Eficácia antitumoral aprimorada e farmacocinética de Bufalin via lipossomas PEGuilados

Resumo

Foi relatado que o bufalin mostra fortes efeitos farmacológicos, incluindo cardiotônicos, antivirais, imunorregulação e, especialmente, efeitos antitumorais. O objetivo deste estudo foi determinar a caracterização, eficácia antitumoral e farmacocinética de lipossomas PEGuilados carregados com bufalina em comparação com a entidade bufalina, que foram preparados por excipientes farmacêuticos aprovados pela FDA. Lipossomas PEGuilados carregados com bufalina e lipossomas carregados com bufalina foram preparados reprodutivelmente com tamanho de partícula homogêneo pela combinação do método de evaporação de filme fino e método de homogeneização de alta pressão. Seus tamanhos médios de partícula foram 127,6 e 155,0 nm, média zeta os potenciais eram 2,24 e -18,5 mV, e as eficiências de aprisionamento eram 76,31 e 78,40%, respectivamente. O perfil de liberação in vitro revelou que a liberação de bufalina em lipossomas PEGuilados carregados com bufalina foi mais lenta do que em lipossomas carregados com bufalina. A citotoxicidade dos lipossomas em branco foi encontrada dentro da faixa aceitável, enquanto os lipossomas PEGuilados carregados com bufalina mostraram citotoxicidade aumentada para células U251 em comparação com a entidade bufalina. A farmacocinética in vivo indicou que os lipossomas PEGuilados carregados com bufalina podem estender ou eliminar o tempo de meia-vida da bufalina no plasma de ratos. Os resultados sugeriram que os lipossomas PEGuilados carregados com bufalina melhoraram a solubilidade e aumentaram a concentração da droga no plasma.

Histórico

As doenças cancerosas são de enorme importância global, pois a população de pacientes com câncer, que aumenta anualmente, pode crescer pela metade até 2020 [1]. Devido à existência da barreira hematoencefálica (BBB) ​​e resistência a múltiplas drogas, o tumor de glioma é uma das doenças que mais ameaçam a vida sem agentes terapêuticos eficazes clinicamente [2]. Bufalin foi isolado e identificado de Venenum Bufonis , que são as secreções da pele e das glândulas de veneno da parótida do sapo Bufo bufo gargarizans Cantor ou Bufo melanostictus Schneider [3]. Foi relatado que tem fortes efeitos farmacológicos, incluindo cardiotônicos, antivirais, imunorregulação e, especialmente, efeitos antitumorais [4,5,6,7]. No entanto, a baixa solubilidade dificulta a dispersão na solução aquosa e restringe a aplicação [8].

Os lipossomas têm sido considerados como um novo sistema de entrega de drogas para melhorar a baixa solubilidade da droga em solução hidratada, aumentar a biodisponibilidade, aumentar a eficiência terapêutica e reduzir os efeitos colaterais [9]. Principalmente, pode ser útil para os agentes carregados passarem pelo BBB e serem entregues ao cérebro [10]. No entanto, uma das principais deficiências da formulação lipossomal é a sua rápida eliminação do sangue devido à absorção da proteína plasmática pela membrana fosfolipídica dos lipossomas, que posteriormente desencadeia o reconhecimento e a absorção nos lipossomas pelo sistema fagocítico mononuclear. Felizmente, quando o polietilenoglicol (PEG) é modificado na superfície dos lipossomas, esse tipo de fagocitose pode ser lento. Portanto, é necessário estudar os lipossomas PEGuilados carregados com bufalina como lipossomas de longa circulação para aumentar sua solubilidade aquosa e melhorar sua farmacocinética [11].

Até à data, os estudos sobre a farmacocinética da bufalina não receberam muita atenção. Alguns relatórios enfocam apenas a farmacocinética da bufalina livre em solução aquosa por administração oral. No presente estudo, desenvolvemos lipossomas PEGuilados como um sistema de entrega de bufalina e comparamos a diferença farmacocinética entre lipossomas PEGuilados carregados com bufalina, lipossomas carregados com bufalina e entidade bufalina em solução aquosa por administração intravenosa em ratos.

