Agentes Teranósticos Baseados em Nanoclusters de Magnetita para MRI T2-ponderado e Liberação de Doxorrubicina Sensível a pH

Resumo

Nanoestruturas multifuncionais que fundem fármacos anticâncer com nanocristais inorgânicos estão emergindo como plataformas poderosas para diagnóstico e terapia de tumores. Neste estudo, fabricamos nanoclusters (NCs) de magnetita (Fe₃O₄) combinando microemulsão óleo-em-água e montagem camada por camada (LBL). Os NCs de Fe₃O₄ foram primeiro auto-montados a partir de nanopartículas (NPs) de Fe₃O₄ revestidas com ácido oleico. Adsorção sequencial de poli(alilamina hidrocloreto) (PAH), poli(sulfonato de sódio 4-estireno) (PSS) e cloridrato de doxorrubicina (DOX) resultaram em nanoestruturas híbridas Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX. Esses carreadores exibem liberação de DOX responsiva a pH, citotoxicidade aprimorada contra células de carcinoma pulmonar A549 e contraste superior de MRI ponderado em T₂ (r₂ = 651 mM⁻¹ s⁻¹). Emissão fluorescente de DOX (λ_ex = 490 nm) facilita imagem celular. Nosso trabalho estabelece plataforma teranóstica robusta baseada em Fe₃O₄ que integra MRI, imagem por fluorescência e administração controlada de fármacos.

Introdução

Avanços recentes em sistemas multifuncionais de administração de fármacos permitiram imagem e terapia simultâneas, particularmente através de designs responsivos a estímulos que exploram pistas do microambiente tumoral como acidez (pH ≈ 6,5-6,8). Nanopartículas de magnetita (Fe₃O₄) são especialmente atrativas para aplicações biomédicas devido ao seu superparamagnetismo, biocompatibilidade e baixa citotoxicidade. No entanto, NPs individuais de Fe₃O₄ frequentemente sofrem de baixa responsividade magnética e carga limitada de fármacos. Montagem de NPs de Fe₃O₄ em nanoclusters (NCs) amplifica efeitos magnéticos coletivos, aumentando relaxividade T₂ e permitindo maiores cargas de fármacos quando combinadas com multicamadas polieletrólitas. Apesar dessas vantagens, poucos estudos relataram NCs de Fe₃O₄ funcionalizados com PAH/PSS para liberação de fármaco gatilhada por pH.

Aqui, relatamos rota de fabricação escalável para nanoestruturas híbridas Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX, combinando auto-montagem de microemulsão e adsorção eletrostática LBL. Os carreadores resultantes entregam DOX com liberação controlada dependente de pH, demonstram forte contraste MRI T₂ e matam eficientemente células A549 in vitro.

Materiais e Métodos

Materiais

FeCl₃·6H₂O (99,99%), FeCl₂·4H₂O (99,99%), ácido oleico (OA, 90%), 1-octadecen (ODE, 90%), oleato de sódio (NaOA), etanol, hexano, cicloexano, isopropanol, sulfonato de dodecilbenzeno de sódio (SDBS), fluoreto de amônio (NH₄F), NaOH, DMSO e amônia foram comprados da Alfa Aesar e Sinopharm. PAH (PM 15 kDa), PSS (PM 70 kDa) e cloridrato de doxorrubicina (DOX, > 98%) foram obtidos da Sigma-Aldrich e Shanghai Sangon Biotech. Meio APMI 1640 e soro bovino fetal (FBS) foram obtidos da Hyclone. Todos reagentes foram usados sem purificação adicional.

Preparação de Oleato de Ferro

FeCl₃·6H₂O (2,59 g), NaOA (14,6 g), etanol (32 mL), H₂O (24 mL) e hexano (56 mL) foram misturados em balão de 150 mL e refluxados a 70 °C por 4 h para formar solução transparente de oleato de ferro. Camada de óleo foi separada, hexano removido por evaporação rotativa a 70 °C, e resíduo armazenado sob vácuo.

Síntese de NPs de Fe₃O₄

Oleato de ferro (7,2 g), OA (1,28 mL) e ODE (50 mL) foram aquecidos a 300 °C por 40 min sob Ar; mistura foi então resfriada e oxidada em ar por >12 h. Nanocristais foram precipitados com isopropanol, lavados duas vezes com etanol-água (1:1 v/v), e dispersos em 200 mL cicloexano.

Preparação de NCs de Fe₃O₄

200 µL de NPs de Fe₃O₄ em cicloexano foi adicionado a 4 mL de SDBS aquoso (14 mg). Tratamento ultrassônico (5 min × 4) formou emulsão sólido-em-óleo-em-água. Agitação à temperatura ambiente por 6 h evaporou cicloexano, permitindo auto-montagem em NCs quasi-esféricos. Produto foi lavado três vezes com água desionizada.

