Um biossensor eletroquímico de DNA altamente sensível do nanocompósito de ouro acrílico para a determinação do gênero do peixe aruanã

Resumo

A presente pesquisa descreve um método simples para a identificação do sexo do peixe aruanã ( Scleropages formosus ) O biossensor de DNA foi capaz de detectar uma sequência específica de DNA em níveis extremamente baixos até regimes atto M. Um biossensor eletroquímico de DNA baseado em compósito híbrido microesfera acrílica-nanopartícula de ouro (AcMP-AuNP) foi fabricado. Microesferas hidrofóbicas de poli (n-butilacrilato-N-acriloxissuccinimida) foram sintetizadas com um procedimento de fotopolimerização de uma etapa fácil e bem estabelecido e fisicamente adsorvidas nos AuNPs na superfície de um eletrodo impresso em tela de carbono (SPE). O biossensor de DNA foi construído simplesmente enxertando uma sonda de DNA aminada nos AcMPs funcionalizados com succinimida por meio de uma ligação covalente forte. A resposta de hibridização de DNA foi determinada pela técnica de voltametria de pulso diferencial (DPV) usando a sonda redox de ácido monossulfônico de antraquinona como um marcador de oligonucleotídeo eletroativo (Tabela 1). Um limite de detecção baixo em 1,0 × 10 ⁻¹⁸ M com uma ampla faixa de calibração linear de 1,0 × 10 ⁻¹⁸ para 1,0 × 10 ⁻⁸ M ( R ² =0,99) pode ser alcançado pelo biossensor de DNA proposto sob condições ideais. A detecção eletroquímica do DNA de aruanã pode ser concluída em 1 hora. Devido ao seu pequeno tamanho e peso leve, o biossensor de DNA desenvolvido é uma grande promessa para o desenvolvimento de kit funcional para uso em piscicultura.

Histórico

Aruanã asiático ( Scleropages formoss ), um peixe de água doce, [1] é amplamente distribuído no interior da região do Sudeste Asiático, como Malásia, Cingapura, Tailândia, Indonésia, Camboja, Vietnã, Laos, Mianmar e Filipinas. Além disso, o peixe aruanã também é encontrado na Austrália e na Nova Guiné [1,2,3,4]. É popularmente conhecido como dragonfish, Asia bonytongue, kelisa ou baju-rantai [5, 6]. Ele ainda está sobrevivendo como uma espécie de peixe primitiva da era Jurássica [7, 8]. Os chineses e asiáticos a consideravam um símbolo de boa sorte e felicidade, junto com muitas outras culturas [6]. Geralmente, o aruanã tem cerca de 7 kg de peso e 1 m de comprimento na idade adulta [9]. Este peixe ornamental possui cores e morfologia atraentes e pode ser identificado por suas características físicas distintas, como o tamanho do corpo comparativamente longo, uma grande nadadeira peitoral e as nadadeiras dorsal e anal estão posicionadas bem para trás no corpo. Existem três variedades de cores principais, ou seja, dourado, vermelho e verde de peixes de água doce intimamente relacionados dentro da espécie aruanã asiática. Existem também várias outras espécies distintas derivadas de diferentes partes do Sudeste Asiático e são regionais para muitos sistemas fluviais [8].

Devido à sua alta popularidade e grande demanda em fins ornamentais, o aruanã asiático tem sido ferozmente caçado para fins lucrativos [6], e resulta em um rápido declínio de sua população. Considerando sua alta demanda na indústria ornamental, a superexploração de populações naturais e a raridade de habitats naturais devido às mudanças no ambiente de vida, o aruanã asiático foi classificado como uma espécie em extinção ameaçada de extinção desde 1980 pela Convenção sobre Comércio Internacional em Espécies Ameaçadas de Fauna e Flora Selvagem (CITES) e foi recentemente listado como ameaçado pela Lista Vermelha da IUCN de 2006 [1, 3, 8, 10, 11]. No entanto, o comércio comercial desta espécie ameaçada de extinção é proibido pela CITES, exceto em alguns países, por exemplo, Indonésia, Cingapura e Malásia. [2, 3, 12]. Existem vários cultivadores registrados na CITES na Ásia que realizam ativamente a agricultura e o comércio de peixes aruanã [2, 12]. Este peixe asiático de água doce consiste em linhagens geograficamente isoladas e é o único membro da espécie com diferentes variedades de cores que se baseiam em diferentes distribuições geográficas ao longo dos rios do Sudeste Asiático. A distribuição das espécies é agora muito mais difundida, que se estende até o rio Nilo da África, o rio Amazonas da América do Sul, Austrália e Nova Guiné [1, 4, 8].

