ NCs para construir o Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX via método LBL. As nanoestruturas híbridas preparadas carregadas com DOX demonstraram a liberação de droga responsiva ao pH e maior citotoxicidade para células de câncer de pulmão humano (A549) in vitro e podem servir como T ₂ de contraste de imagem por ressonância magnética (MRI) ponderada, que pode melhorar significativamente T ₂ relaxividade e conduzem a um melhor efeito de contraste da ressonância magnética celular. O DOX carregado emitindo sinais vermelhos sob excitação com 490 nm são adequados para aplicações de bioimagem. Este trabalho fornece uma nova estratégia para construir um Fe ₃ O ₄ nanoplataforma teranóstica multifuncional com T ₂ ponderada por ressonância magnética, imagens de fluorescência e entrega de drogas.

Introdução

Nos últimos anos, vários sistemas multifuncionais de administração de medicamentos foram desenvolvidos para o futuro diagnóstico e terapia em aplicações biomédicas [1,2,3,4]. Nanoestruturas híbridas multifuncionais que são propriedades favoráveis integradas terão aplicações significativas, como imagens multimodais e diagnóstico e terapia simultâneos [5,6,7,8,9,10,11]. Além disso, essas nanoestruturas são sistemas de entrega de drogas responsivos a estímulos para melhor acúmulo de drogas, eficácia terapêutica aprimorada e / ou efeitos colaterais reduzidos. Especialmente, esses sistemas de entrega de drogas responsivos ao pH têm atraído um amplo interesse de pesquisa. Isso ocorre porque a maioria dos tumores humanos tem um valor de pH mais ácido, o que fornece uma forma possível de projetar a liberação controlada de moléculas de fármacos [12,13,14,15,16].

Nas últimas décadas, várias nanoestruturas híbridas combinando nanomateriais inorgânicos com polímero orgânico [17,18,19,20] foram desenvolvidas, incluindo partículas magnéticas [21,22,23], nanopartículas de conversão ascendente (NPs) [17, 24] e partículas de sílica mesoporosa [25]. Entre elas, nanoestruturas híbridas magnéticas baseadas em óxidos de ferro com magnetização relativamente grande em temperatura ambiente têm sido amplamente utilizadas nos campos biomédicos [26,27,28,29]. A funcionalização de nanomateriais inorgânicos revestidos com camadas de polieletrólitos pode realizar um encapsulamento responsivo ao pH e liberação de moléculas de fármaco [12, 17, 30]. Mais recentemente, as camadas de polieletrólitos compostas por poli (estireno sulfonato) de sódio (PSS) e pelo policatião poli (cloridrato de alilamina) (PAH) têm sido amplamente estudadas [31,32,33,34,35,36]. Camadas de polieletrólitos combinadas com NPs magnéticos e luminescentes ou moléculas de drogas para sistemas de entrega de drogas multifuncionais também foram relatadas recentemente [37,38,39]. Óxido de ferro (Fe ₃ O ₄ ) NPs estão recebendo cada vez mais atenção no campo da ressonância magnética (MRI) e entrega de drogas devido às suas propriedades superparamagnéticas exclusivas, biocompatibilidade, baixa citotoxicidade e flexibilidade [9, 11, 28, 29, 40,41,42 ] Em geral, existem dois métodos para melhorar a capacidade de resposta magnética do Fe ₃ O ₄ NPs. O primeiro é sintetizar as partículas de magnetita do tamanho de um micrômetro. Devido ao grande tamanho, no entanto, eles tendem a se agregar em solução aquosa, o que não é benéfico para aplicações biomédicas. A outra abordagem é montar Fe ₃ O ₄ NPs em nanoclusters (NCs). Estes Fe ₃ O ₄ Os NCs melhoraram muito a capacidade de resposta magnética em comparação ao Fe ₃ individual O ₄ NPs [22, 43]. Portanto, se o Fe ₃ auto-montado O ₄ NCs são adotados como o núcleo para fabricar nanoestruturas híbridas multifuncionais, o desempenho da ressonância magnética será melhorado pelo efeito coletivo do Fe ₃ O ₄ NPs [43,44,45]. Até onde sabemos, o Fe ₃ auto-montado O ₄ NCs funcionalizados com PAH / PSS multicamadas para liberação de fármaco responsivo ao pH raramente foram relatados.

