Biocompatível de ácido 5-aminolevulínico / vesículas etossômicas carregadas com nanopartículas de Au para terapia fotodinâmica / fototérmica sinérgica transdérmica in vitro de cicatrizes hipertróficas

Resumo

Biocompatível ácido 5-aminolevulínico / vesícula etossômica carregada com nanopartículas de Au (A / A-ES) é preparada por meio de ultrassom para terapia fotodinâmica / fototérmica transdérmica sinérgica (PDT / PTT) de cicatriz hipertrófica (HS). Utilizando ultrasonicação, nanopartículas de Au (AuNPs) são sintetizadas e carregadas simultaneamente em vesículas etossômicas (ES) sem quaisquer agentes tóxicos, e o ácido 5-aminolevulínico (ALA) também é carregado em ES com 20% da eficiência de aprisionamento (EE). O A / A-ES preparado exibe forte absorvância em 600-650 nm devido ao efeito de acoplamento plasmônico entre AuNPs vizinhos no mesmo A / A-ES, que pode estimular simultaneamente A / A-ES para produzir calor e aumentar os rendimentos quânticos de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando laser de 632 nm. O estudo de penetrabilidade transdérmica in vitro demonstra que A / A-ES atua como um transportador de droga altamente eficiente para aumentar a penetração de ALA e AuNPs no tecido de HS . Tomando fibroblastos de cicatriz hipertrófica humana (HSF) como alvos terapêuticos, PDT / PTT sinérgico de HS indica que A / A-ES poderia aumentar os rendimentos quânticos de ROS por efeito fototérmico e ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR) de AuNPs, resultando em um alto nível de apoptose ou necrose. Em uma palavra, o A / A-ES preparado mostra uma melhor eficiência sinérgica de PDT / PTT para HSF do que o PDT e PTT individuais, encorajando a perspectiva para o tratamento de HS.

Histórico

A cicatriz hipertrófica (SH), um problema comum e inevitável após lesão cutânea cutânea, tem derme fibrótica muito mais espessa do que a pele normal [1, 2]. Histopatologicamente, a HS apresenta aumento de fibroblastos de cicatriz hipertrófica (FCH), que se organizam em padrões ondulados, orientados para a superfície epitelial e formam estruturas nodulares [3]. Embora vários tratamentos estejam disponíveis clinicamente, há muitos desafios nos tratamentos de HS devido às inúmeras limitações. A terapia com injeção intralesional é amplamente utilizada na prática clínica. No entanto, é limitado por operações desconfortáveis e efeitos colaterais, como hipopigmentação permanente e atrofia da pele [4]. A terapia com pressão é limitada para efeitos colaterais, como isquemia do tecido, bem como diminuição do metabolismo do tecido [5]. Para superar essas limitações, a laserterapia atua como uma modalidade tópica e não invasiva que vem sendo desenvolvida e aplicada nos tratamentos de HS há mais de 25 anos, aproveitando as vantagens da irradiação laser [6]. Geralmente, a terapia a laser pode ser dividida em terapia fotodinâmica (TFD) e terapia fototérmica (PTT) com base em diferentes princípios.

PDT tem sido usado para tratar HS com as vantagens de sua alta seletividade e poucos efeitos colaterais [7]. Seu princípio evolui em duas etapas:(a) os fotossensibilizadores se agregam preferencialmente em HSF e (b) sob a irradiação de um laser apropriado, os fotossensibilizadores produzem espécies reativas de oxigênio citotóxico (ROS) que levam à apoptose de HSF [8, 9]. Entre vários fotossensibilizadores, o ácido 5-aminolevulínico (ALA) é comprovadamente um excelente candidato para a modalidade de tratamento local em dermatologia sem efeitos colaterais significativos. Portanto, a PDT baseada em ALA (ALA-PDT) tem sido amplamente utilizada no tratamento de HS com permissão de comercialização da Food and Drug Administration em 2010 [10]. No entanto, sua eficiência é controversa por duas limitações:(a) a baixa penetrabilidade do ALA em ambos os tecidos HS e HSF e (b) o baixo rendimento quântico de ROS. Para produzir um efeito marcante, um ALA de alta dose ou laser de alto nível é aplicado na clínica. Infelizmente, altas doses de ALA causam danos à glândula sebácea e à epiderme, e o laser de alta intensidade tende a causar lesões em tecidos saudáveis. Portanto, muita atenção tem sido dada para aumentar a penetrabilidade de ALA e os rendimentos quânticos de ROS no tratamento PDT de HS. Recentemente, vesículas etossômicas (ES), um lipossoma projetado especificamente, são capazes de superar a barreira em HS para aplicação tópica e alcançar um progresso significativo [11, 12]. Em nosso trabalho anterior, o ES carregado com ALA (ALA-ES) preparado é capaz de entregar muito mais ALA em HS em comparação com o sistema de solução hidroalcoólica tradicional [13]. Portanto, o ES pode aumentar a penetrabilidade do ALA para melhorar a eficácia do PDT do HS. Enquanto isso, uma nova modalidade de tratamento sinérgico, que combina PDT com PTT, mantém a promessa de aumentar os rendimentos quânticos de ROS e a eficácia do tratamento de HS.

