Desenvolvimento de Micelas Poliméricas de Ácido Oleanólico e Avaliação de Sua Eficácia Clínica

Resumo

O ácido oleanólico tem sido usado apenas como agente subsidiário em produtos cosméticos. O objetivo do estudo é mostrar o efeito do ácido oleanólico como ingrediente ativo para o alívio de rugas em humanos e desenvolver uma formulação de micela polimérica que permite que o ácido oleanólico pouco solúvel seja usado como ingrediente principal em produtos cosméticos para redução de rugas . A solubilidade do ácido oleanólico foi avaliada em solubilizantes, surfactantes e polímeros. Os tamanhos e formatos das partículas de micelas poliméricas contendo ácido oleanólico foram avaliados por espectrofotômetro eletrofotômetro de espalhamento de luz e criomicroscopia eletrônica de varredura. A eficiência de encapsulação e a permeação na pele foram medidas por HPLC. A estabilidade das micelas poliméricas armazenadas a 40 ° C por 3 meses foi avaliada por observação visual, medição do tamanho de partícula e medição do conteúdo de ácido oleanólico. Micelas poliméricas em forma de ampola de produto final foram aplicadas ao redor dos olhos de 23 mulheres por 8 semanas. Cinco parâmetros da pele foram avaliados por profilometria óptica a cada 4 semanas durante 8 semanas. Além disso, os profissionais fizeram observações visuais da pele e um estudo de irritação da pele humana foi conduzido. Micelas poliméricas de ácido oleanólico com tamanho de partícula inferior a 100 nm foram preparadas usando Capryol 90® e poloxâmero. A taxa de permeação cutânea do ácido oleanólico nas micelas poliméricas foi maior do que nas outras soluções feitas de ácido oleanólico disperso em 2 tensoativos diferentes. Nenhuma mudança significativa no tamanho da partícula, cor ou conteúdo de ácido oleanólico foi observada, e as micelas poliméricas armazenadas a 40 ° C por 3 meses não sofreram separação de fases. Após 8 semanas de aplicação, a irritação da pele não se desenvolveu e todos os cinco parâmetros avaliados por profilometria óptica, bem como as pontuações da avaliação visual, foram significativamente melhorados. Este estudo mostrou que as micelas poliméricas de ácido oleanólico preparadas neste estudo eram estáveis ​​e eficazes no alívio de rugas em humanos como o principal ingrediente ativo. Com base nesses achados, espera-se que micelas poliméricas de ácido oleanólico possam ser amplamente utilizadas em aplicações cosméticas.

Introdução

O envelhecimento da pele inclui flacidez (flacidez), adelgaçamento e rugas. Pode ser acelerado por infecção, fumo, luz ultravioleta, trauma, desequilíbrio hormonal, estresse e / ou pró-oxidantes, como hidrolases, incluindo elastinase ou colagenase [1]. Espécies reativas de oxigênio ou radicais livres gerados pelas causas mencionadas acima danificam as células vizinhas e resultam em elasticidade da pele reduzida e afinamento [2, 3]. Especialmente, a luz ultravioleta é conhecida por desencadear a geração de espécies reativas de oxigênio, que danificam os lipídios da membrana, as proteínas celulares e o DNA e, assim, aceleram o desenvolvimento de rugas de expressão, sardas e melasma [1,2,3,4]. O ácido oleanólico é um componente eficaz de origem vegetal natural extraído de várias espécies de plantas e usado como um ingrediente médico e cosmético importante. Também é encontrado em frutas como maçãs ou peras [5]. Como um tipo de terpeno hidroxipentacíclico, o ácido oleanólico foi isolado pela primeira vez da oliveira ( Olea europaea ) folhas e é amplamente encontrada em plantas, incluindo a suércia do Leste Asiático ( Eugenia jambos ) e genciana amarela ( Gentiana lutea ) Promove funções anti-envelhecimento por meio da síntese não apenas de pró-colágeno, que é importante para a síntese de colágeno, mas também de ceramidas e filagrina, e também por meio da inibição da atividade da MMP-1, uma enzima que decompõe proteínas como o colágeno [ 5, 6]. Com base nesses achados, pode-se presumir que o ácido oleanólico tem um duplo efeito anti-envelhecimento, não apenas promovendo a produção de colágeno, mas também prevenindo a degradação do colágeno [7]. Como resultado, o ácido oleanólico é um ingrediente anti-envelhecimento muito promissor para produtos cosméticos. No entanto, o uso de ácido oleanólico em produtos cosméticos como ingrediente principal é limitado por sua baixa solubilidade aquosa; assim, apenas pequenas quantidades de ácido oleanólico como parte de uma formulação emulsionada têm sido usadas como ingrediente subsidiário em produtos cosméticos [8]. Suas propriedades físico-químicas relacionadas à absorção pela pele incluem seu ponto de fusão, peso molecular, coeficiente de partição e hidrofilicidade. Seu ponto de fusão é superior a 300 ° C, indicando que se trata de um material altamente cristalino. Materiais altamente cristalinos requerem maior energia para dissolução, apresentam baixa biodisponibilidade devido à sua solubilidade limitada e, portanto, são mal absorvidos [9]. Além disso, compostos altamente hidrofílicos ou lipofílicos, ou compostos de alto peso molecular, são conhecidos por não permearem facilmente a pele [10, 11]. O método mais freqüentemente usado para melhorar a permeação cutânea de tais moléculas é a síntese de precursores ou o uso de carreadores de drogas coloidais. A este respeito, lipossomas, emulsões e micelas poliméricas têm sido ativamente estudados [12].

