Nanomontagens de ácido 5-aminolevulínico-esqualeno para fotodetecção e terapia de tumor:estudos in vitro

Resumo

A protoporfirina IX (PpIX) como fotossensibilizador natural derivado da administração de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) encontrou uso clínico para fotodiagnóstico e terapia fotodinâmica de vários cânceres. No entanto, o uso mais amplo do 5-ALA em oncologia é dificultado por sua carga e polaridade, o que resulta em sua capacidade reduzida de ultrapassar barreiras biológicas e atingir o tecido tumoral. São necessárias plataformas de entrega de drogas avançadas para melhorar a biodistribuição de 5-ALA. Aqui, relatamos uma nova abordagem para a entrega de 5-ALA. A estratégia de esqualenoilação foi usada para conjugar covalentemente 5-ALA com esqualeno, um precursor natural do colesterol. Os nanomontagens 5-ALA-SQ foram formadas por automontagem em água. Os nanoconjuntos eram monodispersos com tamanho médio de 70 nm, índice de polidispersidade de 0,12 e potencial ζ de + 36 mV. Eles mostraram boa estabilidade ao longo de várias semanas. A carga de droga de 5-ALA foi muito alta, 26%. Em células de câncer de próstata humano PC3 e células de glioblastoma humano U87MG, a produção de PpIX foi monitorada in vitro após a incubação com nanomontagens. Eles foram mais eficientes na geração de fluorescência induzida por PpIX em células cancerosas em comparação com 5-ALA-Hex em 1,0 a 3,3 mM em tempos de incubação curtos e longos. Em comparação com o 5-ALA, eles mostraram desempenho de fluorescência superior em 4 h, que diminuiu em 24 h. 5-ALA-SQ apresenta uma nova plataforma de nano-entrega com grande potencial para a administração sistêmica de 5-ALA.

Histórico

A nanotecnologia médica introduziu novas plataformas de entrega de medicamentos promissoras. Eles são compostos de nanomateriais biocompatíveis e biodegradáveis ​​que ajudam a melhorar a estabilidade química e o perfil farmacocinético de compostos farmacologicamente ativos, proporcionando uma entrega controlada no local de ação [1,2,3]. No entanto, apenas alguns sistemas de nanopartículas chegaram até agora ao mercado. As principais armadilhas das nanopartículas (NPs) existentes são principalmente a baixa carga de droga (geralmente menos de 5%) e o “efeito de liberação repentina”, que provoca uma liberação prematura de uma porção significativa da droga antes de atingir o local alvo. Isso causa efeitos colaterais adversos e pode levar à toxicidade e perda da atividade farmacológica [4].

O esqualeno (SQ) é um triterpeno linear com a fórmula química C ₃₀ H ₅₀ e um precursor do colesterol e outros esteróides [5]. No corpo humano, o esqualeno é sintetizado no fígado e na pele e transportado pela lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) no sangue [6]. No contexto da terapia tumoral, o esqualeno exibiu um forte efeito de potencialização em certos agentes quimioterápicos [7]. Por ser amplamente encontrado na natureza e seguro, o esqualeno encontrou suas aplicações na tecnologia farmacêutica como um excipiente na preparação de emulsões lipídicas para a entrega de vacinas, vários compostos ativos e genes [6, 8, 9]. O esqualeno foi considerado adequado para a conjugação covalente com diferentes drogas. Nanossistemas avançados criados desta forma incorporam esqualeno conjugado a agentes quimioterápicos como gencitabina [10,11,12], paclitaxel [13], cisplatina [14] ou doxorrubicina [15]. Esta abordagem é chamada de “esqualenoilação” e envolve a estratégia de pró-fármaco com a formação dos sistemas nano-coloidais onde o princípio ativo é covalentemente ligado [16, 17]. Nanoconjuntos baseados em esqualeno (NAs) são formados por automontagem de componentes funcionais em meio aquoso e são caracterizados por alta carga de droga inerente [18]. Descobriu-se que a esqualenoilação aumenta a estabilidade da droga e aumenta a solubilidade de drogas pouco solúveis em água, melhorando assim a biodisponibilidade e prolongando a meia-vida da droga na circulação sistêmica [14, 16]. Na maioria dos casos, tais NAs auto-organizados exibem melhor atividade farmacológica do que o fármaco original [16, 19]. Além disso, a esqualenoilação fornece um meio para construir NAs contendo uma modalidade terapêutica e uma de imagem [20]. NAs teranósticos semelhantes foram relatados por Couvreur e colaboradores incorporando um agente de MRI em nanomontagens de esqualenoil-gencitabina (SQgem) [14]. Esses tipos de sistemas multifuncionais podem ser de grande importância no desenvolvimento de novos agentes teranósticos para a medicina personalizada.