Entre as diferentes cores do aruanã asiático, os peixes aruanã vermelho e dourado são os animais ornamentais mais caros e populares na indústria de incubação em comparação com o preto, verde, prata e outras variedades de cores [1, 5, 10, 13]. O fenômeno do roubo de ovos do aruanã asiático é atípico em comparação com outras espécies de peixes. Em geral, os peixes aruanã amadurecem na idade de 3-4 anos e colocam apenas alguns ovos (30-100) [14, 15] de tamanho extragrande (cerca de 1 cm de diâmetro) [16]. Curiosamente, os ovos fertilizados e as larvas são então protegidos e crescidos na boca dos peixes aruanã machos, e eles mostram alto cuidado dos pais. Identificar o gênero com base na observação visual do bebê aruanã é difícil porque não há órgão fenotípico distinto de dimorfismo sexual [14, 15]. Apenas um dos pais (presume-se que seja o macho) pode ser identificado, pois os descendentes são colhidos de sua boca. O outro pai não pode ser identificado entre vários pais em potencial [16].

Normalmente, os aquaristas mantêm os filhotes de aruanã para fins ornamentais no aquário e também para cultivo na piscicultura. No entanto, todos os tipos de juvenis de aruanã são vendidos ao mesmo preço, devido à falta de tecnologia assistiva para diferenciação de gênero e variedade de cor. Até o momento, não há um método estabelecido publicado para identificar o sexo e a cor dos peixes aruanã em seu estágio juvenil. Em vez disso, centenas de estudos foram realizados usando análise de DNA com base na estrutura genética e na biografia de peixes aruanã na tentativa de identificar o sexo e a cor em sua tenra idade. O método tradicional baseado no tamanho do corpo e estimativas da cavidade bucal só pode ser feito por volta dos 3 meses de idade do bebê aruanã para identificações de gênero e cor [17]. No entanto, este método de exame visual convencional é demorado e geralmente fornece resultados imprecisos. Por outro lado, os métodos padrão amplamente utilizados com base no sequenciamento de DNA, ou seja, reação em cadeia da polimerase (PCR) e eletroforese em gel, demandam trabalho, tempo e recursos. Um algoritmo alternativo do método inventivo de resolução de problemas (ARIZ) foi previamente empregado para a detecção de detecção de gênero aruanã [18]. ARIZ é uma ferramenta alternativa para detecção de gênero, contendo nove partes diferentes e um total de 40 etapas complexas. Requer muito tempo para aprender e praticar e requer pessoal altamente experiente para operar. Por exemplo, a aplicação do ARIZ em vários sistemas de engenharia foi empregada, mas a maioria dos casos não cobriu todos os requisitos e processos do ARIZ.

Nesta pesquisa, microesferas de polímero acrílico modificadas com grupos funcionais de succinimida via frações N-acriloxissuccinimida (NAS) foram usadas como a matriz para a imobilização da sonda de DNA. Conforme relatado anteriormente por Chen e Chiu 2000 e Chaix et al. 2003 [19, 20], o grupo funcional succinimida pode reagir com grupos funcionais amina para formar uma ligação covalente. A incorporação da funcionalidade NAS em microesferas de acrílico para aplicação de microbiossensor de DNA oferece vantagens de um método de preparação simples, onde as esferas podem ser sintetizadas e funcionalizadas por meio de um procedimento de uma etapa usando fotopolimerização em uma curta duração (vários minutos). Além disso, as microesferas têm a vantagem do tamanho pequeno e fornecem uma grande área de superfície para a imobilização da sonda de DNA, reduzindo assim a barreira à difusão de reagentes e produtos. Isso permite a melhoria no desempenho do biossensor em termos de tempos de resposta mais curtos e faixa de resposta linear mais ampla, o que será demonstrado no trabalho relatado aqui.