Métodos

Produtos Químicos e Reagentes

Bufalin (≥ 98% em pureza) foi adquirido de BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (Baoji, Shaanxi, China). L-α-fosfatidilcolina, colesterol e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietilenoglicol) -2000] (sal de amônio; DSPE-PEG ₂₀₀₀ ) foram adquiridos da Sigma Chemical Co., Ltd. (St. Louis, MO, EUA) (as fórmulas moleculares dessas substâncias foram mostradas no arquivo adicional 1:Figura S1). O acetonitrilo usado era de grau espectroscópico e adquirido na Honeywell (América). O clorofórmio e o álcool (grau analítico) foram adquiridos na Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (China). Todos os produtos químicos eram analíticos ou de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). E a água foi desionizada pelo sistema de purificação de água Millipore (Milford, MA, EUA) e filtrada com membrana de 0,22 μm.

Animais e células

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da Fourth Military Medical University (Shaanxi, China) (aprovação 2015-1013-R). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia com pentobarbital sódico e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Ratos Sprague-Dawley machos, pesando inicialmente 250 ± 20 g, foram obtidos na Quarta Universidade Médica Militar (Xi’an, China). As linhas de células SW620, PC-3, MDA-MB-231, A549, U251, U87 e HepG2 foram respectivamente adquiridas no Shanghai Cell Bank ou no Experimental Animal Center da Fourth Military Medical University, cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% ( v / v ) soro fetal bovino (SFB) e antibióticos a 1% (penicilina G 100 U / mL e estreptomicina 0,1 mg / mL). As células foram mantidas em sua fase de crescimento exponencial em uma atmosfera de 5% CO ₂ e 90% de umidade relativa a 37 ° C.

Síntese de lipossomas carregados com bufalina

Os lipossomas foram preparados como um tamanho de lote de 10 mL usando homogeneização de alta pressão. A quantidade de bufalin usada foi a mesma em todos os lipossomas. Resumidamente, lipossomas comuns carregados com bufalina foram preparados com uma composição de bufalina, colesterol e L-α-fosfatidilcolina em uma razão molar de 10:30:60; Lipossomas PEGuilados carregados com bufalina foram sintetizados com uma composição de bufalina, colesterol, L-α-fosfatidilcolina e DSPE-PEG ₂₀₀₀ em uma razão molar de 10:30:55:5, respectivamente.

As misturas de fosfolipídios acima foram totalmente dispersas em 3 mL de clorofórmio e, em seguida, o clorofórmio foi completamente volatilizado por um evaporador rotativo a 50 ° C sob condição de descompressão. Posteriormente, o solvente residual (se houver) foi seco colocando em um dessecador a vácuo durante a noite e, em seguida, o filme fino seco preparado foi reidratado usando vórtice em 10 mL de água desionizada pré-aquecida a 50 ° C a 10 mmol / mL de fosfolipídeo por 15 min. A mistura assim formada foi posteriormente processada com homogeneização de alta pressão. A pressão e o tempo de homogeneização foram otimizados e encontrados em 500 bar a 35 ° C, e o processo foi reciclado 10 vezes. A suspensão de lipossoma resultante foi imediatamente extrudida com uma extrusora Lipex (ATS, Canadá) duas vezes usando membranas de policarbonato (tamanho de poro de 0,2 μm, Whatman, Maidstone, Reino Unido) para formar lipossomas unilamelares. A suspensão lipossomal em branco também foi preparada pelo mesmo método descrito anteriormente, omitindo a etapa de adição de bufalina.

Caracterização de lipossomas carregados com bufalina

Tamanho da partícula e potencial Zeta

O tamanho da partícula e zeta potencial dos lipossomas foram determinados pela técnica de espalhamento dinâmico de luz usando o zeta analisador de potencial (Delsa ™ Nano, Beckman Coulter, Califórnia, EUA). Todos os lipossomas de bufalina foram diluídos com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para uma concentração apropriada antes de determinar a distribuição de tamanho e zeta potencial. As medições foram realizadas no modo totalmente automático.

Microscopia Eletrônica de Transmissão de Alta Resolução

Os lipossomas de bufalina foram ainda caracterizados com estudos de microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HR-TEM). A suspensão lipossomal de bufalina apoiada em uma grade de cobre de 300 mesh foi corada negativamente com 1% ( w / v ) ácido fosfotúngstico. A imagem direta da morfologia foi executada em voltagens de aceleração de 200 kV usando um TEM (Hitachi H-7650, Tóquio, Japão).