No contexto da teranóstica do câncer, a administração de uma pequena molécula de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) (Fig. 1) levou ao uso clínico de 5-ALA para terapia fotodinâmica (PDT) [21,22,23] , fotodiagnóstico (PD) [24] e ressecção tumoral guiada por fluorescência em pacientes com câncer cerebral com glioma [25,26,27]. A teranóstica é alcançada pelo metabolismo de 5-ALA e acúmulo seletivo de protoporfirina IX (PpIX) dentro do tecido canceroso como consequência da inibição de feedback contornada do ciclo heme [22]. No entanto, a eficácia de 5-ALA PD e PDT é seriamente prejudicada por sua natureza zwitteriônica em pH neutro encontrado na corrente sanguínea. Diferentes tentativas foram feitas para melhorar a estabilidade do 5-ALA e o perfil farmacocinético. Ambas as extremidades amino e carboxílico do 5-ALA foram modificadas por várias abordagens [28]. A esterificação do grupo carboxila do 5-ALA levou ao éster metílico do 5-ALA (Metvix®) [29] e é usado no tratamento tópico de ceratose actínica, carcinoma basocelular e acne aguda. O éster hexílico de 5-ALA (5-ALA-Hex) (Hexvix®) ganhou autorização de comercialização para o fotodiagnóstico (PD) do câncer de bexiga [30, 31] e é experimentalmente explorado para o tratamento do câncer cervical e acne grave [32 , 33,34].

Estruturas químicas dos elementos de bloco de construção de NA. 5-ALA ( a ), 5-ALA-Hex ( b ), esqualeno ( c ), e 5-ALA-SQ ( d )

No entanto, com exceção de Gliolan ™, o uso clínico de 5-ALA e seus derivados é principalmente limitado à administração tópica. Isso limita seu uso em tipos mais importantes de câncer, como câncer de mama, colorretal, pulmão e próstata. As tentativas de ampliar o uso de 5-ALA tem derivados de 5-ALA sensíveis à fosfatase modificados na extremidade amino que mostraram atividade muito promissora recentemente [35, 36]. Além disso, foram realizadas tentativas para encapsular 5-ALA em diferentes nanosistemas, incluindo NAs poliméricos [37,38,39] ou lipossomas [40,41,42,43] e sua conjugação em dendrímeros [44, 45] ou NPs de ouro [46 , 47]. Embora algumas dessas soluções tenham ajudado a melhorar a estabilidade do 5-ALA e seu perfil farmacocinético, nenhuma das tentativas mencionadas resultou em um candidato clínico bem-sucedido no campo da nanomedicina contra o câncer.

O objetivo deste trabalho foi o projeto e a síntese do bloco de construção conjugado 5-ALA-esqualeno (5-ALA-SQ) (Fig. 1d) que se auto-monta em meio aquoso e contém alta carga de droga de 5-ALA, um pré-requisito para atividade farmacológica em cânceres. Os NAs foram testados em duas linhas de células cancerígenas diferentes quanto às suas capacidades de DP de fluorescência. Combinado com relatórios recentes de NAs baseados em esqualeno explorando lipoproteínas de plasma para atingir o direcionamento indireto de câncer [48], esta abordagem de nanotecnologia de 5-ALA expande o uso de 5-ALA para PD e PDT de diferentes cânceres, como o câncer de próstata usado neste estudo .

