Vesículas Etossomais Biocompatíveis Carregadas com Ácido 5-Aminolevulínico/Nanopartículas de Ouro: Estratégia Transdérmica Sinérgica Fotodinâmica/Fototérmica para Tratamento de Cicatrizes Hipertróficas

Resumo

Relatamos vesícula etossomal biocompatível (A/A-ES) co-carregada com ácido 5-aminolevulínico (ALA) e nanopartículas de ouro (AuNPs) preparada por ultrassonicação sem reagentes tóxicos. A/A-ES exibe banda de absorção plasmonica pronunciada a 600–650 nm, permitindo ativação simultânea fotodinâmica (PDT) e fototérmica (PTT) usando laser 632 nm. Estudos transdérmicos in vitro confirmam que A/A-ES entrega tanto ALA quanto AuNPs eficientemente em tecido de cicatriz hipertrófica (HS), alcançando 48% retenção de ALA após 2 h. Ensaios celulares com fibroblastos de cicatriz hipertrófica (HSF) demonstram que A/A-ES eleva marcadamente produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e geração de calor, levando a apoptose e necrose aumentadas comparado a PDT ou PTT isoladas. Estes resultados destacam A/A-ES como plataforma tópica promissora para PDT/PTT sinérgica de HS.

Introdução

Cicatrizes hipertróficas (HS) surgem de deposição excessiva de colágeno dérmico e são caracterizadas por pele espessada e fibrótica que pode prejudicar função e estética. Tratamentos convencionais—incluindo injeções intralesionais, roupas de pressão e terapia a laser—frequentemente sofrem de eficácia limitada, desconforto ou efeitos adversos como hipopigmentação e atrofia tecidual. Terapia fotodinâmica (PDT) usando ácido 5-aminolevulínico (ALA) oferece citotoxicidade seletiva via geração de ROS, ainda sua utilidade clínica é prejudicada por pobre penetração cutânea e baixo rendimento de ROS. Terapia fototérmica (PTT), particularmente com nanopartículas de ouro (AuNPs) que convertem luz em calor através de ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR), pode amplificar produção de ROS e ablar seletivamente tecido cicatricial, mas altas potências de laser arriscam dano à pele circundante.

Combinar PDT e PTT em única plataforma promete benefícios sinérgicos: geração de ROS mediada por ALA pode ser amplificada pelo calor de AuNPs, enquanto efeito fototérmico pode aumentar temperatura local, further aumentando rendimentos de ROS. Vesículas etossomais (ES) fornecem carreador deformável baseado em lipídeos que aumenta entrega transdérmica de fármacos hidrofílicos e lipofílicos. Trabalho prévio demonstrou que ES carregadas com ALA (ALA-ES) superaram significativamente soluções aquosas na entrega de ALA a tecido HS. No entanto, integrar AuNPs em ES mantendo biocompatibilidade e entrega eficiente permanece desafiador. Aqui, apresentamos síntese facilitada baseada em ultrassonicação de A/A-ES que simultaneamente encapsula ALA e AuNPs sem solventes tóxicos, alcançando alta captura de ALA (≈20%) e forte absorção 600–650 nm.

Resultados e Discussões

Caracterização de A/A-ES

Ultrassonicação serviu a dois propósitos: (1) gerou AuNPs in situ via redução mediada por radicais de AuCl₄⁻, eliminando agentes redutores tóxicos; (2) induziu reorganização de bicamada lipídica, produzindo vesículas pequenas, uniformemente dimensionadas com amplo núcleo interno para carregamento de fármaco. Espectroscopia UV-Vis confirmou pico de absorção forte a 600–650 nm (Fig. 1a), atribuível a acoplamento plasmonico entre AuNPs adjacentes. Espalhamento dinâmico de luz revelou distribuição de tamanho estreita centrada a 166 ± 83 nm (Fig. 1b), enquanto imagens SEM/TEM mostraram vesículas esféricas intactas (~200 nm) com AuNPs claramente visíveis incorporados na bicamada (Fig. 1c,d). Eficiência de captura (EE) de ALA atingiu 20%, superando valores reportados para formulações ES convencionais (<10%). Estas características sugerem A/A-ES bem adequado para atravessar matriz de colágeno densa de HS.