Preparação de Nanoestruturas Híbridas Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX

NCs de Fe₃O₄ (3 mL) foram primeiro revestidos com PAH (10 g/L, 4 mM NaCl) por adição gota a gota e agitação por 24 h; excesso de PAH removido por centrifugação. NCs revestidos com PAH foram então revestidos com PSS (10 g/L, 4 mM NaCl) sob condições idênticas, seguido por centrifugação. DOX (5 mg/mL) foi adicionado (60 µL) à solução de Fe₃O₄ NC/PAH/PSS (3 mL) e agitado por 24 h no escuro. Nanoestruturas híbridas finais Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX foram isoladas por centrifugação.

Medidas de MRI

Nanoestruturas híbridas foram dispersas em 1,2 mL agarose (1% p/v) em concentrações de Fe variando de 0 a 0,065 mM. Imagem realizada em sistema micro-MRI Bruker 11,7 T (TR = 300 ms, TE = 4,5 ms, matriz 128 × 128, fatia 1,2 mm, FOV 2,0 × 2,0 cm, 2 médias).

Captação Celular e Imagem por MRI

Células A549 foram incubadas com nanoestruturas híbridas (Fe = 0-13,5 µM) por 2 h, lavadas e imageadas por MRI ponderado em T₂.

Curva Padrão de DOX

Fluorescência de DOX (λ_ex = 490 nm) foi medida para concentrações 0-0,03 mg/mL. Regressão linear deu Y = 447,44 + 69.745 X (R² = 0,9992).

Carga e Liberação de DOX

Eficiência de carga calculada da diferença entre massa inicial de DOX (W₀) e massa no sobrenadante (W_s) após centrifugação. Liberação cumulativa monitorada em PBS (pH 5,0 ou 7,4) a 37 °C usando bolsa de diálise, amostrando 100 µL a cada 1-3 h.

Citotoxicidade In Vitro

Células A549 semeadas em placas de 96 poços (8 × 10³ células/poço) e tratadas com DOX livre, Fe₃O₄ NC/PAH/PSS ou Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX (0,1-2,0 µM equivalentes de DOX). Após 24 h, MTT (5 mg/mL) adicionado, incubado 4 h, e absorbância medida a 490 nm.

Caracterização

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM, 200 kV) avaliou morfologia; espalhamento dinâmico de luz (DLS) mediu tamanho hidrodinâmico e ζ-potencial; espectroscopia UV-vis determinou carga de DOX; espectroscopia de fluorescência monitorou liberação de DOX; ICP-AES quantificou teor de Fe.

Resultados e Discussão

Morfologia e Tamanho da Nanoestrutura

Imagens TEM revelaram que NCs de Fe₃O₄ são agregados quasi-esféricos (~57 nm, DLS) formados por auto-montagem de NPs primárias de Fe₃O₄ de 15 nm. Deposição de camadas (PAH, PSS, DOX) confirmada por mudanças de ζ-potencial: -19,7 mV (NC), +32 mV (NC/PAH), -34 mV (NC/PAH/PSS), +1,9 mV (NC/PAH/PSS/DOX). Nanoestruturas híbridas finais exibiram tamanho monodisperso de ~84 nm (DLS).

Contraste MRI T₂ Aprimorado

Relaxividade transversal (r₂) foi 651,38 mM⁻¹s⁻¹, superando muitos agentes comerciais. Linearidade de 1/T₂ versus concentração de Fe confirmou contraste T₂ eficiente.

Carga de DOX e Liberação Responsiva a pH

Espectros UV-vis e fluorescência confirmaram adsorção de DOX. Eficiência de carga atingiu 24,4%. Em PBS (pH 7,4) apenas ~20% em peso de DOX foi liberado em 30 h, enquanto a pH 5,0 ~80% foi liberado dentro de 15 h, demonstrando forte responsividade a pH impulsionada por protonação de DOX e ligação eletrostática reduzida.

Captação Celular e Citotoxicidade

Microscopia confocal mostrou internalização dependente do tempo de híbridos carregados com DOX, com forte fluorescência vermelha após 24 h. Ensaios MTT revelaram citotoxicidade negligenciável de Fe₃O₄ NC/PAH/PSS isolado (viabilidade celular > 85% a 2 µM). DOX livre e híbridos carregados com DOX exibiram morte dependente de dose de células A549 (IC₅₀ ≈ 1-2 µM). Citotoxicidade aprimorada dos híbridos atribuída a liberação sustentada de DOX gatilhada por pH endossomal.

MRI Celular

Híbridos Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX internalizados em células A549 produziram redução significativa de sinal T₂, confirmando sua utilidade como agentes de contraste MRI celulares.

Conclusão

Projetamos nanoestruturas híbridas Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX que combinam alto contraste MRI T₂, liberação de DOX gatilhada por pH e potente atividade antitumoral in vitro. Seu design modular permite funcionalização adicional (ex.: ligantes de direcionamento) para aplicações in vivo, posicionando-as como plataformas teranósticas versáteis para imagem e terapia de câncer.