Resultados e discussão

Síntese de blocos de construção 5-ALA-SQ

Uma estratégia química convergente eficiente foi usada para sintetizar o bloco de construção 5-ALA-SQ a partir do esqualeno e 5-ALA (Fig. 2). 5-ALA foi primeiro protegido na extremidade amino com N Grupo de proteção -Boc usando condições padrão. Álcool esqualeno indutor de nanomontagem ( 3 ) foi sintetizado a partir do esqualeno em quatro etapas de síntese de acordo com os procedimentos descritos na literatura [49]. Boc-5-ALA ( 2 ) e álcool esqualeno ( 3 ) foram então acoplados na presença de EDC e DMAP para produzir o derivado de éster protegido ( 4 ) com bom rendimento. A desproteção final de Boc teve que ser realizada sob condições ácidas moderadas para evitar adição eletrofílica no andaime de esqualeno. O produto final foi purificado por HPLC de fase reversa para produzir o bloco de construção NA com bom rendimento.

Síntese de blocos de construção 5-ALA-SQ. 5-ALA-SQ foi sintetizado em quatro etapas sintéticas usando síntese convergente de 5-ALA e SQ

Nanomontagens 5-ALA-SQ

A fim de alcançar uma entrega eficiente de um composto ativo por nanopartículas (NPs) ao seu local de ação, parâmetros como tamanho, forma e carga superficial das nanopartículas desempenham um papel importante e governam a farmacocinética dos sistemas de nano-entrega no corpo [ 50]. Em particular, o tamanho da partícula governa vários fenômenos farmacocinéticos, como meia-vida NP na circulação sistêmica, sequestro por macrófagos e o extravasamento através de vasculatura com vazamento para o local de ação [51]. A forma e o tamanho das nanopartículas regulam sua capacidade de extravasar através das fenestrações encontradas na vasculatura [50, 51]. O tamanho e a forma também são muito importantes para o direcionamento ativo e absorção nas células, uma vez que NP e formas esféricas menores têm uma área de superfície menor, portanto, pontos de contato muito limitados em comparação com sistemas nanoparticulados não esféricos maiores [51].

A automontagem do bloco de construção 5-ALA-SQ ocorreu espontaneamente em meio aquoso. Os NAs foram formados por nanoprecipitação. O conjugado 5-ALA-SQ foi dissolvido em solventes orgânicos e foi adicionado gota a gota em água. A evaporação total dos solventes orgânicos rendeu uma solução aquosa de NAs. Os NAs 5-ALA-SQ foram monodispersos com baixo índice de polidispersidade de 0,12. As medições de mobilidade eletroforética deram potencial ζ de 36 mV, e o espalhamento dinâmico de luz (DLS) revelou distribuição monodispersa de NAs com um tamanho médio de 70 nm (Fig. 3). A faixa de tamanho de NA oferece bom potencial para circulação prolongada na corrente sanguínea [50]. No entanto, os NAs 5-ALA-SQ são significativamente menores do que os compósitos SQ relatados anteriormente, que variam entre 100 e 300 nm, indicando um arranjo supramolecular diferente [19].

Caracterização de NAs 5-ALA-SQ. Baixo ( a ) e alto ( b ) imagens crio-TEM de ampliação, análise DLS ( c ), e estabilidade a 4 ° C ( d )

O tamanho menor pode ser devido a grupos amino carregados positivamente e molécula de 5-ALA relativamente pequena em comparação com a porção SQ. Foi demonstrado que a variação de pequenas moléculas anexadas ao esqualeno introduz mudanças na automontagem e no empacotamento de conjugados composto-esqualeno, conseqüentemente alterando a forma e o tamanho dos NAs [16]. É possível que o grupo amino altamente carregado positivamente do 5-ALA se oriente em direção à água bruta enquanto as cadeias lipofílicas ocupam o interior desses NAs; no entanto, a estrutura supramolecular exata ainda precisa ser elucidada. Apesar do tamanho significativamente menor em comparação com outros nanocompósitos de esqualeno, os NAs exibem excelente estabilidade de prateleira com tamanho e PDI permanecendo constantes por várias semanas.

Outro aspecto importante dos novos 5-ALA-SQ NAs é que eles alcançam uma carga de droga de 26%, que é alta em comparação com outros sistemas nanoparticulados de 5-ALA relatados, onde a carga foi muito menos eficiente [37, 38, 41]. A carga de drogas é muito importante na entrega de NP porque em NPs carregados de droga pobres, a dose administrada pode não ser suficiente para atingir a concentração farmacologicamente ativa nos tecidos-alvo [4]. A carga pode ser determinada por cálculo simples, levando em consideração os pesos moleculares de 5-ALA e 5-ALA-SQ, uma vez que 5-ALA está covalentemente ligado ao esqueleto de esqualeno na razão molar de 1:1.