Neste trabalho, uma nanoplataforma teranóstica versátil baseada em Fe ₃ O ₄ NPs foi construído para MRI e entrega de drogas. Em nossa abordagem, Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram obtidas pela combinação de um método de microemulsão de óleo em água e um método de adsorção eletrostática de camada por camada (LBL). Espera-se que o Fe ₃ embalado O ₄ O sistema NC pode levar a um T aprimorado ₂ relaxividade e contraste de imagem, e a grande área de superfície específica de Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS permitem alta carga de drogas anticâncer. Além disso, o experimento in vitro mostra que o contraste de MRI celular de células de câncer de pulmão humano (A549) incubadas com Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOX foi significativamente aprimorado.

Materiais e métodos

Materiais

FeCl ₃ · 6H ₂ O (99,99%), FeCl ₂ · 4H ₂ O (99,99%), ácido oleico (OA, 90%) e 1-octadeceno (ODE, 90%) foram adquiridos de Alfa Aeasar. Oleato de sódio (NaOA), etanol, hexano, ciclohexano, isopropanol, dodecil benzeno sulfonato (SDBS), fluoreto de amônio (NH ₄ F), hidróxido de sódio (NaOH), dimetilsulfóxido (DMSO) e amônia foram adquiridos de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (China). Poli (cloridrato de alilamina) (PAH), poli (estireno sulfonato) (PSS) e brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio foram adquiridos de Sigma-Aldrich. O medicamento anticâncer cloridrato de doxorrubicina (DOX,> 98%) foi adquirido da Shanghai Sangon Biotech Company (Shanghai, China). O meio de crescimento APMI 1640 e o soro fetal bovino (FBS) foram adquiridos da Hyclone. Todos os reagentes foram usados como recebidos sem purificação adicional.

Preparação de oleato férrico

A síntese de NPs magnéticos partiu da síntese do oleato férrico. FeCl ₃ · 6H ₂ O (2,59 g), NaOA (14,6 g), C ₂ H ₅ OH (32 mL), H ₂ O (24 mL) e hexano (56 mL) foram misturados em um frasco de três gargalos de 150 mL e aquecidos a 70 ° C para refluxo por 4 h para formar uma solução de complexos de oleato férrico transparente. Depois disso, o líquido foi separado por um funil de separação e a camada superior de óleo foi preservada. Hexano no líquido evaporado a 70 ° C por evaporação rotativa e seco por 48 h sob vácuo. As amostras preparadas foram armazenadas em uma caixa de luvas a vácuo para uso posterior.

Síntese de Fe ₃ O ₄ NPs

Nós sintetizamos Fe ₃ O ₄ NPs seguindo procedimentos relatados anteriormente com ligeira modificação [46]. Oleato férrico (7,2 g), OA (1,28 mL) e ODE (50 mL) foram misturados em um frasco de três gargalos de 100 mL e aquecidos a 300 ° C por 40 min sob proteção de argônio; em seguida, a mistura foi resfriada à temperatura ambiente e oxidada ao ar por mais de 12 h. Os nanocristais resultantes foram precipitados pela adição de isopropanol, centrifugados e lavados duas vezes com uma mistura de etanol-água (1:1 v / v ) O Fe capeado com ácido oleico ₃ O ₄ Os NPs foram finalmente dispersos em 200 mL de ciclohexano e o sobrenadante foi selado e armazenado para os experimentos subsequentes.

Preparação de Fe ₃ O ₄ NCs

Fe ₃ O ₄ NCs foram preparados por uma técnica de auto-montagem de microemulsão fácil e direta, conforme descrito anteriormente com modificação [47]. Resumidamente, uma solução de 200 μL de Fe ₃ O ₄ nanocristais em ciclohexano foram vertidos em 4 mL de solução aquosa contendo 14 mg de SDBS. A solução misturada foi submetida a tratamento ultrassônico por 5 min por 4 vezes. A emulsão sólido-em-óleo-em-água (S / O / A) formada foi agitada à temperatura ambiente durante 6 h para evaporar o solvente orgânico seguido pela auto-montagem de Fe ₃ O ₄ NPs para formar NCs 3D. Os produtos finais foram lavados com água desionizada 3 vezes para remover o excesso de SDBS, nanocristais não incorporados e alguns possíveis contaminantes maiores.