Micelas poliméricas são agregados de escala nanométrica auto-montados formando estruturas de núcleo-casca em solução aquosa. As micelas poliméricas são frequentemente feitas de copolímeros di-bloco ou tri-bloco que podem formar um núcleo interno hidrofóbico e uma camada externa hidrofílica [13, 14]. As micelas poliméricas são consideradas mais fisicamente estáveis ​​do que as micelas de surfactante, uma vez que as propriedades das micelas poliméricas variam dependendo do tipo e da proporção dos monômeros poliméricos em um copolímero em bloco e têm concentrações de micelas críticas relativamente baixas [15, 16].

Neste estudo, preparamos micelas poliméricas de ácido oleanólico e avaliamos seu tamanho e forma de partícula, e a eficiência de encapsulação resultante e a taxa de permeação cutânea de ácido oleanólico. A estabilidade física do ácido oleanólico nesta forma também foi avaliada por 3 meses. O efeito anti-rugas humano do ácido oleanólico na formulação real do produto cosmético também foi investigado.

Materiais e métodos

Materiais

O ácido oleanólico, Tween 80, Tween 20 e Tween 60 foram adquiridos na TCI (Tóquio, Japão). PEG 400, Pluronic F127 e Pluronic F68, foram obtidos da BASF (Ludwigshafen, Alemanha). Propilenoglicol, PEG 300 e PEG 200 foram obtidos na JUNSEI (Tóquio, Japão). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 e Capryol ™ PGMC foram adquiridos de Gattefossé (Lyon, França). EDTA dissódico (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Coréia), alantoína (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EUA), dipropilenoglicol (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Coréia), propanodiol (DuPont Tate &Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, EUA), carbômero (The Lubrizol Corporation, Ohio, EUA) PEG / PPG / polibutileno glicol-8/5/3 glicerina (NOF Corporation, Tóquio, Japão), sódio hialuronato (TCI, Tóquio, Japão), beta-glucano (SK Bioland, Cheonan, Coréia), fenoxietanol (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Coréia), caprilil glicol (J TWO K BIO CO., Ltd. , Cheongju, Coreia) e etilhexilglicerina (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Coreia) para preparar o produto cosmético contendo ácido oleanólico. O acetonitrilo de grau HPLC foi obtido da Burdick &Jackson (Muskegon, MI, EUA). Foi utilizada água destilada tripla e outros solventes e reagentes foram grau EP e GR. Crlori:camundongos fêmeas sem pêlo SKH1-hr foram adquiridos na OrientBio (Seongnam, Coréia).

Análise de HPLC

O ácido oleanólico foi analisado usando HPLC Shimadzu LC-30 series (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). Foi utilizada uma coluna analítica Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 μm (Teknokroma, Barcelona, ​​Espanha) à temperatura ambiente. A fase móvel consistiu de acetonitrila e água (85:15, v / v), a vazão foi de 1 mL / min e o volume de injeção de 10 μL. O ácido oleanólico foi analisado em UV λ =210 nm. Todas as medições foram feitas em temperatura ambiente [17].