Medições cinéticas de fluorescência PpIX em células cancerosas

A formação de PpIX dependente do tempo foi avaliada em células de câncer de próstata humano PC3 e glioblastoma U87MG incubado com 5-ALA-SQ NAs e 5-ALA-Hex como referência. A Figura 4 apresenta a formação de PpIX em células de câncer de próstata humano PC3 expostas a concentrações crescentes de 5-ALA-SQ NAs ou 5-ALA-Hex ao longo de 24 h.

Medições cinéticas de fluorescência da acumulação de PpIX em células PC3. As células foram incubadas com concentrações crescentes de 5-ALA-SQ NAs ( a ) ou 5-ALA-Hex ( b )

Perfis de fluorescência de PpIX dependentes de concentração foram observados para 5-ALA-SQ NAs. A 1,0 e 2,0 mM, a fluorescência de PpIX aumentou de forma constante ao longo de 24 h, enquanto atingia um patamar após 8 h de incubação para concentrações mais baixas. Por outro lado, 5-ALA-Hex induziu o maior acúmulo de PpIX na faixa de concentração mais baixa entre 0,10 e 0,30 mM, conforme relatado anteriormente [35, 52]. No entanto, o 5-ALA-Hex em concentrações acima de 1 mM foi considerado tóxico para as células, o que reduz a fluorescência geral observada e impede o seu uso [36].

Em seguida, o acúmulo de PpIX dependente da dose em células cancerosas de glioblastoma humano PC3 e U87MG foi realizado com o objetivo de estimar a dosagem ideal de NA. A intensidade da fluorescência às 4 e 24 horas de incubação com 5-ALA-SQ NAs e 5-ALA-Hex é mostrada na Fig. 5. Muito importante, 5-ALA-SQ NAs induziu a produção de PpIX em ambas as linhas celulares. Além disso, os níveis máximos de fluorescência são comparáveis ​​ao controle ALA-Hex em ambas as linhas celulares. Também pode ser observado que em células PC3, as concentrações de 1,0 e 2,0 mM de 5-ALA-SQ NAs foram ideais para induzir o maior acúmulo de PpIX. Em células U87MG, não houve diferenças significativas entre as diferentes concentrações de 5-ALA-SQ NAs para curtos tempos de incubação (Fig. 5c). Às 24 h, a acumulação de PpIX foi considerada dependente da concentração de 5-ALA-SQ NAs ou 5-ALA-Hex semelhante às células PC3. Uma diminuição na indução de PpIX um tanto semelhante a ALA-Hex foi encontrada após um período mais longo de incubação em concentrações mais elevadas de NAs 5-ALA-SQ que eram mais sensíveis à presença de NAs.

Curvas de dose-resposta. Acumulação de PpIX dependente da concentração com 5-ALA-SQ NAs (azul) e 5-ALA-Hex (vermelho) em PC3 ( a , b ) e U87MG ( c , d ) células após 4 h (esquerda) e 24 h (direita) de incubação

A Figura 5 demonstra que às 24 h, as curvas de produção de PpIX são em forma de sino em ambas as células PC3 e U87MG. Enquanto a concentração de 1 mM de 5-ALA-SQ NAs induziu o maior acúmulo de PpIX em células PC3, as células U87MG toleraram concentrações mais altas e o aumento na fluorescência de PpIX foi observado até 2 mM de 5-ALA-SQ NAs. Em geral, concentrações mais elevadas de 5-ALA-SQ NAs foram necessárias para induzir de forma eficiente a biossíntese de PpIX quando comparada a 5-ALA-Hex, presumivelmente devido às diferentes taxas de clivagem de ligação de éster dentro das células cancerosas. A diminuição na produção de PpIX foi observada quando as concentrações superiores a 1 mM de 5-ALA-Hex foram usadas devido à toxicidade não específica de 5-ALA-Hex. Este efeito foi muito menos pronunciado para o 5-ALA-SQ onde a fluorescência os níveis começaram a cair apenas na concentração testada mais alta (3,3 mM) e tempos de incubação prolongados (Fig. 5b, d). No entanto, os níveis de fluorescência foram semelhantes para ambos os compostos, sem qualquer atraso de fluorescência observado para os NAs.