Eficiência de aprisionamento

O conteúdo de bufalina foi analisado pelo método HPLC. O sistema HPLC Shimadzu (Kyoto, Japão) foi equipado com uma bomba LC-20AT, detector de matriz de diodos SPO-M20A, forno de coluna CTO-10AS VP e amostrador automático SIL-10AF. Todas as separações foram realizadas em uma coluna SinoChrom ODS-BP C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm, Yillite) (Yillite, Dalian, China). O volume de injeção foi de 20 μL e o efluente da coluna foi monitorado a 296 nm. Os dados foram adquiridos e processados ​​usando o software ClassVP. A fase móvel consistia em uma mistura de acetonitrila:di-hidrogenofosfato de potássio 0,1% (com ácido fosfórico para ajustar o valor de pH de 3,8) com eluição gradiente (50:50, v / v ) A cromatografia foi realizada a uma taxa de fluxo de 1,0 mL / min. Para determinar a eficiência de aprisionamento, 1,0 mL de suspensão lipossomal de bufalina foi adicionado à coluna Sephadex G50 e eluído com PBS. A porção azulada do efluente foi coletada e completada até 10,0 mL (o volume final) pela adição de PBS. A quantidade ( W ₁ ) de bufalina na suspensão lipossomal foi determinada pelo método de HPLC. PBS foi adicionado na outra porção de 1,0 mL de suspensão lipossomal de bufalina, de modo a atingir o volume final de até 10,0 mL, e a quantidade ( W ₂ ) do bufalin contido foi determinado pelos mesmos meios. A porcentagem de bufalina aprisionada em lipossomas de bufalina foi calculada pela fórmula:
$$ \ mathrm {Armadilha} \ \ mathrm {eficiência} ={W} _1 / {W} _2 \ vezes 100 \% $$

Teste de estabilidade in vitro

A eficiência de aprisionamento testada pelo método de cromatografia Sephadex e o tamanho de partícula determinado por zeta o analisador de potencial foi aplicado para avaliar o perfil de estabilidade após armazenamento a 4 ° C nos dias 0, 7, 15, 30 e 90. Nos cinco pontos de tempo, 200 μL de suspensão de lipossoma foram aspirados para determinar a taxa de vazamento lipossomal. Imediatamente, bufalina livre de 200 μL de suspensão de lipossoma foi separada usando cromatografia em coluna Sephadex G50, e a quantidade de bufalina livre foi determinada pelo método de HPLC. A taxa de vazamento lipossomal foi calculada pela fórmula:
$$ \ mathrm {Lipossomal} \ \ mathrm {vazamento} \ \ mathrm {ratio} =\ left ({W} _0- {W} _X \ right) / {W} _0 \ times 100 \% $$ $$ { W} _0:\ mathrm {armadilha} \ \ mathrm {eficiência} \ \ mathrm {testado} \ \ mathrm {on} \ \ mathrm {dia} \ 0 $$ $$ {W} _X:\ mathrm {armadilha} \ \ mathrm {eficiência} \ \ mathrm {testado} \ \ mathrm {em} \ \ mathrm {dias} \ X $$

Liberação in vitro de Bufalin

Os comportamentos de liberação in vitro de bufalina de lipossomas foram conduzidos usando a técnica de bolsa de diálise a 37 ° C como descrito anteriormente com algumas modificações. PBS (pH =7,4) contendo 10% de soro fetal de vitela foi usado como meio de liberação. O fármaco livre foi removido dos lipossomas de bufalina por diálise exaustiva durante 4 h contra tampão PBS a 4 ° C. Resumidamente, 1,0 mL de suspensão lipossomal de bufalina foi pipetado para um tubo de diálise (Spectrumlabs, EUA; MWCO 30 kDa) com uma agitação horizontal suave (120 rpm / min) à temperatura ambiente. O tubo de diálise foi mantido em 50 mL de PBS (pH =7,4) contendo 10% de soro fetal de bezerro e a temperatura foi mantida a 37 ° C. O dialisante foi retirado do meio e substituído por um volume igual de PBS fresco em diferentes durações de tempo, viz. horas 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 e 48. A concentração de bufalina libertada foi medida por HPLC como descrito anteriormente.