Neste estudo, um método eletroquímico de biossensor de DNA, altamente sensível, simples, fácil de fabricar e de baixo custo, é proposto para a determinação do sexo de juvenis de peixes aruanã com alta precisão. O biossensor de DNA foi construído a partir de um eletrodo de carbono serigrafado (SPE) modificado com nanopartículas de ouro coloidal (AuNPs) e microesferas de poliacrilato funcionalizadas com grupo funcional NAS. Os AuNPs foram imobilizados na superfície de carbono SPE via interação eletrostatística e desempenharam um papel importante no aumento da condutividade do eletrodo e facilitando a transferência de elétrons, enquanto as microesferas acrílicas (AcMPs) foram diretamente depositadas no SPE modificado por AuNP via adsorção física. A sonda de DNA aminada de aruanã foi então covalentemente ligada ao composto AcMP-AuNP imobilizado no grupo succinimida exposto dos AcMPs. A hibridização sonda-alvo foi detectada com marcador redox de antraquinona via voltametria de pulso diferencial (DPV). A incorporação de tamanhos pequenos e uniformes de AcMPs foi capaz de manter uma grande capacidade de carregamento de DNA e aumentar a sensibilidade e o limite de detecção do biossensor eletroquímico de DNA de aruanã.

Métodos

Aparelho e eletrodos

Todas as medições eletroquímicas foram realizadas com DPV usando o potenciostato / galvanostato Autolab PGSTAT 12 (Metrohm) a um potencial de passo de 0,02 V dentro da janela de potencial de -1,0 V a -0,1 V. SPE da Scrint Technology Co Malaysia modificado com AcMPs e AuNPs foi usado como o eletrodo de trabalho. Um eletrodo de platina em forma de bastonete (Pt) e um eletrodo de Ag / AgCl preenchido com 3,0 M de solução interna de KCl foram usados ​​como eletrodos auxiliares e de referência, respectivamente. O banho de sonicação Elma S30H foi usado para preparar soluções homogêneas.

Químicos

2–2-Dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPP) foi adquirido da Fluka. Diacrilato de 1,6-hexanodiol (HDDA), acrilato de n-butil (nBA) e tri-hidrato de cloreto de Au (III) foram fornecidos por Sigma-Aldrich. Os AuNPs coloidais foram sintetizados de acordo com o método relatado por Grabar et al. (1995). Dodecilsulfato de sódio (SDS) e NaCl foram obtidos da Systerm. NAS e sal de sódio mono-hidratado do ácido antraquinona-2-sulfônico (AQMS) foram adquiridos da Acros. Água Milli-Q (18 mΩ) foi usada para preparar todas as soluções químicas e biológicas. A solução estoque da sonda de DNA foi diluída com 0,05 M de tampão K-fosfato (pH 7,0), enquanto as soluções de DNA complementar (cDNA) e não complementar (ncDNA) foram preparadas com 0,05 M de tampão Na-fosfato a pH 7,0 contendo 1,0 mM de AQMS. O tampão de fosfato K facilita a imobilização máxima da sonda de DNA no material acrílico funcionalizado com succinimida, enquanto o tampão de fosfato de Na fornece uma condição ótima para a reação de hibridização de DNA [21, 22].

Síntese de microesfera acrílica

Os AcMPs foram preparados de acordo com os métodos descritos anteriormente com ligeiras modificações [22]. Resumidamente, uma mistura de 450 μL de HDDA, 0,01 g de SDS, 0,1 g de DMPP, 7 mL de monômero nBA e 6 mg de NAS foi dissolvida em 15 mL de água Milli-Q e sonicada em temperatura ambiente (25 ° C ) por 10 min. Depois disso, a solução de emulsão foi fotocurada com luz UV por 600 s sob um fluxo contínuo de N ₂ gás. As microesferas de poli (nBA-NAS) resultantes foram então coletadas por centrifugação a 4000 rpm por 30 min seguido por lavagem em tampão K-fosfato (0,05 M, pH 7,0) por três vezes e deixadas para secar à temperatura ambiente.