Os NAs também foram avaliados no glioblastoma U87MG contra o controle de 5-ALA, que é comercializado para DP de glioblastoma durante a ressecção cirúrgica. A Figura 6 apresenta a fluorescência da célula U87MG após 4 e 24 h. Os NAs 5-ALA-SQ induziram fluorescência significativamente maior após 4 h em comparação com o 5-ALA, que é altamente relevante em um ambiente clínico. Às 24 h, o perfil de fluorescência muda em favor de 5-ALA em concentrações mais baixas, uma vez que a absorção lenta e ativa de 5-ALA fornece quantidades suficientes de 5-ALA dentro das células. NAs ainda demonstram níveis de fluorescência semelhantes a 5-ALA em concentrações ótimas de 1,0 e 2,0 mM de NAs (Fig. 6b).

Curvas de dose-resposta. Acúmulo de PpIX dependente da concentração em células U87MG após 4 h ( a ) e 24 h ( b ) incubação com 5-ALA-SQ NAs (azul) e 5-ALA (verde)

Na prática clínica, o 5-ALA é administrado topicamente ou oralmente, mas devido à sua natureza carregada, apenas uma pequena porção da dose inicial entra nas células alvo por meio de transportadores de peptídeos endógenos como PEPT1, PEPT2 ou transportadores BETA, dependendo do tipo de célula [40, 53]. Estudos recentes sobre NAs de um derivado SQgem indicam que a entrada na célula é governada pela difusão intensificada pela albumina de blocos de construção de molécula única e descobriu-se que é altamente dependente da presença de proteínas extracelulares [54, 55]. Além disso, os NAs fluorescentes vermelhos distantes que relatamos recentemente também demonstraram rápida internalização, e os experimentos de cinética de fluorescência 5-ALA-SQ e as curvas de dose-resposta corroboram a internalização de bloco de construção de molécula única e o metabolismo subsequente eficiente para produzir PpIX fluorescente.

Conclusões

Neste estudo de prova de conceito in vitro, uma estratégia química convergente foi usada para sintetizar o bloco de construção 5-ALA-SQ do esqualeno e 5-ALA. Os NAs 5-ALA-SQ foram preparados por nanoprecipitação espontânea em água. Os NAs eram monodispersos e estáveis ​​com tamanho médio de 70 nm, índice de polidispersidade de 0,12, potencial ζ positivo de 36 mV e alto, carregamento de 5-ALA de 26%. A produção de PpIX foi avaliada in vitro em duas linhas de células cancerosas medindo o aumento da fluorescência ao longo do tempo e comparada com 5-ALA e 5-ALA-Hex. Os resultados mostraram que os NAs SQ-ALA são muito eficientes na indução da produção de PpIX nos tipos de células cancerígenas PC3 e U87MG. Eles superam o 5-ALA-Hex na indução de fluorescência em concentrações mais altas em tempos de incubação de 4 e 24 h in vitro; no entanto, em comparação com 5-ALA, eles mostram indução de fluorescência superior em tempos de incubação mais curtos. No escopo dessas descobertas, podemos concluir que os NAs 5-ALA-SQ apresentam uma solução nanotecnológica atraente para superar as desvantagens farmacocinéticas do 5-ALA. Além disso, os experimentos in vivo avaliarão seu potencial para a entrega sistêmica de 5-ALA para a terapia de PDT e PDT de fluorescência de tumores.

Métodos / Experimental

Os reagentes foram adquiridos de fornecedores comerciais Sigma-Aldrich (Bucks, Suíça) e Acros Organics (Basel, Suíça) e usados ​​sem purificação adicional. Os solventes NMR deuterados foram obtidos de Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, EUA). Tetrahidrofurano (THF) e diclorometano (CH ₂ Cl ₂ ) foram obtidos a partir de um sistema de secagem baseado em coluna de alumina da Anhydrous Engineering. Todos os outros solventes usados ​​eram de qualidade para HPLC. N, N-dimetilformamida (DMF), metanol (CH ₃ OH), éter dietílico (Et ₂ O) e acetona foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Buchs, Suíça). O acetato de etilo (AcOEt) foi adquirido na Biosolve (Dieuze, França); acetonitrila (CH ₃ CN) foi fornecido por Carlo Erba Reagents (Balerna, Suíça). Hexano ≥ 95% de n-hexano foi adquirido na Fisher Chemical (Basel, Suíça). A água usada para as preparações foi desionizada por um sistema de água de laboratório Milli-Q (Millipore, Molsheim, França). As reações químicas foram realizadas usando septos de seringa padrão com pressão positiva de argônio para garantir condições anidras.

