Efeitos de Nanopartículas de Ouro de 15 nm na Proliferação, Apoptose e Formação de Esferoides em Células de Carcinoma de Cólon HT29 e Rim Embrionário SPEV

Resumo

Modelos de cultura celular fornecem plataforma confiável para avaliar toxicidade potencial de nanomateriais e dissecar seu impacto mecânico na biologia do câncer. Aqui avaliamos como nanopartículas de ouro de 15 nm estabilizadas com citrato (AuNPs) influenciam duas linhagens epiteliais de origem distinta: linhagem contínua de rim embrionário suíno SPEV e linhagem de carcinoma colorretal humano HT29. Exposição a concentrações de AuNP variando de 1 a 12 µg mL⁻¹ permitiu monitorar adesão celular, proliferação, apoptose/necrose e capacidade de formar esferoides multicelulares. Encontramos que 6–12 µg mL⁻¹ AuNPs reduziram significativamente proliferação celular e aumentaram populações apoptóticas/necróticas precoces e tardias em ambas linhagens. Inversamente, baixas doses de AuNP (1–3 µg mL⁻¹) estimularam formação de esferoides, enquanto doses mais altas exerceram efeitos citotóxicos e anti-coesivos em cultura de suspensão. Esses resultados destacam papel dual dependente de dose das AuNPs e apoiam sua exploração contínua como estratégia anticâncer direcionada.

Introdução

Nanopartículas de ouro (AuNPs) são valorizadas por sua biocompatibilidade, propriedades ópticas e potencial terapêutico emergente em espectro de malignidades, incluindo cânceres de mama, fígado, gástrico, cólon e pulmão. Traços físico-químicos únicos das AuNPs — tamanho, forma, carga superficial e concentração — governam sua captação celular, distribuição e efeitos biológicos. Embora muitos estudos foquem na eficácia anticâncer das AuNPs, perfil toxicológico abrangente em modelos clinicamente relevantes permanece essencial para tradução segura.

Entrega direcionada de AuNPs a tecido tumoral permanece desafio; taxas de captação diferenciais relatadas entre células epiteliais de várias origens. Variações em composição de membrana, expressão de glicoproteínas e capacidade endocítica provavelmente subjazem essas diferenças, ressaltando necessidade de estudos comparativos em linhagens epiteliais normais e malignas.

Ensaios de cultura celular oferecem ambiente controlado para dissecar respostas celulares às AuNPs, informando avaliações de segurança e otimização terapêutica. Neste estudo, comparamos efeitos de AuNPs em linhagem renal embrionária normal (SPEV) e linhagem de carcinoma colorretal (HT29) usando readouts de adesão, proliferação, apoptose/necrose e formação de esferoides.

Métodos

Cultura de Células SPEV

Células SPEV mantidas em DMEM (Sigma, EUA) suplementado com 5% SFB (HyClone, EUA), penicilina/estreptomicina (PAA, Áustria) e anfotericina B (5 µg mL⁻¹). Células semeadas a 0,5–2×10⁴ células cm⁻² e cultivadas em 5% CO₂ a 95% umidade. Meio renovado a cada 48 h, passagens realizadas ao atingir confluência, preservando morfologia monocamada entre passagens.

Cultura de Células HT29

Células HT29 cultivadas em RPMI-1640 (Sigma, EUA) com 10% SFB, 2 mM L-glutamina e 40 mg mL⁻¹ gentamicina (Sigma, EUA). Densidade de trabalho 0,5–4×10⁴ células cm⁻². Células obtidas do Banco de Linhagens Celulares do Instituto RE Kavetsky de Patologia Experimental, Oncologia e Radiobiologia, NAS da Ucrânia.

Manipulação com AuNPs

AuNPs sintetizadas por método de redução com citrato e fornecidas pelo Instituto de Bioquímica e Fisiologia de Plantas e Microorganismos, Academia Russa de Ciências. Partículas com média de 15 nm diâmetro, concentração de estoque 57 µg mL⁻¹. Microscopia eletrônica de campo escuro e espectros de extinção confirmaram distribuição de tamanho (Fig. 1). Células tratadas com 1, 3, 6 ou 12 µg mL⁻¹ AuNPs por 24–48 h; culturas não tratadas serviram como controles.

Ensaios de Adesão e Proliferação

Adesão quantificada contando células achatadas a 30, 60, 120, 180 e 1440 min após semeadura, usando microscópio invertido. Proliferação ao longo de 1–4 dias avaliada por descolamento com tripsina-EDTA e contagem em câmara de Goryaev. Dados expressos como média ± EP.

Avaliação de Apoptose/Necrose

Após 4 dias de exposição a AuNPs, células coradas com Annexin-V e 7-AAD e analisadas por citometria de fluxo (FACS Calibur, BD). Resultados processados com WinMDI v2.8.

