Biossensor Eletroquímico de DNA Ultra-sensível Usando Nanocompósito Acrílico-Ouro para Determinação Rápida de Gênero de Peixe Arowana

Resumo

Este estudo introduz um biossensor eletroquímico de DNA ultra-sensível que identifica o gênero do arowana asiático (Scleropages formosus) com limite de detecção attomolar. O sensor emprega microesferas acrílicas funcionalizadas com grupos succinimida e nanopartículas de ouro coloidal (AcMP-AuNP) imobilizadas em eletrodo de carbono impresso em tela. Uma sonda de DNA aminada é ancorada covalentemente nas AcMPs, e hibridização de DNA alvo de arowana quantificada por voltametria de pulso diferencial (DPV) usando ácido antraquinona-sulfônico como marcador redox. Sob condições otimizadas, o sensor atinge limite de detecção 1,0 × 10⁻¹⁸ M e faixa linear 1,0 × 10⁻¹⁸ – 1,0 × 10⁻⁸ M (R² = 0,99) dentro de uma hora, tornando-o ferramenta leve, custo-efetiva para diagnóstico on-site em piscicultura.

Introdução

O arowana asiático (Scleropages formosus) é espécie de água doce valorizada por seu valor ornamental e significado cultural no Sudeste Asiático e partes da Oceania. Devido à alta demanda de mercado, populações selvagens foram fortemente exploradas, levando à classificação como ameaçada pela CITES e Lista Vermelha IUCN. Determinação precisa de gênero em estágio juvenil é crítica para programas de reprodução e regulação de mercado, mas métodos visuais tradicionais são não confiáveis e demorados, e abordagens PCR convencionais são laboriosas e requerem infraestrutura laboratorial sofisticada.

Avanços recentes em biossensores baseados em nanomateriais oferecem alternativa promissora. Integrando microesferas de polímero acrílico com nanopartículas de ouro, podemos criar plataforma condutiva de alta área superficial que aumenta carregamento de sonda e transferência de elétrons, melhorando sensibilidade e reduzindo tempo de ensaio.

Métodos

Aparelho e Eletrodos

Medidas DPV realizadas em potenciostato Autolab PGSTAT 12 usando eletrodo de carbono impresso em tela (SPE) modificado com AcMPs e AuNPs. Eletrodo auxiliar de platina e eletrodo de referência Ag/AgCl (3,0 M KCl) empregados. Soluções sonificadas em banho Elma S30H para garantir homogeneidade.

Químicos

Reagentes-chave incluíram 2-2-Dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPP), 1,6-Hexanodiol diacrilato (HDDA), n-butil acrilato (nBA), cloreto de Au(III) trihidratado e NAS. Nanopartículas de ouro coloidais sintetizadas conforme Grabar et al. (1995). Sondas de DNA preparadas em tampão K-fosfato 0,05 M (pH 7,0) e hibridizadas em tampão Na-fosfato 0,05 M (pH 7,0) contendo 1,0 mM AQMS e 2,0 M NaCl.

Síntese de Microesfera Acrílica

AcMPs produzidas via fotopolimerização UV iniciada em etapa única de mistura contendo HDDA, nBA, DMPP e NAS em emulsão aquosa. Após 10 min sonicação e 600 s cura UV sob N₂, microesferas coletadas por centrifugação, lavadas três vezes com tampão K-fosfato, e secas ao ar.

Fabricação de Biossensor de DNA Usando Microesferas Acrílicas

Superfície do SPE primeiro revestida por gota com dispersão AcMP 3 mg/mL, depois com AuNPs coloidais 5 mg/mL. Eletrodo modificado incubado em solução 5 µM de sonda de DNA aminada de arowana por 6 h, seguido de enxágue completo. Hibridização com cDNA alvo (5 µM) na presença de 1 mM AQMS e 2 M NaCl prosseguiu por 1 h antes de análise DPV em tampão K-fosfato 0,05 M a temperatura ambiente.

Otimização de Biossensor Eletroquímico de DNA de Arowana

Imobilização de sonda otimizada variando tempos de incubação (1-18 h) e hibridização (10-100 min). Temperatura, pH, força iônica e valência de cátion examinados sistematicamente para maximizar resposta DPV. Condições ótimas: 6 h incubação de sonda, 30 min hibridização a 25 °C, pH 7,0, tampão Na-fosfato 0,05 M, 2 M NaCl, e 1 mM AQMS.

Extração de DNA e Análise de DNA de Arowana

Quinze amostras de tecido de arowana extraídas usando kit QIAquick PCR Purification. DNA genômico amplificado por PCR e verificado em géis agarose 1,5%. Mesmos extratos testados com biossensor; correntes DPV acima de linha de base indicaram DNA masculino, enquanto correntes na linha de base corresponderam a DNA feminino. Significância estatística avaliada usando teste t (95% confiança).

Resultados e Discussão

Imagens MET confirmaram AcMPs esféricas uniformes (Fig. 2) com distribuição de tamanho estreita (Fig. 3). Caracterização eletroquímica do SPE modificado demonstrou processo redox reversível, controlado por difusão, com relação linear entre corrente de pico e raiz quadrada da taxa de varredura (R² = 0,996; Fig. 4). Resposta DPV (Fig. 6) mostrou aumento pronunciado de corrente apenas após hibridização com DNA complementar, confirmando especificidade da sonda.

Estudos de otimização revelaram que imobilização de sonda estabilizou após 6 h, enquanto hibridização atingiu equilíbrio dentro de 30 min a temperatura ambiente (Fig. 7). Temperatura acima de 25 °C acelerou hibridização mas arriscou desnaturação, então 25 °C escolhido como ótimo. Dependência de pH mostrou sinal DPV máximo em pH neutro 7,0; pH menor ou maior reduziu eficiência de hibridização (Fig. 9). Entre cátions testados, Na⁺ proporcionou melhor realce, provavelmente devido a precipitação mínima e blindagem eletrostática favorável (Fig. 10). Análise de força iônica identificou 2 M NaCl e tampão Na-fosfato 0,05 M como tampão de hibridização ótimo (Fig. 11).

Determinação de Gênero de Peixe Arowana com Biossensor de DNA

Quando aplicado a amostras de campo, atribuições de gênero do biossensor corresponderam a resultados de PCR (Tabela 2), confirmando sua confiabilidade para uso rápido, on-site.

Conclusões

O biossensor eletroquímico de DNA desenvolvido oferece sensibilidade excepcional, ampla faixa dinâmica e baixo limite de detecção para DNA de arowana. Sua capacidade de detecção rápida em nível attomolar, combinada com formato leve e descartável, o torna ideal para integração em dispositivos de ponto de uso que podem suportar operações de piscicultura permitindo identificação precoce de gênero e cor.