Preparação de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX

The Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram preparadas por meio de interações atrativas eletrostáticas. O Fe ₃ conforme preparado O ₄ Os NCs são carregados negativamente devido ao encapsulamento dos tensoativos aniônicos. Eles foram inicialmente carregados positivamente por adsorção de uma camada de polieletrólito carregado positivamente, poli (cloridrato de alilamina) (PAH, MW 15.000). Especificamente, 300 μL Fe ₃ O ₄ A amostra NC foi inicialmente diluída 10 vezes para 3 mL usando água desionizada. The Fe ₃ O ₄ A mistura NC foi subsequentemente adicionada gota a gota a uma solução aquosa de PAH (1 mL, 10 g / L, NaCl 4 mM) sob agitação vigorosa. Após a solução ter sido agitada durante 24 h, o excesso de PAH foi removido por centrifugação, e o Fe revestido com PAH resultante ₃ O ₄ NCs (Fe ₃ O ₄ NC / PAH) foram redispersos em água (3 mL).

The Fe ₃ O ₄ NC / PAH foram então carregados negativamente por adsorção de uma camada de polieletrólito carregado negativamente, poli (4-estirenossulfonato de sódio) (PSS, MW 70.000). Especificamente, um Fe de 3 mL ₃ O ₄ A solução de amostra NC / PAH foi adicionada gota a gota a uma solução PSS aquosa (1 mL, 10 g / L, NaCl 4 mM) sob agitação vigorosa. Após a solução ter sido agitada por 24 h, o excesso de PSS foi removido por centrifugação, e o Fe ₃ revestido com PSS resultante O ₄ NC / PAH (Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS) foram redispersos em água (3 mL).

A solução estoque aquosa DOX foi primeiro preparada [17]. A concentração era de 5,0 mg / mL. A solução de nanoestrutura híbrida foi obtida pela mistura de Fe ₃ O ₄ Solução NC / PAH / PSS (3 mL, 32 mg / mL) e solução de estoque DOX (60 mL) em um pequeno tubo de plástico com agitação por 24 h na câmara escura. Após a centrifugação, o Fe ₃ O ₄ Finalmente, foram obtidas nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX.

Medições de ressonância magnética

As medições de ressonância magnética foram realizadas em um sistema de micro-imagem 11,7 T micro 2,5 (Bruker, Alemanha). A quantidade diferente de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram dispersas em 1,2 mL de solução aquosa de agarose e, em seguida, carregadas nos microtubos para medições de ressonância magnética. A concentração final de íons Fe foi de 0 mM, 0,013 mM, 0,026 mM, 0,032 mM, 0,041 mM, 0,052 mM e 0,065 mM, respectivamente. Os parâmetros de medição são os seguintes:tempo de repetição (TR) =300 ms, tempo de eco (TE) =4,5 ms, matriz de imagem =128 × 128, espessura de corte =1,2 mm, campo de visão (FOV) =2,0 × 2,0 cm, e número de médias (NA) =2.

Captação celular e imagens de ressonância magnética

Para demonstrar a absorção celular eficiente, as células A549 foram semeadas na lamela na placa confocal e incubadas em um CO 5% umidificado ₂ atmosfera durante 4 h a 37 ° C. Então, o Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram adicionadas ao meio de incubação nas diferentes concentrações e incubadas por 2 h. As concentrações finais de íons Fe foram obtidas como 0, 2,2, 4,5, 9,0 e 13,5 μM, respectivamente. Depois que o meio foi removido, as células foram lavadas duas vezes com PBS (pH =7,4, 20 mM) e usadas diretamente para imagens de RM.

Curva padrão de DOX

Uma quantidade adequada de DOX foi dissolvida em água por oscilação. Em seguida, uma série de diferentes concentrações de solução aquosa de DOX foram preparadas (0–0,03 mg / mL). A intensidade de fluorescência de diferentes concentrações de solução DOX foi medida ( λ _ex =490 nm). Finalmente, a curva padrão de DOX foi determinada através do ajuste da curva da intensidade de fluorescência vs a concentração de DOX.