PTT também é uma abordagem teranóstica extraordinária para várias doenças [14, 15]. Até agora, tem sido aplicado com sucesso no tratamento clínico da HS [16]. Seu mecanismo evolui captando energia luminosa, gerando calor e resultando na vaporização do tecido, coagulação, apoptose de HSF e desnaturação do colágeno. No entanto, o PTT tem efeitos colaterais graves no tratamento de HS, como exsudação, ulceração e desconforto em queimação, devido à sua baixa seletividade para o tecido de HS com laser de alto nível [4]. Recentemente, o PTT, bridging nanotechnology, tem sido considerado um potencial tratamento de HS altamente seletivo e minimamente invasivo para o efeito fototérmico. E mais importante, com base em nanopartículas de Au (AuNPs) como agentes fotoadsorventes eficazes, PTT foi confirmado para aumentar os rendimentos quânticos de ROS por duas razões:(a) PDT térmico aumenta significativamente a morte celular apoptótica através do aumento da geração de ROS em uma temperatura -dependente, e [17] (b) AuNPs podem se conjugar com ALA e aumentar os rendimentos quânticos de ROS devido à ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR) [18, 19]. Portanto, a terapia fotodinâmica / fototérmica sinérgica baseada em ALA / AuNP (PDT / PTT) mantém a promessa de superar as limitações atuais de PDT e PTT no tratamento de HS.

Recentemente, a PDT / PTT sinérgica baseada em AuNP tem sido amplamente utilizada em várias terapias contra o câncer por vias de injeção [20, 21]. Diferente dos cânceres, o HS é adequado para o uso de administração tópica [22]. No entanto, os feixes de colágeno na derme de HS apresentam grandes barreiras à penetração de ALA e AuNPs, o que restringe a eficiência do tratamento sinérgico do PDT / PTT para HS. Portanto, como fazer ALA e AuNPs penetrarem simultaneamente no HS é crítico para a PDT / PTT sinérgica com eficácia terapêutica máxima e efeito colateral mínimo [23, 24]. Além disso, um PDT / PTT sinérgico baseado em ALA / AuNP adequado também deve satisfazer as seguintes condições:(a) AuNPs podem gerar calor por laser He-Ne que é usado em ALA-PDT, e (b) o sistema de entrega deve ser alto Bio-compatível. No entanto, os vários fotossensibilizadores / AuNPs relatados não podem ser aplicados por uma entrega transdérmica tópica e tratamento com HS para penetrabilidade e baixa biocompatibilidade [25].

