Desenvolvimento e avaliação de um sistema para a determinação semiquantitativa das propriedades físicas da pele após exposição a nanopartículas de prata

Resumo

Para garantir o uso seguro das nanopartículas de prata (nAgs) em cosméticos, é necessário revelar as propriedades físicas dos nAgs no interior da pele, pois essas propriedades podem mudar durante o processo de absorção percutânea. Neste estudo, objetivamos estabelecer um sistema analítico baseado em espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado de partícula única (sp-ICP-MS) para determinar as propriedades físicas dos nAgs na pele. Em primeiro lugar, otimizamos um método de pré-tratamento para solubilizar as amostras de pele e, em seguida, mostramos que a maioria dos nAgs foi recuperada por tratamento com hidróxido de sódio, permanecendo na forma de partículas. Para separar a pele em epiderme e derme, rastreamos várias condições de irradiação de microondas. A análise sp-ICP-MS indicou que a aplicação de 200 W por 30 s foi ótima, pois essa condição garantiu a separação completa das camadas da pele sem alterar as propriedades físicas da maioria dos nAgs. Finalmente, avaliamos a aplicação in vivo analisando a quantidade, bem como as propriedades físicas de Ag na epiderme, derme e sangue periférico de camundongos após a exposição da pele a nAgs ou Ag ⁺ . A análise subsequente de sp-ICP-MS indicou que os nAgs podem ser absorvidos e distribuídos nas camadas mais profundas na forma ionizada, enquanto o Ag ⁺ foi absorvido e distribuído sem alteração nas propriedades físicas. Este estudo indica que, para obter uma compreensão abrangente da resposta da pele após a exposição a nAgs, é essencial considerar a distribuição e o tamanho das partículas não apenas de nAgs, mas também de Ag ⁺ liberado de nAgs na pele.

Introdução

Avanços tecnológicos recentes em nanotecnologia aceleraram o desenvolvimento de nanopartículas projetadas (ENPs) que são partículas menores que 100 nm. Devido às suas propriedades benéficas, como maior penetração no tecido e reação de superfície, em comparação com materiais micro ou maiores, os ENPs são amplamente utilizados em vários produtos, incluindo cosméticos, alimentos e medicamentos [1,2,3]. Por exemplo, nanopartículas de prata (nAgs), um dos tipos mais comuns de ENP, são incorporadas aos cosméticos por causa de suas propriedades antibacterianas resultantes de uma liberação constante de íons de prata (Ag ⁺ ) [4, 5]. No entanto, as propriedades físico-químicas exclusivas associadas ao pequeno tamanho de partícula dos nAgs podem ser perigosas. Sabe-se que essas partículas podem romper barreiras impenetráveis, como a barreira hematoencefálica, e induzir inflamação [6]. Além disso, alguns estudos relataram que os ENPs podem penetrar na barreira da pele [7,8,9]. Portanto, para determinar a segurança do uso contínuo dessas partículas, é importante entender os efeitos tóxicos associados aos ENPs contendo nAgs, investigando a dinâmica dessas partículas nos tecidos, como a pele.

Para garantir a segurança, é indispensável compreender os possíveis riscos associados ao uso de ENPs, o que envolve os conceitos integrativos de "perigos" (toxicidade potencial) e "condições de exposição". Embora os perigos dos ENPs tenham sido analisados em todo o mundo, apenas alguns estudos examinaram as condições relativas à exposição aos ENPs [10]. Em particular, foi relatado que nAgs e Ag ⁺ podem alterar suas propriedades físicas dentro do corpo. Por exemplo, a ionização de nAgs resulta na formação de nAgs com um tamanho de partícula menor e na liberação de Ag ⁺ [11]. Por outro lado, nAgs com tamanho de partícula pequeno podem ser detectados no epitélio intestinal de ratos após a administração oral de acetato de prata [12]. Além disso, relatamos recentemente que, em comparação com nAgs e Ag ⁺ menores , nAgs maiores são mais facilmente encontrados no leite materno de camundongos em lactação expostos a esses nAgs [13]. Portanto, os nAgs podem alterar suas propriedades físicas no corpo, o que, por sua vez, leva a uma mudança na cinética. Assim, para entender os riscos envolvidos, é necessário avaliar as propriedades físicas, como tamanho de partícula, dessas partículas e fazer a distinção entre essas partículas e os íons no corpo.

A este respeito, aplicamos espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado de partícula única (sp-ICP-MS), que introduz no máximo uma partícula por tempo de permanência no analisador. É um método eficaz que pode ser usado para determinar o tamanho das partículas analisando a intensidade do pico e a concentração das partículas por meio das taxas de pico. Partículas e íons podem ser distinguidos analisando os sinais de pico e de fundo [14]. Otimizamos anteriormente um método de pré-tratamento para sp-ICP-MS em amostras biológicas para determinar semiquantitativamente as propriedades físicas dos ENPs em vários órgãos, como fígado, coração, pulmões, rins e baço [15].