Citotoxicidade

Estudos de citotoxicidade in vitro foram realizados usando ensaio MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) em vários tipos de linhas de células tumorais, incluindo SW620, PC-3, MDA-MB- 231, A549, U251, U87 e HepG2. Além disso, as células U87 e U251 foram selecionadas para medir os efeitos citotóxicos de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina em células tumorais de glioma. As células U87 e U251 foram semeadas respectivamente em placas de microtitulação de 96 poços a 1,0 × 10 ⁵ células / poço e pode aderir (37 ° C, 5% CO ₂ ) por 24 h, após o que o meio foi aspirado e substituído por 0,1 mL de meio fresco. Entidade bufalina, lipossomas em branco, lipossomas PEGuilados em branco, lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina foram diluídos em meio completo e adicionados às células em um volume total de 0,1 mL para atingir a concentração final desejada; para o controle, nenhuma solução de teste foi adicionada. Os lipossomas em branco e os lipossomas PEGuilados em branco foram avaliados para testar a toxicidade dos excipientes usados ​​na preparação de lipossomas de bufalina. Após 24 h, a viabilidade celular foi avaliada por incubação em um meio de crescimento contendo 5 mg / mL de MTT por 4 h a 37 ° C. Após aspirar o meio de cultura, os cristais de formazan formados foram solubilizados com 200 μL de solvente orgânico. A absorbância foi medida em um leitor de microplaca em um comprimento de onda de 570 nm.

Estudo farmacocinético in vivo de lipossomas de bufalina usando método de HPLC

O estudo farmacocinético foi realizado para avaliar a absorção, distribuição, metabolismo e excreção da bufalina de lipossomas comuns ou lipossomas de longa circulação e para procurar as diferenças de biodisponibilidade da bufalina, usando a técnica de HPLC.

Neste experimento, ratos Sprague-Dawley machos adultos saudáveis, jovens, pesando 250 ± 20 g, foram adquiridos da Fourth Military Medical University (Xi'an, China). Os ratos foram alojados em gaiolas bem ventiladas em temperatura ambiente (24 ± 2 ° C) e 40-60% de umidade relativa, durante um ciclo regular de luz-escuridão de 12 horas. Os animais foram aclimatados por no mínimo 3 dias antes do experimento. Os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes do Comitê de Ética em Animais da Quarta Military Medical University.

Lipossomas carregados com bufalina, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina e bufalina em solubilização assistida por suspensão aquosa por etanol foram preparados como descrito anteriormente e então administrados por via intravenosa em uma dose equivalente de 0,5 mg / kg, respectivamente. Amostras de sangue foram coletadas da fossa orbitalis de ratos sob anestesia leve com éter em tubos de microcentrifugação contendo heparina como anticoagulante a 2, 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 600 min após dosagem e depois centrifugado a 3500 r / min durante 15 min a 4 ° C. O plasma separado foi armazenado congelado a -20 ° C antes do ensaio.

Amostra de pré-tratamento

Um método simples de extração líquido-líquido foi seguido para a extração de bufalina e padrão interno de sangue de rato. Para 200 μL, uma solução de padrão interno (20 μL de estoque de trabalho de 100 μg / mL de cinobufagina) equivalente a 10,0 μg foi adicionada e misturada por 10 s em um ciclomixer, seguido pela extração com 3,0 mL de acetato de etila:éter de petróleo, 1:1 ( v / v ) e mistura. A mistura foi agitada em vórtice por 5 min, seguido por centrifugação por 15 min a 4000 r / min em Sigma 3-16k (Frankfurt, Alemanha). Uma alíquota de 3,0 mL da camada orgânica foi separada e evaporada até a secura sob nitrogênio e, em seguida, o resíduo foi redissolvido em 200 μL de acetonitrila. Vinte microlitros de fluido sobrenadante foram injetados na coluna analítica para análise após 15 min de centrifugação a 12.000 r / min.

Análise Farmacocinética

A concentração sanguínea máxima observada ( C _máximo ) e o tempo de meia-vida ( T _1/2 ) foram obtidos por inspeção visual dos dados experimentais. Os dados foram submetidos à análise farmacocinética não compartimental usando Drug and Statistics (DAS 2.1.1) editado pelo comitê profissional de farmacologia matemática da Sociedade Farmacológica Chinesa para avaliação clínica de medicamentos. Os dados foram analisados ​​de acordo com um modelo aberto de dois compartimentos.

Análise estatística

Todos os resultados foram expressos como média ± DP ( n =3), e as diferenças entre as formulações foram comparadas por análise de variância unilateral (ANOVA), usando o software GraphPad Prism 5. P <0,05 denota significância em todos os casos.