Estudo de otimização de solubilidade e formulação

Uma quantidade medida de ácido oleanólico foi adicionada a um solubilizante, agitada a 60 ° C por 48 h e sonicada por 5 min usando um limpador ultrassônico. A suspensão foi centrifugada a 2.000 rpm usando uma centrífuga Universal 320R (Hettich, Tuttlingen, Alemanha), e o sobrenadante foi então coletado. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de membrana PVDF de 0,45 μm (Whatman, Kent, UK). A solubilidade do ácido oleanólico no solubilizante correspondente foi estimada subtraindo o peso dos sólidos restantes da soma dos pesos iniciais do ácido oleanólico e do solubilizante (Tabela 1).

O estudo de otimização da formulação foi conduzido usando poloxamer 188, poloxamer 407, Tween 60 e Tween 80. Várias proporções de polímeros anfifílicos e surfactantes foram tentadas, conforme resumido na Tabela 2. Cada um de ácido oleanólico e Capryol® 90 foi pesado, aquecido e agitado acima de 60 ° C até que soluções límpidas fossem observadas. Os polímeros / surfactantes mostrados na Tabela 2 foram então adicionados à solução límpida e agitados a mais de 60 ° C até que as soluções límpidas fossem observadas. As soluções foram então dispersas em água destilada (Fig. 1). A solução resultante foi deixada por aproximadamente 48 h, e uma inspeção visual foi então feita para selecionar a formulação ideal. Os resultados das inspeções visuais de cada formulação na Tabela 2, incluindo observações de precipitação, separação de fases, transparência e gelificação, estão resumidos na Tabela 3.

Representação esquemática da preparação de micelas de ácido oleanólico

Preparação de micelas poliméricas de ácido oleanólico

Micelas poliméricas de ácido oleanólico (PMO) foram preparadas usando as formulações G e H na Tabela 2 usando o método mostrado na Fig. 1. PMO-G e PMO-H foram usados ​​para experimentos subsequentes e PMO-H nos produtos cosméticos para o testes clínicos.

Teste de coloração

A micelização polimérica quando a formulação G ou formulação H foi dispersa em água foi confirmada por observação visual, isto é, transparência. A formação de PMO (PMO-G ou PMO-H) também foi confirmada por um teste de coloração. Azul de metileno foi adicionado às misturas de água e Capryol® 90, água, Capryol® 90, PMO-G e PMO-H e a cor das soluções foi observada visualmente e fotografada.

Medição do tamanho de partícula

A técnica ELS (espalhamento de luz eletroforética) mede a flutuação da intensidade de espalhamento das partículas em função do tempo, quando as partículas exibem movimento browniano aleatório e movimento eletroforético orientado em um campo elétrico bem definido. A mobilidade eletroforética das partículas é medida pela técnica ELS [18] e permite que o tamanho das partículas de PMO-G e PMO-H seja avaliado usando um espectrofotômetro de espalhamento de luz eletroforético (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Japão).

Análise de varredura por criomicroscopia eletrônica (crio-SEM)

A microscopia eletrônica de varredura criogênica ou criomicroscopia eletrônica de varredura (crio-SEM) é uma técnica poderosa para visualizar o estado da microestrutura ou nanoestrutura de suspensões ou dispersões de polímero coloidal após terem sido imobilizadas por congelamento rápido e fraturadas para geração de imagens. A fratura é feita e examinada a - 196 ° C, o ponto de ebulição normal do nitrogênio líquido e muito abaixo da temperatura de transição vítrea das partículas a granel e totalmente coalescidas. Imagens crio-SEM revelam uma gama de respostas de partículas a fraturas que se propagam através delas através do gelo [19]. A criomicroscopia eletrônica de varredura (Sistema de preparação de amostras Cryo-SEM Tescan Mira 3 LMU FEG / Quorum Technologies PP3000T) foi usada para observar a forma dos PMOs.

Eficiência de encapsulamento

A eficiência de encapsulação das micelas poliméricas de ácido oleanólico foi avaliada. O PMO foi centrifugado a 2.000 rpm por 15 min, e o sobrenadante foi coletado e analisado por HPLC. A eficiência de encapsulação foi calculada como a quantidade de ácido oleanólico nas micelas poliméricas dividida pela quantidade de ácido oleanólico inicialmente adicionado (mg) durante a preparação do PMO.
$$ \ mathrm {Encapsulamento} \ \ mathrm {eficiência} \ \ left (\% \ right) =\ kern0.37em \ frac {\ mathrm {Quantidade} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {oleanolic} \ \ mathrm {ácido} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {polímero} \ \ mathrm {micela} \ \ left (\ mathrm {mg} \ right)} {\ mathrm {Quantidade} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm { oleanolic} \ \ mathrm {acid} \ \ mathrm {in} \ mathrm {itially} \ \ mathrm {adicionado} \ \ left (\ mathrm {mg} \ right)} \ times 100 $$