Aqui, ES (A / A-ES) carregado com ALA / AuNP com excelente biocompatibilidade e penetrabilidade é desenvolvido para PDT / PTT sinérgico de HS neste trabalho. O A / A-ES biocompatível é preparado por AuNPs e ES carregado com ALA por meio de um processo de ultrassom sem qualquer agente tóxico. O A / A-ES preparado mostra uma forte absorvância na faixa de 600-650 nm, como resultado do acoplamento plasmônico entre AuNPs vizinhos co-carregados em A / A-ES. Isso permite o uso do laser He-Ne para estimular A / A-ES para gerar simultaneamente calor e ROS, o que poderia promover a apoptose de HSF. A / A-ES exibe excelente penetrabilidade para fornecer simultaneamente ALA e AuNPs em HS no estudo in vitro. Por fim, tendo HSF como alvo, a eficiência in vitro de PDT / PTT para HS é investigada pelo acúmulo de protoporfirina IX intracelular (PpIX), rendimentos quânticos de ROS e apoptose de HSF. Além disso, a penetrabilidade em HSF também é observada por TEM. Devido ao efeito sinérgico, A / A-ES facilita tanto ALA quanto AuNPs para penetrar simultaneamente em HS e HSF, causando um nível mais alto de apoptose celular em comparação com PTT ou PDT individual. Em uma palavra, A / A-ES é um sistema de entrega transdérmica promissor para a administração tópica de ALA e AuNP, tem grande potencial em PDT / PTT sinérgico de HS e abre uma nova janela para o tratamento de HS.

Resultados e discussões

A caracterização de A / A-ES

A ultrassonicação foi o parâmetro-chave na preparação de A / A-ES por duas razões:(a) AuNPs poderiam ser formadas por ultrassom sem qualquer agente tóxico, o que dotou A / A-ES de biocompatibilidade; (b) a ultrassonicação poderia reorganizar as bicamadas lipídicas para formar mais vesículas com tamanhos pequenos e núcleos internos relativamente maiores, o que poderia carregar mais ALA e AuNPs. Neste trabalho, AuNPs foram formados conforme descrito nos seguintes esquemas:(a) radicais H • e OH • altamente reativos foram gerados dentro das bolhas pela homólise de H ₂ O (Eq. 1), (b) os radicais oxidantes H • poderiam abstrair o alfa H de CH ₃ CH ₂ OH e forma um radical redutor CH ₂ • CH ₂ OH (Eq. 2), e (c) durante uma pirólise dentro das bolhas, o radical CH ₂ • CH ₂ OH poderia reduzir Au ³⁺ para formar AuNPs (Eq. 3) [26].
$$ {\ mathrm {H}} _ 2 \ mathrm {O} \ to \ mathrm {H} \ bullet + \ mathrm {OH} \ bullet $$ (1) $$ \ mathrm {H} \ bullet + {\ mathrm {CH}} _ 3 {\ mathrm {CH}} _ 2 \ mathrm {OH} \ to {\ mathrm {CH}} _ 2 \ bullet {\ mathrm {CH}} _ 2 \ mathrm {OH} + {\ mathrm {H} } _2 $$ (2) $$ {\ mathrm {Au}} ^ {3 +} + {\ mathrm {CH}} _ 2 \ bullet {\ mathrm {CH}} _ 2 \ mathrm {O} \ mathrm {H} + \ mathrm {OH} \ bullet \ to \ mathrm {AuNPs} + {\ mathrm {CH}} _ 3 {\ mathrm {CH}} _ 2 \ mathrm {O} \ mathrm {H} + {\ mathrm {H}} _2 \ mathrm {O} $$ (3)
No início, A / A-ES foi verificado por UV-Vis (Fig. 1a). Ele tinha uma absorvância forte na faixa de 600-650 nm, como resultado do acoplamento plasmônico entre AuNPs vizinhos no mesmo A / A-ES [20]. Portanto, ele poderia usar irradiação de laser de 632 nm para PDT e PTT para HS simultaneamente. Além disso, A / A-ES exibiu uma distribuição de tamanho relativamente estreita e o tamanho médio foi de 166 ± 83 nm, de acordo com a análise DLS na Fig. 1b. Curiosamente, duas distribuições de tamanho foram atribuídas a AuNPs e A / A-ES descarregados. Além disso, a grande diferença entre as duas distribuições sugere que a quantidade de A / A-ES foi muito maior do que a de AuNPs descarregados. A eficiência do PDT dependia da quantidade de ALA carregado no A / A-ES. Beneficiando-se do método de carregamento ativo de gradiente de pH transmembrana, o EE do ALA foi de 20%, o que foi superior ao de trabalhos relatados (menos de 10%) [27]. A morfologia de A / A-ES também foi estudada. Em imagens SEM (Fig. 1c), A / A-ES apareceu como vesículas lamelares esféricas intactas com tamanho a 200 nm, e AuNPs puderam ser claramente observados e carregados em ES. Além dos AuNPs, as lamelas se estendem até a superfície do AuNP na Fig. 1d, que é a característica do ES [28, 29]. Além disso, o A / A-ES preparado carregando diferentes números de AuNPs tinha os tamanhos semelhantes no arquivo adicional 1:Figura S1. Portanto, A / A-ES foi ajustado na estrutura estável e deformável sob ultra-som, o que facilita A / A-ES para se espremer através do espaço estreito em HS. Para resumir, A / A-ES foi preparado com sucesso com 20% EE de ALA e forte absorbância em 600-650 nm. Sua morfologia também seria muito favorável à penetrabilidade, o que era consistente com o estudo PDT / PTT in vitro a seguir.