Resultados

Propriedades físico-químicas

A reidratação do filme combinada com a tecnologia de homogeneização de alta pressão foi usada para a preparação de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina. A reidratação do filme é um dos métodos convencionais para sintetizar lipossomas com processos maduros e controlados para aprisionar fármacos lipofílicos. Além disso, o número de ciclos de homogeneização desempenha um papel fundamental para alcançar uma suspensão lipossomal uniforme e estável.

As morfologias de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina são quase esféricas ou ovais conforme observado por TEM como mostrado na Fig. 1. De acordo com a imagem TEM, os tamanhos médios de partícula de lipossomas carregados com bufalina e PEGuilados carregados com bufalina os lipossomas estavam ambos abaixo de 200 nm. Os tamanhos médios de partícula de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina foram 127,6 ± 3,64 nm e 155,0 ± 8,46 nm, respectivamente (Fig. 1c), medidos por zeta analisador de potencial (Delsa ™ Nano, Beckman Coulter, Califórnia, EUA). Em comparação com os lipossomas carregados com bufalina, os lipossomas PEGuilados carregados com bufalina exibiram uma carga de superfície negativa, sugerindo excelente estabilidade (lipossomas carregados com bufalina 2,24 mV; lipossomas PEGuilados carregados com bufalina -18,05 mV, Arquivo adicional 2:Tabela S1). Além disso, as distribuições de zeta potencial pode ser visto na Fig. 1b. No entanto, a eficiência de aprisionamento da bufalina em lipossomas carregados com bufalina e em lipossomas PEGuilados carregados com bufalina determinada por HPLC é de 76,31 ± 3,40% e 78,40 ± 1,62%, respectivamente.

Propriedades físico-químicas de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina. a Imagens TEM de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina com forma quase esférica ou oval. b O tamanho de partícula e distribuição típicos de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina, conforme medido por dispersão de luz dinâmica. c A superfície típica zeta potencial de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina

Teste de estabilidade in vitro

Os perfis de estabilidade de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina são mostrados na Tabela 1. Além disso, a razão de vazamento lipossomal também foi calculada. Para lipossomas carregados com bufalina, os resultados foram respectivamente 0,0, 16,7, 25,2, 27,9 e 30,6% a 4 ° C nos dias 0, 7, 15, 30 e 90. Para lipossomas PEGuilados carregados com bufalina, os resultados foram respectivamente 0,0 , 5,0, 8,8, 14,5 e 18,0% a 4 ° C nos dias 0, 7, 15, 30 e 90.

Perfil de liberação in vitro

O perfil de liberação de bufalina a partir de lipossomas carregados de bufalina ou lipossomas PEGuilados carregados de bufalina estão resumidos na Fig. 2. A partir dos dados experimentais, no mesmo meio de dissolução, a bufalina pode se difundir em PBS contendo 10% de soro fetal de bezerro rapidamente, sem restrições, seguido de bufalina lipossomas carregados com bufalina e, por último, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina.

Libertação in vitro de bufalina a partir de lipossomas comuns carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina em meio de dissolução tampão de fosfato, pH 7,4. Os dados são médias ± SD, n =3

Citotoxicidade

As viabilidades celulares de vários tipos de linhagens de células tumorais afetadas pela entidade bufalina são mostradas na Fig. 3a quando testadas pelo ensaio de MTT, e sua metade da concentração inibitória máxima (IC ₅₀ ) também são calculados no arquivo adicional 2:Tabela S2. Bufalin causou a inibição do crescimento em células tumorais múltiplas de uma maneira dependente da dose, enquanto os resultados de IC ₅₀ revelou que a bufalina era mais sensível às células cancerosas de glioma U251 e U87 do que as outras células cancerosas testadas, respectivamente. Quando aplicado com entidade bufalina, lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina, as viabilidades celulares de U251 realizadas por ensaio MTT são mostradas na Fig. 3b. Quando cultivadas por 12 h, as viabilidades celulares da entidade bufalina, lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina exibiram de forma diferente, enquanto as dos lipossomas em branco e lipossomas PEGuilados em branco não se alteraram. Conforme descrito, no mesmo nível de concentração, as viabilidades celulares de U251 no grupo de lipossomas PEGuilados carregados com bufalina foram sempre inferiores às do grupo de lipossomas carregados com bufalina; entretanto, os impactos da entidade bufalin nas viabilidades das células foram mínimos.