A curva padrão da área: Y =447,4423 + 69745,08457X.

Taxa de precisão da curva padrão: R ² =0,9992.

Carregamento e liberação de DOX

Para medir as capacidades de carga do Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX, a solução sobrenadante foi coletada após centrifugação das nanoestruturas híbridas preparadas. O espectro de fluorescência das moléculas de DOX na solução sobrenadante foi examinado e a concentração de DOX no sobrenadante foi calculada comparando a curva padrão de DOX. As porcentagens de DOX restantes no Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram calculadas de acordo com a seguinte equação:
$$ \ mathrm {Carregando} \ \ mathrm {eficiência} \ \ left (\% \ right) =\ left ({\ mathrm {W}} _ 0 \ hbox {-} {\ mathrm {W}} _ {\ mathrm {s}} \ right) / {\ mathrm {W}} _ 0 \ times 100 \% $$
onde W ₀ e W _s representam a massa inicial de DOX e a massa de DOX nos sobrenadantes, respectivamente.

Para os estudos de liberação cumulativa de DOX em soluções tampão de PBS (pH 5,0 e 7,4) com a mesma concentração de NaCl de 0,15 M, o Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram dispersas em 1,0 mL de solução tampão e então transferidas para um saco de diálise. Em seguida, foi mantido em solução tampão e agitado suavemente a 37 ° C na câmara escura. Em intervalos de tempo selecionados, 100 μL de solução foram retirados e analisados por espectro de fluorescência e, em seguida, retornados à solução original.

Citotoxicidade in vitro de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX

Citotoxicidade in vitro do Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram avaliadas contra células A549 com base no ensaio padrão de metil tiazoliltetrazólio (MTT). As células A549 foram cultivadas em meio de crescimento APMI 1640 complementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), estreptomicina a 100 μg / mL e penicilina a 100 μg / mL. As células foram mantidas a 37 ° C em uma atmosfera umidificada de 5% CO ₂ no ar. O ensaio foi realizado em triplicado da mesma maneira. Resumidamente, as células A549 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 8 × 10 ³ células por poços em 100 μL de mídia. Após o crescimento durante a noite, as células foram incubadas em várias concentrações de DOX livre, Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS e Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 μM) por 24 h. Depois de ser incubado por 24 h, a solução de brometo de 10 μL 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (5 mg / mL) foi adicionada a cada poço e as células foram incubadas por 4 h a 37 ° C. Depois que a solução de brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio foi removida, 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados a cada poço e a placa foi agitada suavemente por 10 min para dissolver os cristais violetas precipitados. A densidade óptica (OD) foi medida a 490 nm usando leitor de microplaca (Perkin Elmer, Victor X4). A viabilidade celular foi avaliada como uma porcentagem em comparação com as células de controle.

Caracterização

Os tamanhos e morfologias de Fe ₃ O ₄ NPs e Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram examinadas por um microscópio eletrônico de transmissão FEI Tecnai G2-F20 (TEM) a uma tensão de aceleração de 200 kV. As medições de espalhamento dinâmico de luz (DLS) foram realizadas em um analisador de tamanho de partícula e potencial zeta da Malvern (Zetasizer Nano ZS90). Os espectros de absorção de UV-vis foram adquiridos por um espectrômetro Perkin Elmer Lambda-25 UV-vis. Os espectros de fluorescência foram registrados usando um espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F-4600. A espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-AES) (Agilent 5100) foi usada para analisar as concentrações do elemento Fe no Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX.