Estudo de penetrabilidade transdérmica in vitro de A / A-ES

A retenção de A / A-ES foi um parâmetro importante para avaliar a penetrabilidade e a eficiência do tratamento de A / A-ES. Portanto, a quantidade de retenção de ALA e AuNPs em HS com diferentes tempos foi investigada usando células de difusão de Franz. Conforme mostrado na Fig. 2a, tanto ALA quanto AuNPs atingiram rapidamente a retenção máxima nas primeiras 2 h, devido à função de aumento de penetração do ES. Após atingir o máximo, as retenções de ALA e AuNPs diminuíram continuamente porque A / A-ES penetrou em todo o HS. Os resultados indicaram que o A / A-ES tinha penetrabilidade suficiente. Em comparação com a dose aplicada de ALA (2 mg), 48% do ALA estava no tecido de HS, o que era a favor de PDT de HS. Além disso, as mesmas alterações de retenção entre ALA e AuNPs sugeriram que ALA e AuNPs foram carregados no ES de acordo com os resultados dos microscópios. De acordo com o resultado, 2 horas foi um tempo de administração adequado para uso tópico com a quantidade máxima de retenção de A / A-ES. Em nossos trabalhos anteriores, o ES foi considerado um carreador de drogas altamente eficiente para aumentar a penetração da droga no tecido de HS [13]. Portanto, a distribuição e ação de A / A-ES em HS também foi estudada usando TEM neste trabalho. Como mostrado na Fig. 2b, A / A-ES, como estrutura intacta, foi encontrado na derme, indicando que A / A-ES poderia penetrar de forma estável através da epiderme e na derme HS. Na derme inferior mostrada na Fig. 2c, o ES e AuNPs foram observados como um estado de separação, sugerindo que A / A-ES liberaria ALA e AuNPs. Curiosamente, AuNPs podem ser agregativos na derme, embora não tenham sido carregados no ES. Além disso, descobriu-se que mais AuNPs se acumulavam na derme na Fig. 2d, o que poderia fornecer o acoplamento plasmônico entre AuNPs vizinhos para coletar energia luminosa e gerar calor. Em resumo, o estudo de penetrabilidade transdérmica in vitro demonstrou que A / A-ES era um carreador de drogas altamente eficiente para aumentar a penetração de ALA e AuNP no tecido de HS, e os AuNPs agregativos na derme eram a favor da geração de calor [20]. Portanto, o A / A-ES apresentou um grande potencial em PDT / PTT sinérgico para HS.

PDT / PTT in vitro de HSF

Ensaio de biocompatibilidade

Embora a biocompatibilidade de AuNPs tenha sido bem comprovada em trabalhos relatados, a biocompatibilidade de A / A-ES para HSF também deve ser estudada neste trabalho [30, 31]. Diferentes concentrações de ALA-ES, Au-ES e A / A-ES (com base nas concentrações de ALA de 0,1 a 10 mM, Au-ES era a mesma concentração de AuNP que A / A-ES) foram incubadas com HSF por 12 h sem irradiação. O resultado mostrou que não houve citotoxicidade escura nas concentrações de não mais do que 2,0 mM com taxas de sobrevivência celular superiores a 90%. Quando as concentrações eram superiores a 2,0 mM, foi detectada uma ligeira diminuição nas taxas de sobrevivência celular. Os resultados mostraram que A / A-ES teve excelente biocompatibilidade, e o PDT / PTT deve ser realizado a uma concentração de 2,0 Mm nos estudos seguintes (ca. 14% A / A-ES em meios de cultura, v / v .) Fig. 3.