Citotoxicidade in vitro de lipossomas em branco, lipossomas PEGuilados em branco, entidade bufalina, lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina contra células tumorais. a Viabilidade celular de vários tipos de linhagens de células tumorais em várias concentrações da entidade bufalina. b Viabilidade celular de células U251 em várias concentrações de lipossomas em branco, lipossomas PEGuilados em branco, entidade bufalina, lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina

Estudo farmacocinético in vivo

Validação do método

A curva de calibração foi traçada com base na análise de regressão linear da objeção ao padrão interno da razão da área do pico ( y ) versus concentrações ( x , μg / mL) de bufalina na solução padrão em sete concentrações diferentes. A equação de regressão era y =0,4238 x + 0,2429 (intervalo linear 0,05–10,0 μg / mL) e coeficientes de correlação ( R ² ) eram 0,9965. O valor do limite de detecção (LOD) foi de 0,01 μg / mL, que foi calculado como a quantidade da amostra injetada que deu uma razão sinal-ruído de 3 (S / N =3).

Especificidade, precisão e recuperação

O grau de interferência por substâncias endógenas foi avaliado por inspeção de cromatogramas derivados de amostras de plasma em branco processadas. Arquivo adicional 3:A Figura S2 apresenta cromatogramas típicos de plasma em branco, plasma em branco enriquecido com bufalina, plasma em branco enriquecido com bufalina e resibufogenina (como padrão interno), amostras de plasma enriquecidas com resibufogenina 30 min após a administração intravenosa de entidade bufalina, amostras de plasma enriquecidas com resibufogenina 30 minutos após a administração intravenosa de lipossomas carregados com bufalina e amostras de plasma enriquecidas com resibufogenina 30 minutos após a administração intravenosa de lipossomas PEGuilados carregados com bufalina. Bufalina e resibufogenina foram eluídas em aproximadamente 7,191 e 10,131 min, respectivamente. Não foram encontrados picos de interferentes e materiais de membrana de lipossoma no tempo de retenção de bufalina ou padrão interno. Os resultados dos testes de precisão e recuperação são ilustrados na Tabela 2.

Farmacocinética

Os perfis de concentração no sangue-tempo de lipossomas carregados com bufalina, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina e sua comparação com a entidade bufalina em suspensão aquosa são mostrados na Fig. 4. Os parâmetros farmacocinéticos médios são apresentados na Tabela 3. Os resultados mostraram que havia diferenças significativas na maioria desses parâmetros entre eles, e o C _máximo de lipossomas carregados com bufalina foi menor do que a entidade bufalina, enquanto que a dos lipossomas PEGuilados carregados com bufalina foi menor. Além disso, o T _{1 / 2z} a proporção de lipossomas PEGuilados carregados com bufalina para entidade bufalina e de lipossomas carregados com bufalina para entidade bufalina foi de cerca de 2,15 vezes (87,84 min / 40,52 min) ( P <0,01) e 1,34 vezes (54,40 min / 40,52 min) ( P <0,05), respectivamente. O AUC _{(0– t )} a proporção de lipossomas PEGuilados carregados com bufalina para entidade bufalina e lipossomas carregados de bufalina para entidade bufalina foi de cerca de 5,49 vezes (139,157,83 ng / (mL min) / 25,334,27 ng / (mL min)) ( P <0,01) e 2,28 vezes (57.751,88 ng / (mL min) / 25.334,27 ng / (mL min)) ( P <0,01), respectivamente. Revelou que a entidade bufalina foi rapidamente eliminada na corrente sanguínea e a preparação de lipossomas aumentou a concentração do fármaco no plasma e resistiu à depuração. Além disso, a modificação do PEG pode facilitar este efeito.

Curva de concentração-tempo de bufalina no plasma de ratos

Discussão

Este estudo preparou lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados com bufalina com sucesso pelo método de reidratação de filme de homogeneização, ambos com faixa de tamanho ideal e baixa polidispersidade e podem ser facilmente reproduzidos em um grande tamanho de lote. Este estudo descobriu que a formulação lipossomal melhorou muito a solubilidade da bufalina.