Resultados e discussão

The Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX são preparadas por automontagem de óxido de ferro primário (Fe ₃ O ₄ ) NPs resultando em agregados esféricos densamente compactados através de uma técnica de auto-montagem de microemulsão, conforme descrito anteriormente com modificação [17, 47], seguido por um método de adsorção eletrostática LBL. A Figura 1 ilustra a ilustração esquemática da síntese de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX. Magnetita Fe revestida com ácido oleico hidrofóbico ₃ O ₄ NPs foram inicialmente produzidos pelo processo de decomposição térmica em solvente orgânico [46]. Fe ₃ O ₄ NPs são esféricos e uniformes em tamanho com um tamanho médio de partícula de cerca de 15 nm (arquivo adicional 1:Figura S1). Para a montagem de NCs magnéticos, o Fe revestido com OA ₃ O ₄ NPs foram dispersos em ciclohexano e depois adicionados gota a gota a uma solução aquosa contendo SDBS. A solução complexa foi tratada ultrassonicamente para formar uma emulsão óleo-em-água estável. Após a evaporação do solvente orgânico na emulsão, Fe ₃ O ₄ NPs foram automontados para formar nanoclusters esféricos por meio de interação hidrofóbica. Em seguida, o Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram preparadas por meio de um método LBL por meio de interações atrativas eletrostáticas, que são ilustradas esquematicamente na Fig. 1.

Ilustração esquemática da síntese de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX como agentes teranósticos para ressonância magnética e distribuição de drogas

As morfologias e tamanhos do Fe ₃ O ₄ NCs e o Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS foram examinadas com TEM e DLS, respectivamente. Conforme mostrado nas Fig. 2a e b, o Fe ₃ O ₄ NCs demonstram os aglomerados quase esféricos. O tamanho médio de partícula medido por DLS é cerca de 57 nm (Fig. 2e). Em relatórios anteriores, PAH com carga positiva ou PSS com carga negativa é alternadamente depositado na superfície do molde devido às suas excelentes propriedades eletrostáticas [48,49,50,51]. Para estudar a formação de cada camada de polieletrólito depositada no Fe ₃ O ₄ NCs, os experimentos de potencial zeta foram realizados. A variação do potencial zeta com a camada de polieletrólito para os revestimentos PSS / PAH e DOX são mostradas no Arquivo adicional 1:Figura S2. O puro Fe ₃ O ₄ Os NCs têm um potencial zeta negativo de - 19,7 mV devido à existência de SDBS. A absorção de uma única camada de PAH carregada positivamente em Fe ₃ O ₄ NCs inverte o potencial de superfície de - 19,7 para + 32 mV. Subsequentemente, a deposição da camada PSS carregada negativamente causa outra reversão de potencial de superfície de + 32 a - 34 mV. Isso indica um crescimento gradual da camada durante a fabricação das nanoestruturas híbridas NC magnéticas. Estes resultados mostram que as camadas de PAH e PSS foram revestidas com sucesso no Fe ₃ O ₄ NCs. Finalmente, o DOX foi adsorvido com sucesso na superfície do Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX, que foi confirmado pelo potencial zeta positivo (+ 1,91 mV) (arquivo adicional 1:Figura S2). As imagens TEM com uma ampliação diferente do Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS são mostradas nas Fig. 2c e d. Nenhuma diferença estrutural e morfológica significativa é observada após os revestimentos de polieletrólito. Comparado com as Fig. 2a e b, o contraste brilhante pode ser observado e o tamanho do Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS aumentaram ligeiramente devido ao revestimento das camadas de PAH e PSS. As nanoestruturas híbridas magnéticas sintetizadas mostram uma forma quase esférica quase monodispersa com tamanho médio de cerca de 84 nm de acordo com os resultados da medição DLS (Fig. 2f).

Imagens TEM de Fe ₃ O ₄ NCs ( a , b ) e Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS ( c , d ) com ampliação menor e maior, respectivamente. Distribuição de tamanho de Fe ₃ O ₄ NCs ( e ) e Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS ( f )