Estabilidade do PMO-H

A estabilidade física do PMO-H foi avaliada armazenando-o a 40 ° C por 3 meses. Mudanças de cor, separação de fases, presença de precipitados e mudanças de turbidez foram avaliadas visualmente. Amostras de PMO-H tomadas em intervalos de tempo regulares foram analisadas por HPLC para determinar as quantidades de ácido oleanólico restantes e por um ELS-Z para determinar o tamanho de partícula de PMO-H. Os resultados são apresentados na Fig. 9

Teste de permeação cutânea in vitro

Um estudo de permeação cutânea in vitro foi realizado usando uma célula de difusão de Franz para investigar o aumento da permeação cutânea de ácido oleanólico. O teste foi realizado em PMO-G, PMO-H, a mistura de ácido oleanólico e Tween 80 dispersos em água destilada, e a mistura de ácido oleanólico e propilenoglicol dispersos em água destilada. A pele de um camundongo sem pêlos fêmea de 6 semanas de idade foi cortada em pedaços do tamanho necessário. Foram utilizadas células de Franz verticais, e a pele foi fixada entre as duas câmaras com o estrato córneo voltado para cima. 330 μl da formulação selecionada foram aplicados na pele e as células de Franz foram cobertas com parafilme. O receptor foi preenchido com solução de PBS (pH 7,4) e etanol na proporção de 9:1 (v / v). A solução receptora foi recarregada com solução PBS fresca em cada tempo de amostragem. As amostras foram retiradas às 2, 4, 6, 8, 10, 20 e 24 horas e analisadas por HPLC. Após 24 h, o excesso de formulação remanescente na pele foi removido com Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Austrália). A pele usada no estudo de permeação foi limpa com solução de PBS e o ácido oleanólico remanescente na pele foi medido por HPLC. Todas as experiências de permeação foram realizadas em triplicado.

Estatísticas do estudo

Os experimentos foram realizados em três repetições independentemente, e os resultados deste estudo foram relatados como média ± DP. A análise estatística foi verificada por t independentes teste e o valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Preparação da ampola com PMO-H

Para o teste clínico, PMO-H foi usado como o produto de teste. PMO-H, água purificada, EDTA dissódico, alantoína, dipropilenoglicol, propanodiol, carbômero e PEG / PPG / polibutilenoglicol-8/5/3 glicerina foram adicionados e agitados por 10 ~ 15 min usando um agitador magnético e, em seguida, potássio hidróxido foi adicionado e a mistura foi agitada durante mais 5 ~ 10 min. Uma vez que os ingredientes foram homogeneamente misturados, hialuronato de sódio e beta-glucano foram adicionados e agitados por mais 2 ~ 5 min, e então fenoxietanol, propanodiol, caprilil glicol e etilhexilglicerina foram adicionados e agitados por 2 ~ 5 min. A fórmula final foi adicionada a uma ampola como produto de teste. As bolhas de ar da ampola foram removidas usando um forno de vácuo seco antes do uso de teste. Um controle foi preparado seguindo o mesmo método para o produto de teste, exceto que o ácido oleanólico foi excluído.

Testes de aplicativos humanos

Estudo de irritação da pele humana

Um teste de remendo da pele do produto cosmético, que continha PMO-H em uma ampola, foi realizado em 25 indivíduos do sexo masculino e feminino com idades entre 22 e 56 anos que concordaram em participar de um teste de irritação da pele humana. Cada substância de teste foi colocada no braço e fixada com um adesivo. O patch foi fixado por 24 heo grau de estimulação foi observado por 2 profissionais 30 min, 24 he 48 h após a remoção do patch de acordo com os critérios do International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG).