PDT / PTT para HSF

A / A-ES poderia superar as barreiras de permeabilidade da superfície pela fusão de A / A-ES com membrana HSF e então liberar o ALA e AuNPs diretamente no citoplasma da célula [32]. De acordo com o mecanismo de ALA-PDT, o ALA liberado de A / A-ES pode se converter em PpIX no citoplasma de HSF. Com o laser, a PpIX produziu ROS citotóxicas levando à apoptose celular. Portanto, CLSM foi usado para estudar o acúmulo de PpIX e ROS na Fig. 4 [33, 34]. Antes da irradiação do laser, a fluorescência vermelha de PpIX era principalmente distribuída no citoplasma de HSF. As PpIX em HSF tratadas com ALA-ES e A / A-ES foram muito mais do que as PpIX autólogas em HSF tratadas com Au-ES. Além disso, ROS em todos os HSF dificilmente foram encontrados sem irradiação de laser, o que também foi razoável. Após a irradiação do laser, as intensidades PpIX em HSF tratado com ALA-ES e A / A-ES foram reduzidas, e ROS nessas células podem ser facilmente encontrados com forte intensidade. Enquanto isso, o HSF tratado por Au-ES não teve resposta em PpIX e ROS porque eles não tinham PpIX autólogo suficiente. Curiosamente, A / A-ES poderia promover mais geração de ROS do que ALA-ES em uma comparação da intensidade de ROS, que foi atribuída aos AuNPs. Além disso, a morfologia celular também forneceu mais informações. O HSF tratado com ALA-ES apresentava eumorfismo, enquanto o HSF tratado com Au-ES apresentava protrusões prejudiciais à saúde da membrana plasmática. Em contraste, o HSF tratado por A / A-ES mostrou como "bolhas" salientes e retraídas, que era a característica das células mortas [35]. Essas diferenças na geração de ROS e morfologia celular foram atribuídas ao PTT com base em AuNPs, que também foi investigado por imagem infravermelha na Fig. 5. De acordo com o mecanismo de AuNPs-PTT, AuNPs no citoplasma de HSF poderiam absorver o laser de 632 nm e gerar calor suficiente para tornar as células apoptose ou necrose sob irradiação. Portanto, os efeitos fototérmicos de ALA-ES, Au-ES e A / A-ES foram monitorados usando uma câmera de imagem térmica infravermelha. Comparados ALA-ES, Au-ES e A / A-ES apresentaram temperatura obviamente mais alta (41,3 ° C para Au-ES e A / A-ES, 36,5 ° C para ALA-ES) após a irradiação. Depois que o laser foi removido, as temperaturas de todos caíram rapidamente para um valor normal em 1 minuto, sugerindo que o tratamento com irradiação a laser poderia ser seguro [36]. Portanto, AuNPs carregados em ES podem fornecer um PTT eficaz, que também é fornecido por ensaio de apoptose e necrose. Para resumir, A / A-ES poderia aumentar os rendimentos quânticos de ROS e fornecer o efeito fototérmico para atingir uma excelente eficiência de tratamento sinérgico PDT / PTT para HSF.