Para avaliar a aplicação potencial de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS em MRI, as taxas de relaxação transversal de prótons (1 / T ₂ ) em função da concentração de íons Fe foram determinados usando o espectrômetro Bruker AVANCE 500WB a 11,7 T. Foi observada uma relação linear entre as taxas de relaxamento com a concentração de íons Fe, como mostrado na Fig. 3b. Além disso, as taxas de relaxamento transversal (1 / T ₂ ) aumentou com o aumento da concentração de Fe ₃ O ₄ NCs devido ao alto grau de agregação do Fe ₃ O ₄ núcleo de NPs magnéticos, demonstrando que as nanoestruturas híbridas magnéticas podem ser um T eficaz ₂ de contraste ponderado por ressonância magnética (Fig. 3a). Com base na inclinação do gráfico na Fig. 3b, o valor da relaxividade transversal ( r ₂ ) foi determinado ser 651,38 mM ⁻¹ S ⁻¹ , que é superior ao do trabalho relatado [22]. Comparado com o comercial T ₂ Como meio de contraste, os nanoclusters podem melhorar significativamente a capacidade de contraste do Fe depois que os NPs magnéticos se automontam com base no efeito coletivo, melhorando muito o efeito angiográfico. No trabalho anterior, os nanocristais de magnetita montados exibiram um nível mais alto de magnetização de saturação do que os nanocristais individuais devido ao efeito coletivo dos nanocristais magnéticos [43, 52].

a T ₂ Imagens ponderadas de ressonância magnética do Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS em diferentes concentrações em água. b Gráfico da taxa de relaxamento r ₂ versus Concentração de Fe em Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS. O valor de relaxividade r ₂ foi obtido a partir da inclinação do ajuste linear dos dados experimentais

Para avaliar a capacidade de carga de droga de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX como transportadores de distribuição de drogas, uma droga anticâncer solúvel em água (DOX) foi escolhida como droga modelo. O armazenamento de DOX nas nanoestruturas híbridas com alta eficiência foi revelado pela mudança de cor da solução. A cor da solução de Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS e a solução de DOX pura eram amarelados e vermelhos, respectivamente (Fig. 4a eb). Após a formação do Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX, a cor da solução tornou-se laranja (Fig. 4c). Devido à presença de Fe ₃ O ₄ NPs, as nanoestruturas carregadas com DOX na suspensão podem ser separadas por um ímã externo, sugerindo que o grande potencial das nanoestruturas híbridas obtidas para a entrega de drogas direcionadas magneticamente (Fig. 4d). A espectroscopia de absorção UV-vis foi usada para determinar a capacidade efetiva de armazenamento DOX. A Figura 4e mostra os espectros de absorção de UV-vis da solução aquosa de DOX antes e depois da interação com Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS. Comparado com o DOX livre, as características de pico de absorção semelhantes foram observadas no Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX, que é o pico de absorção de recombinação de Fe ₃ O ₄ NCs e DOX. A amostra sem DOX mostra apenas o pico de absorção de Fe ₃ O ₄ NCs. Esses dados indicam que o DOX como uma droga pode ser absorvido com sucesso na superfície das nanoestruturas híbridas. Também foi verificado que há um limite superior de concentração de adsorção de DOX carregado na superfície das nanoestruturas híbridas. A Figura 4f mostra o espectro PL do Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX após a centrifugação quando diferentes concentrações de DOX foram adicionadas ao Fe ₃ O ₄ Solução NC / PAH / PSS. A intensidade da luminescência de DOX aumenta com o aumento do DOX adicionado até atingir um teto (8 mg / mL) com a concentração de Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS (1,30 × 10 ⁻² mg / mL) inalterado. Posteriormente, a quantidade de aprisionamento diminui devido ao excesso de DOX, que não pode ser adsorvido na superfície do Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX. A intensidade de fluorescência mais forte de DOX corresponde à concentração de 8 mg / mL, e a amostra correspondente seria usada para estudo posterior para realizar experimento biomédico. A eficiência de carregamento de droga garantida das nanoestruturas híbridas é crucial para a aplicação clínica. A eficiência de carregamento foi calculada pela área integral da intensidade de fluorescência DOX usando o método da curva padrão de DOX [53, 54]. A eficiência de carregamento foi calculada em até 24,39% para o Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX. Portanto, uma plataforma teranóstica foi construída com base no Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX devido à absorção efetiva do fármaco antitumoral DOX.