Ensaio clínico para melhora das rugas

Micelas poliméricas contendo ácido oleanólico em uma ampola como forma de produto final foram aplicadas ao redor dos olhos de 23 mulheres com idades entre 30 e 65 anos que concordaram em participar do teste de melhora de rugas. Os sujeitos preencheram os critérios de inclusão e nenhum dos critérios de exclusão e concordaram em participar do teste de aplicação em humanos. O método duplo-cego foi seguido por pesquisadores e assuntos de teste. O teste foi realizado por 8 semanas, e a avaliação foi realizada a cada 4 semanas. O método duplo-cego e a alocação aleatória foram usados. O produto de teste e o controle foram aplicados separadamente aleatoriamente no lado esquerdo ou direito do rosto do mesmo sujeito. Cinco parâmetros foram avaliados por perfilometria óptica usando Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Cologne, Germany) a cada 4 semanas por 8 semanas - rugosidade média (R3) foi o desfecho primário, e os quatro parâmetros de rugosidade da pele (R1) , rugosidade máxima (R2), profundidade de suavidade (R4) e rugosidade média aritmética (R5) foram os pontos finais secundários. Aumentos ou diminuições dos cinco parâmetros na mesma área do sujeito foram medidos ao longo do tempo, e os valores médios de aumento ou diminuição dos cinco parâmetros foram calculados e comparados entre os tratamentos de controle e produto de teste. Além disso, foi realizada uma observação visual da pele por profissionais. Fotografias das rugas dos olhos foram tiradas usando Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Coréia). Os critérios usados ​​para determinar as pontuações da avaliação visual são mostrados na Fig. S1, e os resultados visuais são apresentados na Fig. 13. Os parâmetros foram comparados e analisados ​​usando um par de amostras t teste com uma confiabilidade de 95% [20,21,22,23,24,25].

Resultados e discussão

Determinação de solubilizante, surfactante e polímero

A solubilidade do ácido oleanólico em solubilizantes biocompatíveis, especificamente surfactantes e polímeros, é mostrada na Tabela 1. O ácido oleanólico tende a ser solúvel em óleos hidrofóbicos com baixo equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB). Capryol® 90 tem um valor de HLB ligeiramente superior em comparação com óleos gerais [26]. No entanto, o ácido oleanólico mostra uma solubilidade relativamente alta em Capryol® 90. Além disso, Capryol® 90 pode ser facilmente estabilizado como o núcleo interno de micelas [27]. Depois de selecionar Capryol® 90, vários tipos de surfactantes ou poloxâmeros foram selecionados para a parte da casca das micelas de ácido oleanólico [27,28,29,30]. As composições de micelas de ácido oleanólico apresentadas na Tabela 2 são as que ficaram transparentes imediatamente após serem diluídas com água destilada. No entanto, algumas composições eram instáveis ​​e sofreram precipitação, separação de fases ou gelificação em 24 h. Imagens representativas de precipitado, fase separada, líquido transparente e estados de gel são mostrados na Fig. 2. O estado final de cada fórmula é resumido na Tabela 3. As composições G e H permaneceram transparentes mesmo após 24 h. Embora a composição I permanecesse clara, era mais um gel do que um líquido. As composições A a D tornaram-se opacas com precipitação após 24 h. Dados esses resultados, as composições G e H foram selecionadas para desenvolvimento posterior.

Imagens representativas de a precipitação, b separação de fases, c líquido transparente e d gelificação de micelas de ácido oleanólico

Características das Micelas Poliméricas de Ácido Oleanólico

As estruturas das micelas poliméricas de ácido oleanólico foram investigadas pelo teste de coloração. A Figura 3 mostra as imagens da mistura de Capryol® 90 e água destilada, Capryol® 90, água destilada e as micelas poliméricas da composição G (PMO-G) e da composição H (PMO-H), após adição de azul de metileno ao a solução. A separação de fase clara ocorreu para a mistura de Capryol® 90 e água destilada. A precipitação de azul de metileno foi observada no caso do Capryol® 90. A água destilada tornou-se azul escura após a adição de azul de metileno. PMO-G e PMO-H também ficaram azuis, indicando que as micelas poliméricas consistiam em um núcleo interno de fase oleosa e uma camada externa de fase aquosa. Em outras palavras, um polímero anfifílico, poloxamer 407 nas composições G e H, serve como um invólucro externo e ajuda a formar micelas poliméricas de ácido oleanólico encapsulando o núcleo interno de Capryol® 90 contendo ácido oleanólico [31].

Teste de coloração usando azul de metileno:( a ) mistura de Capryol® 90 e água destilada, ( b ) Capryol® 90, ( c ) água destilada, ( d ) PMO-G, e ( e ) PMO-H

O tamanho da partícula, a distribuição do tamanho e a forma podem ser bons indicadores para prever a estabilidade física das formulações de micelas. O tamanho médio de partícula do PMO-G foi de 80,4 nm e o do PMO-H foi de 57 nm (Fig. 4). Os histogramas de PMO-A, G e H são mostrados na Fig. 5 para comparar as distribuições de tamanho afetadas pelo estado de fase. Conforme mostrado na Tabela 3, PMO-A é opaco devido à precipitação, e PMO-G e H são transparentes. O tamanho de partícula do PMO-A é superior a 100 nm, e o PMO-A mostra uma distribuição de tamanho mais ampla do que o PMO-G e H (Fig. 5). PMO-H mostra uma distribuição de tamanho de partícula mais estreita do que PMO-G e exibe uma fluidez adequada para produtos cosméticos.