Fabricação de biossensor de DNA usando microesferas acrílicas

Antes da modificação da superfície, o SPE de carbono foi enxaguado minuciosamente com água DI, revestido com microesferas de polímero acrílico a 3 mg / mL e deixado secar ao ar em condições ambientais, seguido de gotejamento com 5 mg / mL de AuNPs coloidais. A característica eletroquímica do carbono SPE antes e depois da modificação com AcMPs e AuNPs foi examinada com o método CV. A Figura 1 retrata o método, que é composto de fabricação de biossensor eletroquímico de DNA em 3 etapas e detecção de cDNA de aruanã em 1 etapa. Cerca de 10 μL de AuNPs coloidais (1 mg / 300 μL) foram primeiramente depositados em um SPE de carbono e secos ao ar a 25 ° C. Como os AcMPs (1 mg) foram prontamente suspensos em etanol (100 μL) para formar uma dispersão estável, 10 μL de suspensão de AcMP foram revestidos com gota a gota no SPE modificado com AuNP. O carbono SPE modificado com AcMP-AuNP foi então mergulhado em 300 μL de solução de sonda de DNA de aruanã 5 μM por 6 h para que o processo de imobilização de DNA ocorresse e lavou-se cuidadosamente com tampão K-fosfato (0,05 M, pH 7,0) por três vezes para remova a sonda de captura não ligada. A sonda de DNA imobilizada foi posteriormente imersa em 300 μL de solução de DNA alvo contendo 2 M de NaCl e 1 mM de AQMS para permitir que as reações de hibridização e intercalação do DNA ocorressem dentro de uma hora, seguido por enxágue sequencial com água Milli-Q e fosfato de Na tampão (0,05 M, pH 7,0) para a remoção de fragmentos de DNA não hibridizados e uma ligação específica do marcador eletroquímico AQMS. Todas as medições de DPV foram realizadas em 4,5 mL de tampão K-fosfato 0,05 M em pH 7,0 e temperatura ambiente.

O procedimento de fabricação do biossensor eletroquímico de DNA de aruanã baseado no eletrodo modificado por AcMP-AuNP

Otimização do biossensor eletroquímico de DNA de Aruanã

Os eletrodos de DNA modificados com o respectivo AcMP, AuNP e composto AcMP-AuNP foram usados ​​no teste de cDNA (5 μM) e ncDNA (5 μM) com método eletroanalítico DPV na presença de 1 mM de AQMS e 2 M de NaCl em a taxa de varredura de 0,5 V / s versus eletrodo de referência Ag / AgCl. A duração da imobilização da sonda de DNA foi determinada embebendo separadamente nove unidades de SPEs modificados com AcMP-AuNP em 300 μL de solução de sonda de DNA aruanã 5 μM por 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12 e 18 h, antes reação com 5 μM de cDNA em tampão de hibridização de DNA (0,05 M de tampão fosfato de Na em pH 7,0) contendo 1 mM de intercalador redox de antraquinona e 2 M de NaCl. O tempo de hibridização do DNA foi investigado imergindo o eletrodo de DNA em 300 μL de solução de cDNA 5 μM na presença de 2 M de NaCl e 1 mM de AQMS por 10–100 min. O efeito da temperatura na duração da hibridização do DNA foi feito medindo a resposta do biossensor de DNA de aruanã a 4, 25, 40 e 50 ° C por um período experimental de 5–90 min no tampão de medição usando a técnica DPV. Para o estudo do efeito do pH, o biossensor de DNA de aruanã foi mergulhado em 5 μM de solução de cDNA preparada a partir de 0,05 M de tampão de fosfato de Na condicionado com 2 M de NaCl e 1 mM de AQMS entre pH 5,5 e pH 8,0 seguido por medição de DPV. O efeito de vários íons carregados positivamente (ou seja, Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ e Fe ³⁺ íons) na resposta eletroquímica do biossensor de DNA de aruanã foi realizada pela adição de CaCl ₂ , NaCl, KCl e FeCl ₃ em 0,05 M de tampão fosfato de Na (pH 7,0) antes da reação de hibridização de DNA e medição de DPV. A força iônica do tampão de hibridização foi otimizada variando o tampão Na-fosfato e as concentrações de NaCl de 0,002–0,1000 M a 1,52–5,50 M, respectivamente. A curva de calibração linear do biossensor de DNA de aruanã foi então estabelecida por meio de medição quantitativa de uma série de concentrações de cDNA de 1,0 × 10 ⁻¹⁸ para 2,0 × 10 ⁻² μM via método DPV. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Extração de DNA e análise de DNA de Aruanã