Fotografias ( a - d ) dos diferentes estágios absorvidos de DOX no Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS. Os espectros de absorção de UV-vis ( e ) de DOX, Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS e Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX. O espectro de luminescência ( f ) de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX quando a concentração diferente de DOX foi adicionada ao Fe ₃ O ₄ Solução de nanoestrutura híbrida NC / PAH / PSS

Os perfis de liberação de drogas in vitro de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX sob vários valores de pH ambientais são demonstradas na Fig. 5. O Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram dialisadas através de uma membrana de diálise em tampões de fosfato a 37 ° C. A DOX liberada das nanoestruturas híbridas foi coletada e a quantidade liberada de DOX foi calculada pela intensidade de fluorescência do sobrenadante. Em pH fisiológico 7,4, a liberação observada do fármaco é um processo de liberação lenta. Cerca de 20% em peso de DOX foi liberado nas 5 horas iniciais e, em seguida, entrou no estágio estável de liberação lenta. Em pH 5,0, cerca de 80% em peso de DOX foi liberado das nanoestruturas híbridas nas 15 h iniciais antes de um platô de liberação ser atingido. As porcentagens de platô de liberação de DOX observadas ao longo de um período de 30 h foram 80 ± 3% em peso e 20 ± 3% em peso em pH 5,0 e 7,4, respectivamente. Pode ser visto que o Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX revelaram um perfil de liberação sustentada e uma taxa de liberação de DOX mais alta em pH 5,0 do que em pH 7,4. O baixo pH do ambiente acelera a liberação de DOX do Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX. Isso é devido à protonação do –NH ₂ grupo de DOX sob condições ácidas, o que reduz a interação eletrostática entre DOX e polímeros PSS em baixos valores de pH [55]. Os estudos de liberação de fármacos indicam a boa estabilidade das moléculas de fármacos ligadas eletrostaticamente em pH fisiológico e a liberação desencadeada em condições ácidas, semelhantes aos trabalhos relatados [56,57,58]. Portanto, o Fe obtido ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX são os sistemas responsivos ao pH para liberação de drogas DOX e adequados para o tratamento específico de tumores sólidos [59].

Trama do lançamento do DOX do Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX em tampão PBS em pH 7,4 e 5,0, respectivamente

A captação celular e a citotoxicidade são fatores chave para avaliar o potencial de um novo sistema de liberação de fármacos. A absorção celular e citotoxicidade do Fe ₃ O ₄ Foram estudadas nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX em linhas de células A549. A absorção intercelular de Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX foram investigadas usando microscopia óptica e de fluorescência, que foi realizada principalmente pelo monitoramento da fluorescência de DOX. The Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX provaram ser eficazes na entrega de DOX às células cancerosas. Conforme mostrado na Fig. 6, forte fluorescência vermelha de DOX foi observada em células cancerosas após incubação por 24 h. As nanoestruturas híbridas foram internalizadas principalmente por meio de endocitose [60]. Após a absorção celular, as nanoestruturas híbridas liberaram DOX no ambiente ácido ao redor do endossomo / lisossomas, em que um pH suficientemente baixo (4,3) poderia desencadear uma liberação de DOX eficaz (pH 5,0, Fig. 5). The Fe ₃ O ₄ As nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX exibiram absorção dependente do tempo em células cancerosas A549, como mostrado na Fig. 6. Em 0,5 h após a incubação, a fluorescência vermelha era visível ao redor das células. Os resultados mostram que as nanoestruturas híbridas contendo DOX permaneceram principalmente em torno das células A549. No entanto, quando o tempo de incubação aumentou para 24 h, o sinal de fluorescência intercelular aumentou nas células A549. Obviamente, muitas nanoestruturas híbridas podem entrar nas células cancerosas com o tempo. Esses resultados confirmam que o Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX podem transferir DOX com eficiência para células A549. O DOX liberado das nanoestruturas híbridas no citoplasma passa pela membrana nuclear e, eventualmente, se acumula no núcleo, matando as células por causar mudanças na conformação do DNA [61].