O tamanho médio de partícula de PMO-G e PMO-H da Tabela 2:80,4 ± 11,1 nm (PMO-G) e 57 ± 5,24 nm (PMO-H)

Histograma de análise de partículas de três amostras diferentes de PMO. a PMO-A, 121,28 nm; b PMO-G, 80,4 nm; e ( c ) PMO-H, 57 nm

A eficiência de encapsulação para PMO-G e PMO-H foi de 99 a 100%, indicando que quase 100% do ácido oleanólico foi encapsulado no núcleo interno do PMO (Fig. 6).

Eficácia de encapsulação de PMO-G e PMO-H mostrando quase 100% de eficiência de encapsulação de droga:98,26 ± 0,17% (PMO-G) e 99,18 ± 1,06% (PMO-H)

A forma do PMO-G e PMO-H foi investigada por criomicroscopia eletrônica de varredura (Cryo-SEM). O crio-SEM mostrou que tanto o PMO-G quanto o PMO-H eram micelas poliméricas de forma esférica. No entanto, as micelas poliméricas PMO-H foram mais consistentes em tamanho e forma do que as micelas poliméricas PMO-G (Fig. 7).

Varredura de imagens criomicroscópicas de elétrons de a PMO-G e b PMO-H

Estudo de permeação cutânea in vitro de PMO

A quantidade total de ácido oleanólico remanescente na pele e a quantidade total de ácido oleanólico permeado pela pele em função do tempo foram medidas usando a pele de um camundongo sem pêlos do sexo feminino de 6 semanas de idade. Quatro formulações diferentes, PMO-G, PMO-H, a mistura de ácido oleanólico e Tween 80 disperso em água destilada (OTw), e a mistura de ácido oleanólico e propilenoglicol disperso em água destilada (OPG) foram comparadas em termos de pele eficiência de permeação do ácido oleanólico. As quantidades totais de ácido oleanólico permeado pela pele após 24 h foram 29,49 ± 4,00% para PMO-H, 21,39 ± 5,91% para PMO-G, 13,66 ± 0,81% para OTw e 5,90 ± 2,47% para OPG. Como mostrado na Fig. 7, a primeira detecção de ácido oleanólico no caso de PMO-G e PMO-H foi possível às 8 h, enquanto a primeira detecção de ácido oleanólico em OTw foi possível em 10 h, e OPG em 20 h. As proporções de ácido oleanólico deixado na pele foram 56,22 ± 13,5% para PMO-H, 36,74 ± 0,72% para PMO-G, 27,44 ± 7,02% para OTw e 26,28 ± 5,42% para OPG. O PMO-H mostrou a maior quantidade de ácido oleanólico permeado pela pele e ácido oleanólico remanescente na pele (Fig. 8). Esses resultados indicam que os PMOs podem permear mais rápido e mais do que as formulações que não formam micelas.

Quantidade total de ácido oleanólico em PMO-G, PMO-H, ácido oleanólico e mistura de Tween 80 dispersa em água destilada (Otw) e mistura de ácido oleanólico e propilenoglicol dispersa em água destilada (OPG) permeada pela pele e a quantidade de oleanólico ácido em cada formulação em função do tempo. Quantidade de ácido oleanólico permaneceu na pele após 24 h:36,74 ± 0,72% (PMO-G), 56,22 ± 13,50% (PMO-H), 27,44 ± 7,02% (Otw) e 26,28 ± 5,42% (OPG). Quantidade de ácido oleanólico permeado após 24 h:21,39 ± 5,91% (PMO-G), 29,49 ± 4,00% (PMO-H), 13,66 ± 0,81% (Otw) e 5,90 ± 2,67% (OPG)