A cromatografia em camada fina (TLC) foi realizada com placas de sílica com revestimento de alumínio (Merck-Keiselgel 60 F254) com uma fase móvel adequada e foi visualizada usando uma lâmpada de fluorescência UV (254 e 366 nm) e / ou desenvolvida com ninidrina, 20% sulfúrico ácido, ou ácido fosfomolíbdico (PMA). A cromatografia flash foi realizada em uma máquina PuriFlash® 4100 automatizada da Interchim (Montlucon, França) usando colunas de sílica Interchim puriFlash® HP 30 μm equipada com um detector de PDA (200-800 nm) e coletor de frações automatizado. O perfil de eluição foi monitorado usando o software Flash Interchim versão 5.0x. A coluna de HPLC semi-preparativa foi conduzida em uma coluna Waters Symmetry 300TM - 5 μm (19 × 150 mm), C8 (Baden-Dättwil, Suíça). UPLC analítico foi conduzido usando coluna Macherey-Nagel EC50 / 2 Nucleodur Gravity 1.8 μm (50 × 2,1 mm) ajustada em um sistema de água equipado com um detector Waters PDA (Baden-Dättwil, Suíça). Buffer A =CH ₃ CN + ácido fórmico 0,1%) e tampão B =H ₂ O + 0,1% de ácido fórmico. Taxa de fluxo =400,0 μL / min a 25 ° C. ¹ H e ¹³ Os espectros de RMN C foram registrados em espectrômetros Varian Gemini 300 MHz, Varian Innova 500 MHz ou Bruker Avance III Cryo 600 MHz a 298 K. Os desvios químicos (δ) são cotados em partes por milhão (ppm) e as constantes de acoplamento (J) estão em hertz (Hz). s para singuleto, d para dupleto, dd para dupleto de dupletos, t para tripleto, q para quarteto e m para multipleto. Os picos de solvente residual foram usados ​​como referência interna para as mudanças químicas do próton e do carbono. Os espectros de NMR foram processados ​​com o pacote de software Mnova versão 10.0.2. A espectrometria de massa de baixa resolução (LRMS) foi realizada em um instrumento HTS PAL-LC10A - API 150Ex em ESI (modo positivo). A espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) foi realizada em um instrumento QSTAR Pulsar (AB / MDS Sciex) em ESI (modo positivo). As estruturas químicas foram desenhadas e nomeadas de acordo com a nomenclatura IUPAC usando o pacote de software ChemBioDraw Ultra versão 14.0.0.117. O pH foi medido em um medidor de pH Metrohm 691 usando um eletrodo ponta de lança (Zofingue, Suíça), calibrado com tampões Metrohm. As análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism 6, 2016, (GraphPad Software). P valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Síntese do Bloco de Construção SQ-ALA

Ácido 5- (tert-butoxicarbonilamino) -4-oxopentanóico (2)

O Boc-5-ALA foi sintetizado de acordo com o procedimento publicado. Os dados espectroscópicos são idênticos aos da literatura [56]. ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12,12 (s, 1H), 7,06 (t, J =5,9 Hz, 1H), 3,76 (d, J =5,9 Hz, 2H), 2,61 (t, J =6,6 Hz , 2H), 2,40 (t, J =6,5 Hz, 2H), 1,38 (s, 9H). ¹³ C NMR (151 MHz, DMSO) δ 206,62, 174,07, 156,21, 78,54, 49,97, 40,38, 40,24, 40,11, 39,97, 39,83, 39,69, 39,55, 34,22, 28,64. [M + H] ⁺ 232,1, encontrado 232,7.