Os lipossomas PEGuilados carregados com bufalina exibiram uma carga superficial negativa com um valor absoluto maior do que os lipossomas carregados com bufalina com uma carga superficial positiva. O zeta o potencial é determinado principalmente pelas propriedades da superfície. Os lipossomas carregados com bufalina não modificados eram neutros e seus potenciais estavam geralmente dentro de ± 5 mV. No entanto, o DSPE não é carregado em condições neutras, mas o processo de preparação não pode ser completamente neutro, então o DSPE é carregado negativamente. Enquanto isso, o zeta o potencial da macromolécula PEG é quase negativo por vários milivolts, próximo ao potencial negativo neutro. Portanto, após a modificação da superfície de DSPE-PEG ₂₀₀₀ em lipossomas carregados com bufalina, o zeta o potencial dos lipossomas PEGuilados carregados com bufalina é negativo. Estas descobertas sugerem que a modificação da superfície de DSPE-PEG ₂₀₀₀ altera os potenciais elétricos de superfície dos lipossomas, o que aumenta a sua estabilidade. Foi confirmado por teste de estabilidade in vitro. Li et al. [12] empregou um sistema de co-distribuição de lipossoma que acoplou mAbs anti-CD40 à superfície de lipossomas PEGuilados envolvidos com bufalina. Os lipossomas foram sintetizados com uma composição de bufalina, colesterol, EPC, DSPE-PEG ₂₀₀₀ e DSPE-PEG ₂₀₀₀ -Mal em uma razão molar de 20:55:5:5:15, respectivamente. Em seguida, o anticorpo monoclonal anti-CD40 foi conjugado aos lipossomas através da reação maleimida-tiol para a preparação de anti-CD40 ancorado em lipossoma de bufalina. Com relação ao perfil de estabilidade, menciona-se apenas que a carga superficial negativa sugere excelente estabilidade sem descrição de dados clara e definitiva.

Li et al. [13] preparou lipossoma carregado com bufadienolida (BU-lipo) consistindo em Lipoid E-80® 1,25% e colesterol 0,06%. As eficiências de aprisionamento de bufalina, cinobufagina e resibufogenina foram 86,5, 90,0 e 92,1%, respectivamente. Considerando a estabilidade dos fosfolipídios, o pH 6,5 foi escolhido para a formulação BU-lipo. As propriedades de BU-lipo, como pH, PSD, zeta o potencial e a eficiência de aprisionamento não mudaram por pelo menos 3 meses a 2–8 ° C. No entanto, a condição de armazenamento precisava ser estritamente controlada. Uma preparação mais estável em pH neutro precisa ser estudada para reduzir os custos de transporte e armazenamento, que devem ser levados em consideração em futuras aplicações clínicas.

De acordo com a formulação de preparação dos estudos anteriores, replicamos os experimentos sobre lipossomas carregados de bufalina. No entanto, a estabilidade dos lipossomas não atendeu às necessidades de produção.

No presente estudo, lipossomas PEGuilados carregados com bufalina foram sintetizados com uma composição de bufalina, colesterol, L-α-fosfatidilcolina e DSPE-PEG ₂₀₀₀ em uma razão molar de 10:30:55:5, respectivamente. Especialmente antes de ser extrudada com uma extrusora Lipex usando membranas de policarbonato, a mistura assim formada foi posteriormente processada com homogeneização de alta pressão.

Quando armazenados em pH neutro a 4 ° C por 3 meses, os tamanhos de partícula de ambos os lipossomas aumentaram ligeiramente e a eficiência de aprisionamento diminuiu modestamente em geral, o que será conveniente para ser usado em aplicação clínica. Uma fotografia TEM mostrou que uma estrutura semelhante a uma nuvem tridimensional espessa cobriu a superfície de lipossomas carregados com bufalina, o que indica que DSPE-PEG ₂₀₀₀ desempenha um papel na estabilização estérica devido à sua característica de estrutura de polímero anfifílico linear.

Um estudo de liberação in vitro revelou que as liberações de bufalina de lipossomas carregados com bufalina e lipossomas PEGuilados carregados de bufalina foram atrasadas no mesmo meio de dissolução, enquanto a entidade bufalina se difundiu no PBS rapidamente sem restrições. A modificação da superfície de DSPE-PEG ₂₀₀₀ alterou as propriedades de barreira da camada limite aquosa e a permeabilidade da membrana, resultando em uma baixa velocidade de liberação de bufalina dos lipossomas.

Em relação ao estudo de citotoxicidade, a bufalina causou uma inibição óbvia do crescimento em múltiplas células tumorais de uma forma dependente da dose, enquanto os resultados de IC ₅₀ indicou que a bufalina era mais sensível às células cancerígenas U251 e U87 glioma do que os outros tipos de células cancerígenas, respectivamente. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.

The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.

As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].

Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.

In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].

Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].

In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.

Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG₂₀₀₀ on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.

Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.

Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.

Conclusions

The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.

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