Estabilidade de micelas poliméricas de ácido oleanólico líquido

Com base na caracterização e estudos de permeação in vitro, PMO-H foi finalmente selecionado para a preparação de ampolas. Antes da preparação da ampola, a estabilidade de ONM-H foi avaliada. Para o estudo de estabilidade, o PMO-H foi armazenado em frascos sob condições de estudo de estabilidade acelerado a 40 ° C / 75% UR por 3 meses. A precipitação, separação de fases, mudanças de cor e transparência foram então avaliadas visualmente. A proporção de ácido oleanólico foi então medida usando HPLC, e as mudanças no tamanho das partículas também foram verificadas. A estabilidade foi verificada ao longo do tempo. O PMO-H permaneceu transparente sem precipitação ou separação de fases, e sua cor não mudou por 3 meses nas condições de estabilidade acelerada. A proporção de ácido oleanólico medida por HPLC e as mudanças de tamanho de partícula ao longo do tempo são mostradas na Fig. 9. A proporção de ácido oleanólico permaneceu acima de 98%, e o tamanho de partícula de 49,6 ± 5 nm permaneceu quase constante durante os 3 meses de estabilidade período de estudos. Esses resultados mostram que o PMO-H é física e quimicamente estável por 3 meses nas condições de estabilidade acelerada.

O conteúdo e o tamanho das partículas mudam de PMO-H durante 3 meses de teste de estabilidade sob condição de aceleração a 40 ° C / 75% UR. Proporção de ácido oleanólico em PMO-H:100 ± 1,6% (0 mês), 99,9 ± 0,2% (1 mês), 99,5 ± 0,2% (2 meses) e 99,3 ± 0,2% (3 meses). Tamanho de partícula de PMO-H:55,3 ± 6,5 nm (0 meses), 54,6 ± 7 nm (1 mês), 51,0 ± 5,56 nm (2 meses) e 49,6 ± 5 nm (3 meses)

Teste clínico

Teste de irritação humana

Antes do ensaio clínico, um teste de irritação humana foi conduzido em 25 voluntários saudáveis ​​do sexo feminino e masculino com idade entre 22 ~ 56 anos. O produto de teste foi aplicado no braço dos indivíduos por 24 h, e o índice de irritação da pele foi medido 30 min, 24 h e 48 h após a remoção do patch. Não foi observada irritação com a fórmula de ampola de cosméticos contendo PMO-H em 1 h ou 48 h após a remoção do adesivo.

Ensaio clínico

O ensaio clínico foi conduzido em 23 mulheres, com idades entre 30 e 65 anos, com rugas ao redor dos olhos; excluindo as 3 desistências, 20 indivíduos completaram o teste aplicando separadamente o produto de teste, a ampola de PMO-H e o controle no lado esquerdo ou direito do rosto por 8 semanas. As alterações da pele foram avaliadas de acordo com cinco parâmetros - rugosidade média (R3) como um desfecho primário e quatro parâmetros adicionais como desfechos secundários, ou seja, aspereza da pele (R1), aspereza máxima (R2), profundidade de suavidade (R4) e aspereza média aritmética (R5). A pontuação da avaliação visual adicionou um ponto final secundário adicional. Os resultados estão resumidos na Tabela 4.

O endpoint primário R3 diminuiu 0,673% após 4 semanas de uso do produto de teste e estatisticamente significativamente em 7,835% após 8 semanas de uso ( p =0,006). Com a aplicação de controle, R3 aumentou em 5,127% após 4 semanas de uso e estatisticamente significativamente em 9,971% após 8 semanas de uso ( p =0,010). A diferença no valor R3 entre as áreas tratadas pelo produto de teste e aquelas tratadas pelo controle foi estatisticamente significativa após 8 semanas de uso ( p =0,000), mas não estatisticamente significativo após 4 semanas de uso, talvez devido à variação interindividual (Fig. 10).

Changes in primary endpoint value, R3, before, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of an ampoule containing polymeric micelles of oleanolic acid and the control during clinical trial. R3 value of test product use:0.094 ± 0.023 before use, 0.093 ± 0.023 after 4 weeks use, 0.086 ± 0.020 after 8 weeks use. R3 value of control product:0.087 ± 0.023 before use, 0.091 ± 0.025 after 4 weeks use, 0.095 ± 0.024 after 8 weeks use (A.U. for arbitrary unit). * ¹ The wrinkle analysis of R3 value decreased statistically significantly. * ² The wrinkle analysis of R3 value increased statistically significantly