Formação de Esferoides Multicelulares

Para gerar esferoides, 5×10⁴ células cm⁻² semeadas em placas de 24 poços revestidas com 1% agar e cultivadas em 0,24% carboximetilcelulose (CMC) com rotação 80 rpm. Esferoides permitidos formar por 24 h, então mantidos por 48 h adicionais na presença de AuNPs. Tamanho e número de esferoides medidos por microscopia de campo escuro e analisados com Axio Vision 4.7, calculando volume via V = 0,4 × a × b² (a, b = diâmetros). Agregados agrupados por volume (1×10⁻⁴–1×10⁻² mm³) para determinar volumes medianos e contagens.

Análise Estatística

Dados analisados usando ANOVA one-way e teste t de Student (Statistica 8). Significância definida em p ≤ 0,05, apresentada como média ± EP.

Resultados

Adesão de Células SPEV e HT29

Figura 2 ilustra impacto de AuNPs na adesão de SPEV. Após 1 h, 1, 3 e 6 µg mL⁻¹ AuNPs reduziram contagens de células aderidas relativo a controle, com 12 µg mL⁻¹ causando diminuição 1,8 vezes que persistiu por 24 h. Células HT29 mostraram tendência similar: baixas concentrações efeitos negligenciáveis, enquanto 6 e 12 µg mL⁻¹ reduziram adesão em 1,16 e 1,28 vezes, respectivamente (Fig. 3).

Proliferação de Células SPEV e HT29

Figura 4 mostra que 1–6 µg mL⁻¹ AuNPs não alteraram proliferação de SPEV durante dias 2–4, enquanto 12 µg mL⁻¹ reduziu números celulares até 1,5 vezes (Fig. 4). Proliferação de HT29 inalterada até dia 3; no dia 4, 6 e 12 µg mL⁻¹ reduziram contagens em 1,33 e 1,44 vezes, respectivamente (Fig. 5).

Indução de Apoptose/Necrose

Baixas doses de AuNP (1–3 µg mL⁻¹) não alteraram significativamente perfis Annexin-V/7-AAD em nenhuma linhagem (Tabelas 1–2). A 6–12 µg mL⁻¹, tanto SPEV quanto HT29 mostraram aumentadas populações apoptóticas/necróticas precoces e tardias. Para SPEV, 12 µg mL⁻¹ elevou células Annexin-V⁺/7-AAD⁺ em 7,8% (p ≤ 0,05); para HT29, 6 µg mL⁻¹ e 12 µg mL⁻¹ aumentaram esta fração em 3,2% e 4,8%, respectivamente.

Formação de Esferoides

Figuras 6 e 7 mostram como AuNPs modulam número e volume de esferoides. Esferoides controle HT29 média 5,19×10⁻³ mm³, enquanto esferoides SPEV média 0,79×10⁻⁵ mm³. 1–3 µg mL⁻¹ AuNPs amplificaram volume de esferoides SPEV em 9,7 e 7,4 vezes, e volume HT29 em 1,4 e 1,2 vezes. Aumentando concentração de AuNP a 12 µg mL⁻¹ reduziu volume de esferoides em ambas linhagens (HT29: 7,18 → 4,24×10⁻³ mm³; SPEV: 7,69 → 4,58×10⁻⁵ mm³) enquanto aumentou número de esferoides HT29 de 3 para 10 por campo e diminuiu esferoides SPEV de 32 para 19.

Discussão

Nossos dados confirmam perfil citotóxico dependente de dose de AuNPs de 15 nm em ambas células SPEV e HT29. Concentrações de 6–12 µg mL⁻¹ inibiram proliferação, aumentaram apoptose/necrose e desestabilizaram coesão celular em suspensão, evidenciado por tamanho e número de esferoides alterados. Sensibilidade aumentada de HT29 (6 µg mL⁻¹) relativa a SPEV (12 µg mL⁻¹) alinha com relatos prévios de captação diferencial e disrupção citoesquelética por AuNPs.

Mecanicamente, AuNPs podem interferir com complexos de adesão focal, modular dinâmica de actina e desencadear estresse oxidativo mitocondrial — vias que culminam em parada de ciclo celular e morte celular programada. Efeito anti-coesivo observado em doses mais altas provavelmente reflete disrupção de junções célula-célula, levando a fragmentação aumentada de esferoides.

Embora achados in vitro sejam promissores, validação in vivo essencial para confirmar eficácia terapêutica e segurança. Nosso estudo fornece benchmark rigoroso para design de estratégias anticâncer baseadas em AuNPs que exploram sua capacidade dual de inibir crescimento tumoral e modular microambientes celulares.

Conclusões

AuNPs de 15 nm exibem efeitos claros dependentes de concentração em ambas células SPEV normais e HT29 malignas: proliferação reduzida, apoptose/necrose aumentada e dinâmica de esferoides alterada. Baixas doses (1–3 µg mL⁻¹) promovem formação de esferoides, enquanto doses mais altas (6–12 µg mL⁻¹) exercem ações citotóxicas e anti-coesivas. Esses achados apoiam investigação adicional de AuNPs como modalidade anticâncer direcionada, com atenção à otimização de dose para benefício terapêutico máximo e toxicidade off-target mínima.