Um total de 15 amostras de tecido de peixe aruanã foram gentilmente cedidas pelo Fisheries Research Institute (FRI), Departamento de Pesca da Malásia. Todas as amostras de tecido de peixes foram armazenadas em etanol 70% em um resfriador a 4 ° C e enviadas ao laboratório. As amostras de tecido de peixe foram lavadas com água Milli-Q e cortadas em pequenos pedaços e secas em condições ambientais antes de serem mantidas no freezer a -20 ° C. O DNA de Aruanã de cada amostra de tecido (35-40 mg cada) foi extraído separadamente usando o kit de purificação QIAquick PCR (Manchester, Reino Unido) de acordo com o protocolo do fabricante e armazenado a -20 ° C quando não estava em uso. A amplificação por PCR do fragmento de DNA genômico foi então realizada usando termociclador Bio-Rad PCR (PTC-100, Hercules, EUA). Os fragmentos de DNA do produto de PCR foram então separados com eletroforese em gel de agarose a 1,5%. Os extratos de DNA de aruanã também foram analisados ​​pelo biossensor eletroquímico de DNA para determinar o gênero. As respostas de DPV obtidas foram comparadas com a corrente de linha de base obtida sem a presença de DNA de aruanã. A t teste foi aplicado para determinar a diferença significativa entre a resposta do biossensor de DNA e a linha de base atual em 4 graus de liberdade e nível de confiança de 95%. A resposta do biossensor de DNA obtida significativamente mais alta do que a linha de base da corrente indicou que um peixe aruanã macho foi detectado e vice-versa.

Resultados e discussão

Os AcMPs sintetizados foram observados (Fig. 2) em microscópio eletrônico de varredura (SEM, LEO 1450VP). A distribuição de tamanho de miscropsheres acrílicas preparadas a partir de fotopolimerização é ilustrada na Fig. 3.

Imagem SEM de microesferas de polímero acrílico

Distribuição de tamanho de microesferas de acrílico preparadas a partir de fotopolimerização

O efeito das diferentes taxas de varredura do carbono SPE contendo AcMPs-AuNPs na presença de K ₃ Fe (CN) ₆ mostraram que as correntes de pico de oxidação e redução aumentaram com o aumento da taxa de varredura de 0,05 para 0,30 V / s (Fig. 4). Assim, espera-se que o processo de transferência de elétrons na superfície do eletrodo seja reversível [22,23,24,25].

Voltamogramas cíclicos de 1,0 mM K ₃ Fe (CN) ₆ em tampão de fosfato de Na 0,05 M de pH 7,0 com diferentes taxas de varredura (0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25 e 0,30 V / s) para um SPE de carbono modificado contendo material AcMP-AuNP na superfície do eletrodo

Com base na equação Randles-Sevcik,
$$ \ mathrm {ip} =0,4463 \ \ mathrm {nFAC} \ {\ left (\ mathrm {nFvD} / \ mathrm {RT} \ right)} ^ {1/2} $$ (1)
uma boa linearidade foi encontrada entre a corrente de pico redox e a raiz quadrada da taxa de varredura com um coeficiente de correlação ( R ² ) de 0,996 no intervalo de 50–300 mV / s, conforme mostrado pela Eq. 2 e Fig. 5a.
$$ \ mathrm {ip} =1,463 {\ mathrm {v}} ^ {1/2 \ hbox {-}} 2,451 $$ (2)
Gráfico das correntes de pico de oxidação (ip / μA) versus raiz quadrada da taxa de varredura ((mV / s) ^1/2 ) ( a ) e gráfico de log de correntes de pico de oxidação (ip / μA) versus log de taxas de varredura (log (mV / s)) ( b )

Isso indica que a reação na superfície do eletrodo modificado foi uma reação de difusão controlada [22,23,24,25].