Ensaio de apoptose e necrose

A eficiência do PDT / PTT foi posteriormente estudada pela apoptose e necrose do HSF tratado com ALA-ES, Au-ES e A / A-ES sob irradiação a laser. Um ensaio de apoptose foi realizado usando a análise de citometria de fluxo de Anexina V-FITC e coloração dupla com iodeto de propídio (PI) (Fig. 6). Um resultado de controle mostrou que a irradiação a laser não afetou a viabilidade celular (Fig. 6a). Antes de irradiar, ALA-ES, Au-ES e A / A-ES apresentaram boa biocompatibilidade. Após a irradiação, o HSF tratado com ALA-ES, Au-ES e proporção A / A-ES de necrose e apoptose teve diferenças significativas. Resumidamente, houve uma fração mais elevada de necrose e apoptose de HSF tratada por A / A-ES, que foi consistente com o resultado de CLSM. Na Fig. 6e, a análise estatística dos experimentos revelou que a morte celular necrótica aumentou para 61,8% com o tratamento com A / A-ES, indicando que A / A-ES teve melhor eficiência de PDT / PTT sinérgica para HSF do que o PDT individual ( 47,7% morte celular necrótica) e PTT (24,3% morte celular necrótica). Curiosamente, o resultado também indicou que o PDT desempenhou um papel mais eficaz no tratamento de HS em comparação com o PTT, e o PTT baseado em AuNP poderia ajudar no efeito do PDT. Estes resultados podem ser explicados como que A / A-ES poderia aumentar os rendimentos quânticos de ROS e fornecer o efeito fototérmico para atingir uma excelente eficiência de tratamento sinérgico PDT / PTT para HSF. Embora EE de ALA em A / A-ES fosse muito menor do que em ALA-ES (20 vs. 54%), houve morte celular necrótica semelhante de A / A-ES e ALA-ES (61,8 vs. 78 %). Este resultado pode ser explicado pelo fato de que A / A-ES pode aumentar os rendimentos quânticos de ROS por efeito fototérmico e LSPR de AuNPs.

Visualização de A / A-ES em HSF

As mudanças de detalhes da morfologia e estrutura de HSF causadas por PDT / PTT também foram investigadas por microscopia de luz e TEM na Fig. 7. Antes de irradiar, HSF tratado com poço de crescimento A / A-ES, aderência firme de eumorfismo, indicando A / A- ES teve excelente biocompatibilidade como esperado (Fig. 7a). Em sua imagem TEM, além de várias organelas no citoplasma normal, o HSF tratado tinha uma grande quantidade de AuNP agregando no citoplasma da célula (os quadros em branco na Fig. 7c). Poderia ser explicado que a fusão de A / A-ES com membranas celulares poderia entregar mais AuNPs e ALA em HSF. Portanto, AuNPs poderia atuar como a fonte fototérmica mais eficaz devido ao efeito de acoplamento plasmônico mais forte e aumentar os rendimentos quânticos de ROS por LSPR. Curiosamente, mostrado no quadro tracejada na Fig. 7c, alguns AuNPs estavam fora de HSF devido à exocitose, o que demonstrou a excelente biocompatibilidade de A / A-ES mais uma vez. Após a irradiação, o HSF exibia a característica de células mortas, ou seja, as protrusões da membrana plasmática (Fig. 7b) [37]. Devido às ROS e ao efeito fototérmico, o inchaço das mitocôndrias e a ruptura da membrana externa, como outros indicadores de morte de HSF, foram encontrados no citoplasma de HSF (Fig. 7d) [35]. Além disso, o ES também foi encontrado com sua estrutura de membrana característica (quadros vermelhos na Fig. 7d). Para resumir, A / A-ES poderia facilitar ALA e AuNPs penetrando em HSF e destruir HSF por PDT / PTT sinérgico.

Conclusões

O A / A-ES biocompatível foi facilmente preparado para PDT / PTT sinérgico in vitro de HS permeando em HS e destruindo HSF. Utilizando ultrassom, AuNPs foram sintetizados e carregados simultaneamente na ausência de quaisquer agentes tóxicos. A / A-ES teve forte absorbância em 600-650 nm como o efeito de acoplamento plasmônico entre AuNPs vizinhas no ES com um alto EE para ALA (ca. 20%). O estudo de penetrabilidade transdérmica in vitro demonstrou que A / A-ES era um carreador de droga altamente eficiente para aumentar a penetração de ALA e AuNP no tecido de HS . PDT / PTT in vitro para HSF indicou que A / A-ES poderia aumentar os rendimentos quânticos de ROS por efeito fototérmico e LSPR de AuNPs, causando um alto nível de apoptose ou necrose celular. Em uma palavra, A / A-ES biocompatível teve uma melhor eficiência sinérgica de PDT / PTT para HSF do que a PDT e PTT individuais, encorajando a perspectiva para o tratamento de HS. O trabalho futuro se concentrará no estudo in vivo de PDT / PTT sinérgico para HS em modelos de cicatriz, e o trabalho relevante está em andamento.