The analysis of the secondary endpoint R1 showed that the value had decreased by 4.629% after 4 weeks of test product use and statistically significantly by 9.973% after 8 weeks of use (p =0.017). With control application, R1 had increased by 8.037% after 4 weeks of use and 4.799% after 8 weeks of use. The difference in R1 values between the areas using the test product and the control was not statistically significant after 4 weeks of use but was after 8 weeks of use (p =0.024). The secondary endpoint R2 had decreased by 1.048% after 4 weeks of test product use and 5.803% after 8 weeks. With control application, it had increased by 7.261% after 4 weeks and 9.536% after 8 weeks. The difference in R2 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.016) but not after 4 weeks of use. The secondary endpoint R4 had significantly decreased by 8.594% (p =0.039) after 4 weeks of test product use and by 9.747% after 8 weeks of use. With the control, R4 had increased by 10.764% after 4 weeks of use and 3.491% after 8 weeks of use. Interestingly, the difference in R4 value between the areas using the test product and the control was statistically significant after 4 weeks of use (p =0.008) but not after 8 weeks. The secondary endpoint R5 had decreased by 6.333% after 4 weeks of test product use and 8.556% after 8 weeks of use. The difference in R5 value between the areas of using the test product and the control was not statistically significant following 4 weeks or even 8 weeks of use.

The analysis of the further secondary endpoint, the visual evaluation of wrinkles, showed that the visual evaluation score had decreased by 2.917% after 4 weeks of test product use and statistically significantly decreased by 8.333% after 8 weeks of use (p =0.034). With application of the control, the visual evaluation score had increased by 1.667% after 4 weeks and 4.167% after 8 weeks. The difference of the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.046) but not after 4.

In summary, the analysis of the wrinkled area around the eyes showed that the difference in the primary endpoint value R3 between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use. In terms of the secondary endpoints, all values had decreased after test product use and increased after control use. The difference in R4 values between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 4 weeks of use, but the difference of the R1 and R2 values were statistically significant only after 8 weeks of use (Fig. 11). The visual evaluation score by professionals showed that all the average visual evaluation scores for wrinkles had decreased after 4 weeks and 8 weeks of test product treatment compared to the control (Table 5). The difference in the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (Fig. 12). Overall, according to all endpoints, the cosmetics formula containing PMO-H as a primary ingredient was found to help improve wrinkles after 8 weeks of use (Fig. 13).

Results of secondary endpoint R1, R2, R4, and R5 for skin wrinkle measurement—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Please refer to Table 4 for the exact values (A.U. for arbitrary unit)

Results of visual evaluation of skin—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Test product:3.050 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.999 after 4 weeks use, and 2.75 ± 0.851 after 8 weeks. Control product:2.900 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.945 after 4 weeks use, and 3.000 ± 0.918 after 8 weeks use. * ¹ The visual evaluation grade of wrinkles by professionals decreased significantly. * ² The visual evaluation grade of wrinkles by professionals increased significantly

Pictures of the tested areas

Conclusions

Surfactants are commonly used excipients in cosmetic products to improve solubility of poorly soluble materials. One caveat would be the amount included in the product. Surfactants should be added in sufficient amount to dissolve poorly soluble materials without precipitation. Only a minimal amount should be added for safety reasons. Micelle formulation could be the solution to this problem. Polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study improve the solubility of oleanolic acid with a minimum amount of surfactants and enhance the permeation of oleanolic acid through the skin. Stable polymeric micelles of oleanolic acid were developed using Capryol 90 and poloxamer. The polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study were stable, that is, they did not show any precipitation, phase separation, or degradation at 40 °C after 3 months. The clinical trial showed that, as a main active ingredient, the oleanolic acid in the polymeric micelle formulation is effective for alleviating human wrinkles. Based on these findings, it can be concluded that oleanolic acid, which is poorly soluble in water and therefore, unusable in a native form as a principal ingredient for alleviating skin wrinkles, can be formulated into applicable polymeric micelles. Furthermore, it is expected that the polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study will prove very useful for alleviating human wrinkles and will prove widely applicable to cosmetic applications.

Disponibilidade de dados e materiais

Not applicable

Abreviações

PMO:

Polymeric micelles of oleanolic acid

PEG:

Polietileno glicol

TRANSCUTOL P:

Highly purified diethylene glycol monoethyl ether

LABRASOL:

PEG-8 Caprylic/Capric Glycerides

LAUROGLYCOL FCC:

Propylene glycol monolaurate (type I, monoesters>45%)

LABRAFAC:

Caprylic/Capric Triglyceride

Capryol® 90:

Propylene glycol monocaprylate (type II, monoesters>90%)

Capryol™ PGMC:

Propylene glycol monocaprylate (type I, monoesters>55%)

EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic Acid

ELS:

Electrophoretic light scattering

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