Reutilização de Fármacos Aprovados pela FDA para Inibir Protease Principal do SARS-CoV-2: Análise de Triagem Virtual

Alvejando a Protease Principal do SARS-CoV-2

Desenvolver um novo antiviral é caro e demorado. Em meio a uma pandemia global, a necessidade urgente é identificar fármacos que possam deter a replicação viral rapidamente. Reutilização de fármacos — aproveitar medicamentos já comprovados seguros em humanos — oferece um atalho promissor. Embora fármacos únicos possam fornecer benefícios modestos, combinações estratégicas que atacam múltiplas proteínas virais, como no caso da terapia para HIV, poderiam gerar ganhos clínicos substanciais. A questão-chave: quais combinações serão mais eficazes contra SARS-CoV-2?

Nosso estudo foca na arquitetura do sítio ativo da protease, comparando-a à protease do SARS-CoV bem caracterizada ligada a inibidores micromolares. Essa visão estrutural guia o design de inibidores potentes para SARS-CoV-2.

Em seguida, realizamos triagem virtual de uma biblioteca de fármacos aprovados pela FDA para identificar moléculas previstas para ligar à protease e avaliar seu potencial em terapias combinadas.

Proteínas do SARS-CoV-2

O sequenciamento rápido de genomas virais de pacientes forneceu sequências de numerosos alvos de fármacos potenciais. Muitas dessas proteínas compartilham alta similaridade com contrapartes do SARS-CoV, permitindo modelos de homologia iniciais. À medida que estruturas experimentais (Raio-X, Cryo-EM) se tornam disponíveis, refinam nosso entendimento de sítios drogáveis.

Entre coronavírus, a protease principal (Mpro, também conhecida como 3CL Protease) é um alvo de fármaco líder. Juntamente com proteases semelhantes a papaína, Mpro cliva a poliproteína 1ab em 11 sítios definidos, processo essencial para maturação viral.

Inibir Mpro bloqueia replicação. Como nenhuma protease humana compartilha sua especificidade de clivagem, inibidores são menos propensos a exibir toxicidade off-target.

Design Baseado em Estrutura para Reutilização: Mpro

Mpro funciona como homodímero (Fig. 2), cada subunidade contendo uma díade catalítica His41/Cys145.

A protease do SARS-CoV-2 compartilha 96,1% de identidade e 99% de similaridade com seu ancestral SARS-CoV. Apenas um resíduo difere no sítio ativo: posição 46 é Serina em vez de Alanina (Fig. 3).

Numerosas estruturas de Mpro do SARS-CoV complexadas com inibidores micromolares estão disponíveis; os ligantes mais potentes são covalentes. O sítio ativo é subdividido em quatro sub-sítios (S1′, S1, S2, S4) que acomodam diversos quimiotipos.

Em complexos de alta afinidade (PDB 2ZU4 e 2GX4; Ki = 0,038 µM e 0,053 µM), o tiol da cisteína 145 forma ligação covalente com o inibidor, ressaltando a importância do engajamento covalente para ligação forte.

Análise detalhada dessas interações informa os contatos-chave a monitorar em estudos de docking.

Fluxo de Trabalho de Triagem Virtual

Usando a estrutura cristalina de 2,5 Å do dímero da protease SARS-CoV-2 ligada ao inibidor covalente N3 (PDB 6LU7) liberada em fevereiro, conduzimos uma triagem virtual sistemática. N3 ocupa o bolso de ligação do substrato em conformação estendida (Fig. 5).

Nossa biblioteca compreendia 2.684 fármacos aprovados pela FDA com peso molecular < 800 Da. Docking foi realizado com GOLD (CCDC), seguido por cálculos de energia livre de ligação usando CHARMM/GBMV. Cada pose passou por minimização de ligante in-situ (esfera 14 Å) e estimativa de entropia do ligante. Muitos compostos com maior pontuação eram inibidores conhecidos de protease HIV/HCV (Fig. 6).

O melhor candidato, Troxerutina — um flavonoide — pontuou alto. Flavonoides têm atividade inibitória de protease documentada; valores recentes de IC₅₀ para herbacetina, rhoifolina e pectolinarina contra SARS-CoV foram 33,17, 27,45 e 37,78 µM, respectivamente.

Dipiridamol (Fig. 7) classificou-se em quinto. Um preprint recente relata sua capacidade de suprimir replicação de HCoV-19 com EC₅₀ de 100 nM in vitro.

Estudos de preprint de inibidores de protease HIV apoiam ainda mais atividade contra SARS-CoV-2. Nelfinavir, por exemplo, inibiu replicação viral em células Vero E6.

Ritonavir e Lopinavir, ambos interagindo com resíduos catalíticos e cadeias laterais adicionais (GLU166, PRO168, GLN189), estão sob investigação clínica. No entanto, dados de IC₅₀ para esses agentes contra SARS-CoV-2 permanecem indisponíveis.

Atazanavir também mostra atividade em células infectadas, reduzindo replicação viral e produção de citocinas pró-inflamatórias. Uma estrutura recém-lançada (PDB 6W63) com inibidor X77 compartilha orientação de sítio de ligação similar a 6LU7; re-docking confirmou previsões comparáveis.

Implicações e Direções Futuras

Com quatro sub-sítios, o bolso Mpro pode acomodar diversos ligantes com afinidade moderada. Triagem virtual serve assim como ferramenta poderosa para identificar inibidores candidatos e elucidar seus modos de ligação.

Essas hipóteses computacionais requerem validação experimental — medições de IC₅₀, docking covalente e perfil farmacocinético — para desenvolver terapêuticos clinicamente viáveis. Inibidores covalentes, em particular, frequentemente exibem potência superior e ação prolongada, tornando-os leads atraentes.

Em última análise, este trabalho fornece um roteiro rápido, guiado por estrutura, para reutilização de fármacos existentes contra COVID-19, facilitando a tradução urgente do laboratório ao leito.

Agradecemos ao Cambridge Crystallographic Data Centre pelo acesso ao GOLD; sua eficácia comprovada em triagem virtual e otimização de leads fundamenta este estudo. Uma interface para GOLD está disponível no Discovery Studio.