Experimentos e métodos

A preparação de A / A-ES

Cento e oitenta miligramas de fosfatidilcolina (PC, 95,8% de lecitina de soja, Lipoid GmbH, Alemanha) dissolvidos em 1,8 mL de CH ₃ CH ₂ OH, 0,6 mL HAuCl ₄ (10 mM, Aladdin, Shanghai, China) e 3,6 mL de solução tampão de citrato de ALA (CBS, 0,01 M, 12 mg de ALA, pH 4,0), por sua vez, foram adicionados à solução de PC gota a gota. A mistura foi agitada a 700 rpm durante 10 min para preparar a solução precursora. Conforme mostrado no Esquema 1, a solução precursora foi colocada em um ambiente de ultrassom a 200 W por 30 min, até que ela tivesse uma cor vermelho vinho brilhante. Em seguida, a solução de reação foi realizada com uma centrífuga (8000 rpm, 20 min) para remover o HAuCl residual ₄ e PC. Por último, a deposição foi redispersa em 3 ml de solução hidroalcoólica de ALA (ALA-HA, 2 mg / ml ALA, 30% de etanol) e incubada por um método de carregamento ativo de gradiente de pH transmembrana de acordo com nosso trabalho anterior [13]. Na incubação, uma abundância de ALA externo não sindicalizado se difundiu através das bicamadas ES no núcleo aquoso ácido interno do ES e, em seguida, eles foram protonados e aprisionados no ES. Após a incubação, A / A-ES foi preparado. Neste trabalho, o ALA-ES foi preparado de acordo com nosso trabalho anterior com a mesma concentração de ALA que A / A-ES. ES carregado com AuNP (Au-ES) foi preparado como A / A-ES sem ALA com a mesma concentração de AuNP que A / A-ES.

A caracterização de A / A-ES

A / A-ES foram corados negativamente com ácido fosfotúngstico (1,5% em peso) e então observados por microscópio eletrônico de transmissão (TEM, JEOL, Japão, voltagem de aceleração de 120 kV). A / A-ES também foi examinada por microscopia eletrônica de varredura (SEM, JEOL, Japão, voltagem de aceleração de 10 kV). A distribuição de tamanho A / A-ES foi determinada por análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS) em um sistema de inspeção NiComp 380ZLS (Nicomp, EUA). O ALA foi determinado por uma abordagem de derivatização de fluoresceamina e o detalhe foi mostrado no arquivo adicional 1. A eficiência de aprisionamento (EE) de ALA determinada por um método de ultrafiltração foi mostrada no arquivo adicional 1. Finalmente, os espectros de UV-Vis foram realizados em um Espectrofotômetro Varian Cary 50 UV-Vis (Perkin Elmer, EUA).

Estudo de penetrabilidade in vitro por células de difusão de Franz

O estudo de penetrabilidade de A / A-ES foi realizado usando células de difusão de Franz com 2,8 cm ² área de permeação efetiva. As células receptoras, incluindo compartimentos doador e receptor, foram mantidas a 37 ° C por banho de água circulante. Os tecidos HS foram coletados com consentimento informado no Shanghai Ninth People’s Hospital e com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinque de 1975, aprovada pelo Shanghai Ninth People’s Hospital. Tecido HS fresco sem tecido adiposo (menos de 24 horas após a excisão) foi montado em um compartimento receptor com estrato córneo para cima para o compartimento doador. Um mililitro de A / A-ES foi adicionado ao compartimento doador e, em seguida, o compartimento doador foi coberto com parafilme para evitar a evaporação. Após a penetração com tempo diferente, os tecidos de HS foram lavados prontamente para remover A / A-ES residual na superfície de HS. Para acumular a quantidade de retenção de ALA e AuNPs em HS, os tecidos de HS foram cortados em pedaços pequenos e o ALA em tecidos de HS foi extraído por diálise em PBS por 24 h. As soluções de extrato foram analisadas quanto à retenção da quantidade de ALA no tecido de HS. Os tecidos HS retidos em bolsas de diálise também foram analisados quanto à quantidade de retenção de AuNP por espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente (ICP-MS). Após permeado por ALA-ES por 2 h, o tecido HS foi lavado, pré-fixado, desidratado, infiltrado e pós-fixado. Depois de embebidos em resinas epóxi, foram cortados como ultrassecções (espessura de 50 nm, perpendicular à epiderme) e observados usando TEM a uma tensão de aceleração de 120 kV.