(4E, 8E, 12E, 16E) -4,8,13,17,21-pentametildocosa-4,8 , 12,16,20-pentaen-1-ol (3)

Álcool de esqualeno 3 foi sintetizado a partir do esqualeno em quatro etapas sintéticas com 23,7% de rendimento como óleo incolor de acordo com os procedimentos relatados [49]. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl ₃ ) δ 5,17-5,06 (m, 5H, CH), 3,62 (q, J =6,3 Hz, 2H, CH ₂ -OH), 2,17 - 1,92 (m, 18H, CH ₂ ), 1,67 (s, 3H, CH ₃ ), 1,59 (m, 17 H, CH ₃ e CH ₂ ) ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl ₃ ) δ 135,35, 135,17, 135,14, 134,81, 131,49, 125,05, 124,64, 124,60, 124,47, 63,07, 39,98, 39,95, 39,89, 36,24, 30,92, 28,48, 26,98, 26,88, 26,78, 25,94, 17,92, 16,28, 16,23, 16,08. LRMS (ESI):m / z calculado para [M + NH ₄ ] ⁺ 404,4, encontrado 404,8.

(4E, 8E, 12E, 16E) -4,8,13,17,21-pentametildocosa-4,8 , 12,16,20-pentaen-1-il 5 - ((terc-butoxicarbonil) amino) -4-oxopentanoato (4)

Álcool esqualeno ( 3 ) (100 mg, 0,26 mmol), EDC (74 mg, 0,38 mmol) e DMAP (94 mg, 0,78 mmol) e ácido 5- (terc-butoxicarbonilamino) -4-oxopentanóico (2) (77 mg, 0,34 mmol) foram dissolvidos em DCM (15 mL). Após agitação durante a noite à temperatura ambiente, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o produto em bruto purificado por cromatografia Flash usando gradiente de DCM / acetato de etila (EA) dando um óleo incolor (108 mg, 0,18 mmol, 70%). ¹ H NMR (300 MHz, CDCl ₃ ) δ 5,31 - 5,20 (br s, 1H), 5,13 - 5,07 (m, 5H), 4,09 - 3,95 (m, 4H), 2,75 - 2,53 (m, 4H), 2,02 - 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63-1,50 (m, 19H), 1,41 (s, 9H). ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 204,46, 172,65, 135,30, 135,16, 135,09, 133,75, 131,43, 125,34, 124,60, 124,57, 124,48, 124,45, 64,81, 50,53, 39,96, 39,93, 39,87, 35,92, 34,56, 28,52, 35,92, 34,56, 28,52, 28,47 , 28,43, 28,24, 28,02, 26,97, 26,86, 25,92, 23,11, 17,90, 16,25, 16,21, 16,06. LRMS (ESI):m / z calculado para [M + NH ₄ ] ⁺ 617,5, encontrado 617,8.

Sal do ácido trifluoroacético de 5-amino - (((4E, 8E, 12E, 16E) -4,8,13 , 17,21-pentametildocosa-4,8,12,16,20-pentaen-1-il) oxi) -4-oxopentanoato (5)

Composto 4 (34 mg, 57 mmol) foi dissolvido em DCM (2,0 mL). Ácido trifluoroacético (TFA) (200 μL) foi adicionado e a mistura de reação agitada à temperatura ambiente. Após 10 min, os solventes foram evaporados in vacuo a baixa temperatura e os vestígios de TFA foram removidos por co-evaporação com EA (3 × 10 mL). O produto em bruto foi purificado por RP-HPLC usando H ₂ completo Gradiente de O / AcN (0,025% TFA) produzindo óleo incolor (25 mg, 74%). %). ¹ H NMR (300 MHz, CDCl ₃ ) δ 5,31 - 5,20 (br s, 1H), 5,13 - 5,07 (m, 5H), 4,09 - 3,95 (m, 4H), 2,75 - 2,53 (m, 4H), 2,02 - 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63-1,50 (m, 19H). LRMS (ESI):m / z calculado para [M + H] ⁺ 500,4, encontrado 500,6.