Imagens microscópicas de fluorescência confocal de células A549 incubadas com o Fe ₃ O ₄ Nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX a 37 ° C para a 0,5 he b 24 h. Barra de escala, 20 μm

A fim de avaliar a atividade farmacológica do Fe ₃ O ₄ Nas nanoestruturas híbridas NC / PAH / PSS / DOX, a citotoxicidade para células A549 in vitro foi determinada pelo método MTT. A Figura 7 mostra a atividade celular de DOX livre, Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS e Fe ₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures with different concentrations after incubation with A549 cells for 24 h. The material amounts were calculated according to the concentration of DOX. The free DOX concentration was the same as the DOX concentration in Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, and the concentration of Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructure was the same as the Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS concentration in the Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. Each sample was cultured with A549 cells for 24 h. The concentration of Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS ranged from 0.1 to 2.0 μΜ, and the cell survival rate exceeded 85%. This indicated that Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures had no obvious cytotoxicity to cancer cells and had good biocompatibility. After incubating with cancer cells for 24 h, however, the free DOX and Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures showed obvious cytotoxicity. The cellular viability progressively decreased with increasing effective DOX concentration. As shown in Fig. 7, when the effective DOX concentration was increased from 0.1 up to 2.0 μM, the relative cell viability decreased from about 92% to about 50% for free DOX, and from about 89% to about 40 % for Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, respectively.

Relative viability of A549 cells incubated with free DOX, Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS, and Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at different concentrations for 24 h. Error bars were based on triplicate samples

These results indicate that both free DOX and Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures have dose-dependent cytotoxicity to cancer cells. The cytotoxicity originates from the loaded DOX rather than Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures. Cell uptake of free DOX is faster than that of DOX-loaded hybrid nanostructures. This reason is that small DOX molecules can quickly spread into cells, while Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures must be endocytosis in order to enter cancer cells. Because of the hypoxia-induced coordinated upregulation of glycolysis, the acidic extracellular environment of solid tumors is stronger than that of normal tissues [62]. At the cellular level, the internalization of most of the hybrid nanostructures will take place through endocytosis. With the increase of DOX concentration, more and more hybrid nanostructures loaded with DOX are endocytosed into cancer cells. After cellular endocytosis, the DOX-loaded hybrid nanostructures usually enter the early endosomes, then enter the late endosomes/lysosomes, and finally fused with lysosomes. Furthermore, both endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0) have an acidic microenvironment. In our study, the pH-responsive Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were more likely to decompose and release drugs in acidic environments, thus effectively reducing side effects, prolonging half-life of drugs, and providing more effective and lasting treatment. Due to the main target of DOX being cell nucleus, DOX can bind to double-stranded DNA to form DNA adducts, inhibit the activity of topoisomerase and induce cell death (apoptosis) [63]. As a result, the released DOX molecules were located in the cell nucleus. Therefore, the obtained Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures may have good potential for cancer chemotherapy.

As discussed above, the Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures exhibit high relaxivity in aqueous solution and can be uptaken efficiently by A549 cells. The intracellular MRI of the Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were then investigated by incubation of A549 cells with the hybrid nanostructures with different Fe₃ O ₄ concentrações. Figure 8 presents the T ₂ -weighted MRI of A549 cells. With the increase of Fe₃ O ₄ concentration in Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cellular MRI signal increased gradually (Fig. 8). Currently, cell labeling is mainly accomplished by the endocytosis of Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as T ₂ -negative contrast agents. These results demonstrate that the Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can be internalized into cells and exhibit good T ₂ -weighted MRI contrast for cellular imaging. Our current research is limited to the cellular level. Future in vivo studies would be necessary for the practical application of the Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. To specially target a specific site in animal studies, small ligands such as lactic acid and folic acid (both containing carboxyl groups) would require to be used to conjugate amino-terminated Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures.

T ₂ -weighted cellular MR images of A549 cells incubated with the Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at a Fe concentration of 2.2, 4.5, 9.0, and 13.5 μM, respectively

Conclusão

The multifunctional Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were developed as the pH-triggered drug delivery system for effective cancer chemotherapy and MRI. The quasi-spherical Fe₃ O ₄ NCs can significantly improve the contrast ability of MRI compared with Fe₃ O ₄ NPs. The Fe ₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can act as contrast agents to enhance MRI and as a fluorescence probe for cell imaging. The DOX can be released from the Fe₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at acidic environment and exhibit an excellent cellular cytotoxic effect on A549 cells. The Fe ₃ O ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as multifunctional theranostic platform have great potential for biomedical application, including MRI, fluorescence imaging, and stimuli-responsive drug delivery nanocarriers.

Disponibilidade de dados e materiais

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