PDT / PTT in vitro para HSF

Cultura de células

O HSF foi isolado e cultivado por um método comum da seguinte forma:Os pedaços de tecido HS frescos (1 mm ³ , menos de 6 h após a excisão) foram digeridos usando colagenase tipo I (Invitrogen, EUA) para obter a suspensão de células únicas. O HSF cresceu em Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen, EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco, EUA) a 37 ° C e 5% de CO ₂ . O meio de cultura deve ser trocado a cada 3 dias, e as células foram passadas quando 80% confluentes. As passagens de duas e três células foram usadas nas seguintes experiências.

Ensaio de biocompatibilidade

Na avaliação da biocompatibilidade de A / A-ES, HSF foram semeados em placas de 96 poços a 2 × 10 ³ células / poço. O meio de cultura foi substituído por meio livre de FBS e ALA-ES, Au-ES e A / A-ES recém-preparados em diferentes concentrações, respectivamente. Após 12 h, a viabilidade celular foi medida usando um kit de contagem de células-8 (CCK-8, Dojindo, Japão) seguindo as instruções do fabricante.

Procedimento PDT / PTT

HSF foi semeado em placas de 12 poços em 4 × 10 ⁴ células / poço. Após 12 h, os meios de cultura, respectivamente, contendo ALA-ES, Au-ES e A / A-ES preparados frescos (14%, v / v ), foram substituídos pelo meio sem FBS por 6 h. Após o tratamento, o HSF foi lavado com PBS e incubado em meio de cultura por 1 h. Em seguida, eles foram irradiados por laser He-Ne (comprimento de onda de 632 nm, 40 mW / cm ² , Instituto de Tecnologia Laser de Xangai, China) com 20 min. Em seguida, o meio de cultura foi substituído por DMEM fresco contendo 10% de FBS por mais 24 h em preparação para os experimentos subsequentes. Furthermore, HSF treated with A/A-ES and irradiation was prefixed, dehydrated, and embedded to prepare ultrasections for TEM examination.

Intracellular PpIX and ROS Generation Assay

Intracellular PpIX accumulation and ROS generation in HSF were detected by using confocal laser scanning microscopy (CLSM, Leica TCS SP5, Germany). The ROS generation assay was performed using a DCFH-DA and followed the manufacturer’s instructions. The coverslip with cells was mounted on a glass slide and observed at 405 nm excitation/635 nm emission for PpIX and 488 nm excitation/560 nm emission for ROS. All data was analyzed by LAS AF software.

Apoptosis and Necrosis Assay

The apoptosis and necrosis of HSF were analyzed by flow cytometry after double staining Annexin V-FITC and propidium iodide (PI) double staining. The samples were prepared according to the protocol of Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit and then analyzed by BD FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, USA). The data analysis was performed with FlowJo 7.6 software.

Statistical Analysis

Data were presented as mean ± SD unless otherwise stated. Statistical significance was determined using a two-tailed student’s test (P < 0.05) unless otherwise stated.

Abreviações

A/A-ES:: 5-Aminolevulinic acid/Au nanoparticle-loaded ethosomal vesicle
ALA:: 5-Aminolevulinic acid
ALA-ES:: ALA-loaded ES
ALA-PDT:: ALA-based PDT
Au-ES:: AuNP-loaded ES
AuNPs:: Au nanoparticles
CLSM:: Confocal laser scanning microscopy
DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
DMEM:: Dulbecco’s Modified Eagle Medium
EE:: Entrapment efficiency
ES:: Ethosomal vesicles
FBS:: Soro fetal bovino
HS:: Hypertrophic scar
HSF:: Hypertrophic scar fibroblasts
ICP-MS:: Inductively coupled plasma-mass spectrometry
LSPR:: Ressonância de plasmon de superfície localizada
PDT:: Photodynamic therapy
PDT/PTT:: Photodynamic/photothermal therapy
PpIX:: Protoporphyrin IX
PTT:: Photothermal therapy
ROS:: Espécies que reagem ao oxigênio
SEM:: Microscopia eletrônica de varredura
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão

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