Estudo de Penetração Transdérmica In Vitro de A/A-ES

Usando células de difusão Franz, quantificamos retenção de ALA e AuNPs em tecido HS recém-excisado. Ambos agentes pico a 2 h, alcançando 48% da dose de ALA aplicada dentro do tecido (Fig. 2a). Declínio concorrente thereafter reflete permeação transdérmica completa. Imagens TEM (Fig. 2b-d) confirmaram vesículas intactas na derme, seguidas por liberação de AuNPs que agregaram in situ—favorável para geração de calor sob irradiação laser. Estes dados estabelecem A/A-ES como carreador efetivo para co-entrega de ALA e AuNPs em tecido HS.

PDT/PTT In Vitro de HSF

Ensaio de Biocompatibilidade

Ensaios de viabilidade celular revelaram nenhuma citotoxicidade significativa para A/A-ES em concentrações ≤2,0 mM, com sobrevivência >90% após 12 h (Fig. 3). Doses maiores causaram apenas reduções modestas, confirmando perfil de segurança da formulação e guiando concentração terapêutica a 2,0 mM (≈14% v/v) para experimentos subsequentes.

PDT/PTT para HSF

Microscopia confocal mostrou acúmulo robusto de protoporfirina IX (PpIX) em HSF tratados com ALA-ES e A/A-ES; Au-ES produziu PpIX negligenciável (Fig. 4). Sob irradiação laser 632 nm, fluorescência de PpIX diminuiu enquanto sinais de ROS intensificaram, especialmente em células tratadas com A/A-ES—evidência de geração de ROS aumentada via LSPR de AuNPs. Mudanças morfológicas, como blebbing de membrana, foram pronunciadas em células tratadas com A/A-ES, indicando morte celular. Termografia infravermelha confirmou que ALA-ES, Au-ES e A/A-ES elevaram temperatura local a 41,3 °C (Au-ES/A/A-ES) e 36,5 °C (ALA-ES) sob irradiação, com resfriamento rápido thereafter (Fig. 5). Estes achados ressaltam ações fotodinâmica e fototérmica duais de A/A-ES.

Ensaio de Apoptose e Necrose

Citometria de fluxo de células coradas com Annexin V/PI revelou que A/A-ES irradiado a laser induziu maior fração necrótica (61,8%) comparado com ALA-ES (47,7%) e Au-ES (24,3%) (Fig. 6). Apoptose precoce e tardia também foram elevadas em A/A-ES, refletindo efeito sinérgico de amplificação de ROS e estresse fototérmico. Estes resultados demonstram quantitativamente superioridade da abordagem combinada PDT/PTT sobre modalidades únicas.

Visualização de A/A-ES em HSF

Microscopia eletrônica de transmissão revelou extensa agregação de AuNPs dentro do citoplasma de HSF tratados com A/A-ES, consistente com fusão eficiente de vesículas e liberação de carga. Imagens pós-irradiação mostraram blebs de membrana característicos, mitocôndrias inchadas e membranas externas rompidas—marcos de morte celular (Fig. 7). Estas mudanças ultraestruturais confirmam que A/A-ES efetivamente entrega ALA e AuNPs a HSF, levando a morte celular sinérgica fotodinâmica e fototérmica.

Conclusões

Desenvolvemos vesícula etossomal biocompatível, sintetizada ultrassonicamente, carregada com 5-ALA/AuNP (A/A-ES) que demonstra forte absorção 600–650 nm, alta captura de ALA (~20%) e entrega transdérmica eficiente a tecido HS. Estudos in vitro confirmam que A/A-ES aumenta produção de ROS e aquecimento fototérmico, resultando em apoptose e necrose superiores de HSF comparado a PDT ou PTT isoladas. Estes achados suportam A/A-ES como plataforma tópica promissora para terapia fotodinâmica/fototérmica sinérgica de cicatrizes hipertróficas, justificando futura avaliação in vivo.