Preparação de nanoconjuntos

NAs foram preparados por nanoprecipitação descrita em detalhes em outro lugar [20]. Resumidamente, bloco de construção 5 (1,2 mg, 2,0 μmol) foi dissolvido em um 50/50 V / V mistura de acetona / etanol (500 μL). A fase orgânica foi então adicionada gota a gota usando uma micro-seringa em água MilliQ (1,25 mL) a 100 μL / min sob agitação magnética. Após 5 min sob agitação, a barra de agitação magnética foi removida e os solventes orgânicos e o excesso de água removidos usando um evaporador rotativo a 30 ° C. A concentração final dos nanoconjuntos foi de 2,00 mM.

Caracterização de NAs 5-ALA-SQ

O carregamento de 5-ALA de 5-ALA.SQ NA foi calculado a partir das respectivas contribuições dos pesos moleculares de 5-ALA e do conjugado 5-ALA-SQ como segue [19]:
$$ \ mathrm {Carregando} \ \ left (\% \ right) =\ frac {\ mathrm {MW} \ \ left (5- \ mathrm {ALA} \ right)} {\ mathrm {MW} \ left (5 - \ mathrm {ALA} - \ mathrm {SQ} \ right)} \ times 100 $$
O diâmetro hidrodinâmico dos NAs foi medido por espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando um instrumento NANO ZS de Malvern (Worcestershire, UK) executando o software ZetaSizer 7.01. As análises foram realizadas com laser He-Ne 4 mW (633 nm) em ângulo de espalhamento de 173 ° a 25 ° C em microcubeta de poliestireno (PS) da Brand (Wertheim, Alemanha). O potencial zeta (ZP) foi determinado usando o mesmo instrumento Nano ZS de Malvern em células capilares dobradas DTS 1070 de Malvern. A distribuição do tamanho e o diâmetro médio do tamanho foram calculados a partir dos dados. A estabilidade dos NAs armazenados a 4 ° C foi avaliada por DLS em pontos de tempo regulares durante um período de 1 mês.

A morfologia dos NAs foi avaliada por microscópio eletrônico de transmissão criogênica (cryo-TEM) usando TECNAI® G ² Microscópio Sphera (FEI, Thermo Fisher Scientific) equipado com câmera digital de alta resolução de 2.000 por 2.000 pixels TCL (Gräfelfing, Alemanha). As amostras de gelo vitrificado foram preparadas usando o crio-êmbolo Virtobot (FEI, Thermo Fisher Scientific). Os NAs (2,0 μL, 2,0 mM) foram aplicados às grades R3.5 / 1 do Quantifoil Cu / Rh 200 mesh (SPI, West Chester, EUA) e vitrificados com etano líquido.

Cultura de células

Células de câncer de próstata humano PC3 (ATTC® CRL-1435 ™) e células de glioblastoma humano U87MG (ATTC® HTB-14 ™) foram cultivadas e mantidas por passagem em série em mistura de nutrientes F-12K (21127-022, Thermo Fisher Scientific) ou no mínimo Essential Media (31095-029, Thermo Fisher Scientific), respectivamente. Os meios celulares foram suplementados com soro fetal de bezerro (10%, CVFSVF00-01, Eurobio), estreptomicina (100 μL / mL) e penicilina (100 IU / mL, 15140-122, Thermo Fisher Scientific). As células foram cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera umidificada contendo 95% de ar e 5% de CO _2.

Medições cinéticas de fluorescência PpIX in vitro

Células de câncer de próstata humano PC3 (12.000 células / poço) e células de glioblastoma U87MG (10.000 células / poço) foram semeadas em placas de 96 poços (placa preta de fundo transparente, 3603, Corning). No dia seguinte, as células foram expostas a concentrações crescentes de 5-ALA-SQ NAs, 5-ALA-Hex e 5-ALA em meio sem soro. A fluorescência de PpIX foi registrada com um leitor de placas (Safire, Tecan, Suíça) em diferentes pontos de tempo. O comprimento de onda de excitação foi ajustado para 405 nm e o comprimento de onda de emissão para 630 nm. Valores médios e d.d. para cada concentração em cada ponto de tempo por placa foram subtraídos com o valor de referência (sem tratamento) e plotados para cada linha celular.

Estudo do Efeito da Direção de Impacto no Processo de Corte Nanométrico Abrasivo com Dinâmica Molecular Perovskita híbrida cultivada a vapor sequencialmente para células solares de heterojunção planar