Além disso, com base na Fig. 5b, quando o valor do log da corrente de oxidação foi plotado contra o valor do log da taxa de varredura, uma linha linear foi obtida com uma inclinação de 0,65, que estava perto do valor teórico de 0,50 para o processo controlado por difusão . Portanto, o estudo demonstrou que a reação na superfície do SPE modificado é principalmente controlada por difusão.

Para o caso ideal de um processo de transferência rápido, reversível e de um elétron, ΔEp =0,059 V a 298 K. No entanto, os desvios de potencial de pico que aumentaram com a taxa de varredura demonstraram maiores separações de potencial de pico de mais de 0,059 V (Fig. 4 ) Isso implica que o processo de transferência de elétrons na superfície do eletrodo é lento [22, 25, 26], provavelmente devido à resistência criada pela presença de material AcMP cobrindo a superfície do eletrodo.

A Figura 6 mostra a resposta de DPV do biossensor de DNA de aruanã com base em SPEs de carbono modificados por AcMP, AuNP e AcMP-AuNP. A diferença de corrente DPV significativa observada entre o experimento (a) e (c) revela que as sondas de DNA de aruanã foram enxertadas com sucesso nos AcMPs por meio de ligações covalentes fortes entre o grupo funcional succinimida do AcMP e o grupo funcional amina da sonda de DNA aminado e o imobilizado A sonda de DNA de aruanã foi seletiva apenas para seu cDNA [19, 20]. Os AuNPs desempenharam um papel para auxiliar a condutividade eletrônica do AQMS intercalado para a superfície do eletrodo fabricado. Sem a inclusão de AuNPs no material compósito (f), apenas nanopartículas de ouro (e), e as nanopartículas de ouro e compósito AcMP (d), apenas muito pouca resposta de corrente pode ser observada. As baixas correntes de DPV adquiridas no experimento (b) foram devido a nenhuma reação de hibridização de DNA ocorrida com ncDNA, o que também indica nenhuma absorção específica do indicador redox AQMS na superfície do eletrodo [27, 28].

O sinal DPV do eletrodo de DNA baseado em AcMP-AuNP após hibridização com cDNA ( a ) e DNA não complementar ( b ), a resposta DPV dos AcMPs ( f ) e SPE modificado com AuNP ( e ), e SPE modificado por composto AcMP-AuNP, bem como a resposta do biossensor de DNA com base na sonda de DNA modificada por composto AcMP-AuNP SPE ( c ) antes da reação com cDNA na presença de AQMS 1 mM na taxa de varredura de 0,5 V / s versus eletrodo de referência Ag / AgCl

Para a duração da imobilização da sonda de DNA, a Fig. 7a exibe a resposta do biossensor de DNA lentamente aumentada ao longo das primeiras 1-3 h do tempo de imobilização da sonda de DNA e o aumento abrupto na resposta do biossensor de DNA pode ser visto entre 3 e 6 h de duração da imobilização da sonda de DNA . Isso ocorreu porque um tempo de imobilização mais longo foi necessário para promover uma maior quantidade de sondas de DNA a serem anexadas ao eletrodo modificado com AcMP-AuNP. Em um prolongamento adicional do tempo de imobilização da sonda de DNA, nenhuma alteração perceptível na resposta do biossensor de DNA foi percebida, pois os locais de ligação dos AcMPs imobilizados se ligaram totalmente às sondas de DNA. A resposta do biossensor de DNA aruanã também depende do tempo de hibridização do DNA. O perfil de resposta do biossensor ilustrado na Fig. 7b mostra uma tendência crescente de resposta de corrente de DPV com duração de hibridação de DNA de 10 a 60 min, após o qual a resposta de corrente torna-se quase um platô. Neste estágio, as sondas de DNA imobilizadas no eletrodo hibridizaram totalmente com o cDNA [29].