Experimentos e Métodos

Preparação de A/A-ES

Fosfatidilcolina (180 mg) foi dissolvida em 1,8 mL etanol, 0,6 mL 10 mM HAuCl₄, e 3,6 mL tampão citrato ALA 0,01 M (pH 4,0, 12 mg ALA). Mistura foi agitada a 700 rpm por 10 min, então sonicada a 200 W por 30 min até cor vinho-avermelhado aparecer. Centrifugação (8000 rpm, 20 min) removeu reagentes não reagidos, e pelota foi redispersa em 3 mL solução hidroalcoólica ALA 2 mg/mL. Método de carregamento por gradiente de pH transmembrana foi aplicado para capturar ALA no núcleo da vesícula, resultando no A/A-ES final. Para comparação, ALA-ES e Au-ES foram preparados com concentrações idênticas de ALA ou AuNPs mas carecendo do outro componente.

Caracterização de A/A-ES

Coloração negativa com ácido fosfotúngstico 1,5% p/p seguida por TEM (JEOL, 120 kV) avaliou morfologia. SEM (JEOL, 10 kV) avaliou características de superfície. Distribuição de tamanho foi medida por DLS (Nicomp 380ZLS). Teor de ALA foi quantificado via derivação fluorescamina, e EE calculado por ultrafiltração. Espectros UV-Vis foram registrados em espectrofotômetro Varian Cary 50.

Estudo de Penetração In Vitro por Células Franz

Tecido HS (≤24 h pós-excisão) foi montado em célula Franz com estrato córneo voltado para compartimento doador. Um mililitro de A/A-ES foi aplicado, e receptor mantido a 37 °C. Após intervalos definidos, tecido foi lavado, homogeneizado, e ALA extraído por diálise por 24 h. Retenção de AuNPs foi quantificada por ICP-MS. Após 2 h exposição, tecidos foram processados para secionamento ultrafino e imagem TEM.

PDT/PTT In Vitro para HSF

Cultura Celular

HSF foram isolados de biópsias HS de pacientes usando digestão com colagenase I e cultivados em DMEM suplementado com 10% FBS a 37 °C, 5% CO₂. Células foram usadas em passagens 2–3.

Ensaio de Biocompatibilidade

HSF (2 × 10³ células/poço) foram expostos a diluições seriadas de ALA-ES, Au-ES, ou A/A-ES em meio livre de FBS por 12 h. Viabilidade celular foi avaliada com CCK-8.

Procedimento PDT/PTT

HSF (4 × 10⁴ células/poço) foram incubados com 14% v/v A/A-ES ou controles por 6 h, então lavados e irradiados com laser He-Ne 632 nm, 40 mW/cm² por 20 min. Pós-irradiação, células foram cultivadas em DMEM com 10% FBS por 24 h antes de ensaios subsequentes.

Ensaio de Geração Intracelular de PpIX e ROS

PpIX e ROS foram visualizados por CLSM (Leica TCS SP5). Coloração DCFH-DA quantificou ROS, enquanto fluorescência PpIX foi capturada a excitação 405 nm/emissão 635 nm.

Ensaio de Apoptose e Necrose

Dupla coloração Annexin V-FITC/PI seguida por citometria de fluxo BD FACSCalibur determinou taxas de apoptose e necrose. Dados foram analisados com FlowJo 7.6.

Análise Estatística

Dados apresentados como média ± DP. Teste t de Student determinou significância (P < 0,05).

Abreviações

A/A-ES:

Vesícula etossomal carregada com ácido 5-aminolevulínico/nanopartícula de ouro

ALA:

Ácido 5-aminolevulínico

ALA-ES:

ES carregada com ALA

ALA-PDT:

PDT baseada em ALA

Au-ES:

ES carregada com AuNP

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

CLSM:

Microscopia confocal de varredura a laser

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

DMEM:

Meio Modificado de Eagle de Dulbecco

EE:

Eficiência de captura

ES:

Vesículas etossomais

FBS:

Soro fetal bovino

HS:

Cicatriz hipertrófica

HSF:

Fibroblastos de cicatriz hipertrófica

ICP-MS:

Espectrometria de massa por plasma acoplado indutivamente

LSPR:

Ressonância de plasmon de superfície localizada

PDT:

Terapia fotodinâmica

PDT/PTT:

Terapia fotodinâmica/fototérmica

PpIX:

Protoporfirina IX

PTT:

Terapia fototérmica

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

TEM:

Microscópio eletrônico de transmissão