Efeitos do tempo de imobilização da sonda de DNA ( a ) e tempo de hibridização de DNA ( b ) na resposta do biossensor de DNA de aruanã usando 5 μM de sonda de DNA e cDNA na presença de 1 mM de AQMS a 2 M de força iônica

Observa-se também que o tempo de hibridização do DNA do biossensor de DNA de aruanã fabricado era dependente da temperatura e, como grande vantagem, obtivemos uma resposta de corrente máxima à temperatura ambiente em 30 min (Fig. 8). A baixa temperatura, i.e. 4 ° C, foi necessário um longo tempo para uma reacção de hibridação de DNA completa porque a temperatura fria abrandou a taxa de reacção de hibridação de DNA. Um tempo de hibridização de DNA mais rápido poderia ser alcançado a uma temperatura acima de 25 ° C atribuída à maior taxa de reação de hibridização de DNA ocorrida entre a sonda de DNA imobilizada e o cDNA para formar o DNA duplex em altas temperaturas. No entanto, a alta temperatura pode deformar permanentemente a estrutura em dupla hélice do DNA, e a regeneração da molécula de DNA não é possível mesmo após o reajuste da temperatura para o valor ideal [28, 30].

Efeito da temperatura no tempo de hibridização do DNA do biossensor de DNA de aruanã. A resposta DPV foi medida em tampão K-fosfato 0,05 M (pH 7,0) a 4, 25, 40 e 50 ° C por um período experimental de 5–90 min

Como parte da otimização da resposta do biossensor de DNA de aruanã, o efeito do pH da solução na reação de hibridização de DNA foi investigado. O biossensor de DNA apresentou alteração de corrente desprezível entre pH 5,5 e pH 6,5 devido à protonação da estrutura fosfodiéster do DNA, que reduziu a solubilidade das moléculas de DNA em ambiente aquoso (Fig. 9). Aumento adicional no pH do meio de hibridização de DNA, a resposta do biossensor de DNA de aruanã aumentou abruptamente em pH 7,0, após o qual um declínio acentuado na corrente de DPV foi discernível conforme o ambiente de pH mudou para condição básica devido à desnaturação irreversível do DNA no pH mais alto intervalo [23, 24, 31,32,33]. Uma vez que a resposta DPV máxima foi adquirida em um pH neutro, a próxima avaliação eletroquímica da resposta do biossensor de DNA de aruanã foi mantida em pH 7,0 usando 0,05 M de tampão fosfato de Na.

A resposta DPV do biossensor de DNA de aruanã baseado no composto AcMP-AuNP de carbono modificado SPE entre pH 5,5 e pH 8,0. A medição DPV foi conduzida em tampão K-fosfato 0,05 M (pH 7,0) a 25 ° C e taxa de varredura de 0,5 V / s versus eletrodo de referência Ag / AgCl

O efeito da valência de catiões para a reacção de hibridação de DNA foi realizado utilizando diferentes catiões de sais, e. Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ e Fe ³⁺ iões no tampão de hibridação de DNA. Os íons carregados positivamente poderiam interagir eletrostaticamente com a cadeia fosfodiéster carregada negativamente da molécula de DNA para superar o obstáculo estérico e a repulsão eletrostática entre a sonda de DNA imobilizada e o DNA alvo, facilitando assim o processo de hibridização do DNA [34]. A Figura 10 demonstra que a reação de hibridização de DNA foi favorável na presença de cátions na ordem de Na ⁺ > K ⁺ > Fe ³⁺ > Ca ²⁺ . A presença de Ca ²⁺ e Fe ³⁺ foi observado que íons causam um decréscimo notável na resposta de corrente do biossensor de DNA de aruanã em comparação com Na ⁺ e K ⁺ íons. Esses fenômenos foram atribuídos à formação de fosfato de cálcio moderadamente solúvel e sais de fosfato de ferrum (III) no tampão de hibridização de DNA [22], o que reduziu o conteúdo iônico da solução e causou uma alta repulsão eletrostática entre as moléculas de DNA. Como resultado, a taxa de hibridização do DNA diminuiu e levou a um desempenho ruim do biossensor. A maior resposta do biossensor de DNA foi obtida quando Na ⁺ Os iões foram adicionados ao tampão de fosfato de hibridação de DNA devido ao seu pequeno tamanho e forte afinidade para a ligação fosfodieter de DNA.

O efeito do Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ e Fe ³⁺ íons no tampão de hibridização de DNA (tampão Na-fosfato 0,05 M em pH 7,0) na resposta DPV do biossensor de DNA de aruanã

A concentração de NaCl e tampão fosfato de Na (pH 7,0) também deve ser otimizada para fornecer uma força iônica ideal para o tampão de hibridização. A Figura 11b indica que a força iônica abaixo e acima de 2 M não conseguiu superar a alta repulsão eletrostática entre as fitas de DNA. Cerca de 0,05 M de tampão fosfato de Na (Fig. 11a) e 2 M de NaCl foram encontrados para fornecer a força iônica ideal para o ensaio de DNA alvo de aruanã com desempenho máximo de biossensor. As condições ideais do tampão de hibridização em termos de pH, capacidade do tampão e força iônica permitiriam que a reação de hibridização do DNA ocorresse com o mínimo de impedimento estérico [30].

As tendências de resposta do biossensor de DNA aruanã como a Concentração de tampão fosfato de Na e b força iônica do tampão de hibridização variou de 0,002–0,100 M e 1,52–5,50 M, respectivamente

O biossensor de DNA otimizado foi então usado para a detecção de uma série de concentrações de cDNA de aruanã entre 1,0 × 10 ⁻¹² e 1,0 × 10 ⁻² μM. O biossensor de DNA mostrou uma ampla faixa de resposta linear de 1,0 × 10 ⁻¹⁸ para 1,0 × 10 ⁻⁸ M ( R ² =0,99). O limite de detecção (LOD) obtido em 1,0 × 10 ⁻¹⁸ M foi calculado com base em três vezes o desvio padrão da resposta do biossensor na curva de resposta aproximando LOD dividido pelo declive de calibração linear. O tamanho das partículas homogêneas de AcMP dentro da faixa de micrômetros exibiu uma influência significativa na sensibilidade e reprodutibilidade do biossensor de DNA (RSD =5,6%). A grande área de superfície de ligação dos AcMPs funcionalizados com NAS imobilizados permitiu que um grande número de moléculas de DNA se ligassem covalentemente à superfície do eletrodo, aumentando assim o desempenho analítico do biossensor de DNA em relação à faixa linear dinâmica e limite de detecção do biossensor de DNA de aruanã (Fig. . 12).

The arowana DNA biosensor response curve (a ) and linear calibration range (b ) and the DPV voltammogram (c ) obtained using 1.0 × 10 ⁻¹⁸ to 1.0 × 10 ⁻² μM cDNA at pH 7.0

Determination of Arowana Fish Gender with DNA Biosensor

The developed electrochemical DNA biosensor has been validated with the standard PCR-based method to determine the gender of Asian arowana fish. With the results tabulated in Table 2, both methods provided the same result for the gender determination of arowana fish. This indicates that the proposed DNA biosensor can be used for accurate determination of arowana gender in a simple and fast way.

Conclusions

The electrochemical DNA biosensor developed in this study demonstrated good sensitivity, wide linear response ranges, and low detection limit in the determination of arowana target DNA. In addition, the DNA biosensor showed a good response towards arowana cDNA, which implies that the electrochemical DNA biosensor could be used to successfully detect the arowana DNA segments. The developed arowana DNA biosensor can be further redesigned into a point-of-use device prototype that offers a great potential for the application in the fish culture for early identification of arowana gender and colour, which is economically advantageous in fishery and aquaculture sectors.

Nanohelices de ouro depositadas obliquamente em superfícies nanossedidas preparadas sem litografia Crescimento direto de estruturas ZnO semelhantes a penas por uma técnica de solução fácil para aplicação de detecção de foto