A pele compreende a epiderme, incluindo o estrato córneo (SC), e a derme, contendo vasos sanguíneos, vasos linfáticos e nervos [16]. Portanto, a entrada de ENPs em cada camada da pele pode induzir toxicidade em vários graus. Por exemplo, a distribuição de nanopartículas de dióxido de titânio em células de queratinócitos da pele humana da epiderme pode estimular a produção de espécies reativas de oxigênio [17]. Além disso, em camundongos sem pelos, a exposição dérmica a nanopartículas de dióxido de titânio por 60 dias não só levou a alterações patológicas, como uma derme mais fina devido à toxicidade local, mas também a alterações patológicas no fígado, como necrose de liquefação devido à toxicidade sistêmica que propagação através dos vasos sanguíneos na derme [18]. Além disso, as respostas biológicas em cada camada também podem variar dependendo das propriedades físicas, como tamanho de partícula e diferenças entre partículas e íons [19]. Para entender a segurança do uso de nAgs, é necessário entender as propriedades físicas e a biodistribuição dos nAgs após sua exposição à pele.

Para resolver esse problema específico, é necessária uma abordagem que possa pré-tratar a pele e separar suas camadas sem causar perdas durante a recuperação ou alterações nas propriedades físicas dos ENPs. No entanto, essa abordagem ideal para a pele ainda não foi planejada.

Neste estudo, otimizamos uma abordagem de pré-tratamento que determina semiquantitativamente as propriedades físicas dos nAgs, um modelo ENP, em cada camada da pele via sp-ICP-MS, e subsequentemente avaliamos sua eficácia in vivo.

Métodos

Ratos

Slc:Ratinhos ICR (fêmeas, 8 semanas de idade) foram adquiridos a Japan SLC (Shizuoka, Japão). Os camundongos foram alojados em uma sala com o seguinte ciclo de claro-escuro:luzes acesas às 8h e apagadas às 20h. Alimentos e água foram disponibilizados na forma de pellets de alimentos e um sistema de abastecimento de água localizado no topo da gaiola. Todos os protocolos experimentais foram realizados em condições aprovadas pelo comitê de pesquisa animal da Universidade de Osaka, Japão.

nAgs e Ag ⁺

As suspensões de nAgs capeados com citrato-ligante com diâmetros de 100 nm (nAg100) foram adquiridas na nanoComposix (San Diego, CA, EUA) na forma de dispersões de estoque (1 mg / mL). Nitrato de prata (AgNO ₃ ) foi adquirido na Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japão), também na forma de dispersões de estoque (1 mg / mL). RM8013, usado como um padrão para calcular a eficiência de transporte, foi adquirido do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (Gaithersburg, MD, EUA). Cada tipo de nanopartícula foi sonicada por 10 min antes do uso. Nanopartículas e íons também foram agitados em vórtice por 10 s antes do uso.

Reagentes

Hidróxido de sódio (NaOH, 0,1 mol / L) foi adquirido da Nacalai Tesque Company (Osaka, Japão) e ácido nítrico (HNO ₃ , 70%) foi adquirido da Kanto Kagaku Chemical Industries (Tóquio, Japão). Foi preparada solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.

Otimização de métodos de pré-tratamento

A epiderme e a derme de cada camundongo foram separadas, misturadas com PBS ( w / v proporção de 1:10) e homogeneizado. O homogenato foi misturado com uma solução de nAg100 100 ng / mL. A mistura foi então tratada com um dos seguintes reagentes a uma v / v proporção de 1:1; NaOH 0,1 mol / L, HNO 70% ₃ ou PBS. As amostras foram incubadas por 3 h a 37 ° C e submetidas a sp-ICP-MS.

Separação de pele por irradiação de micro-ondas

Cada rato foi sacrificado com isoflurano (Wako), após o que 2 cm ² (2 cm × 1 cm) amostra de pele dorsal foi excisada com tesoura cirúrgica e pinça. Cuidado especial foi tomado para evitar danos aos tecidos durante o procedimento de excisão. Um forno de micro-ondas (RE-SW-20-H, Sharp, Japão) foi usado para irradiar a pele na frequência de 2450 MHz. Amostras de pele foram colocadas em um prato e colocadas no centro do forno de micro-ondas. De acordo com os requisitos de teste, as amostras de pele foram irradiadas por 10, 30 e 60 s a 200, 600 e 900 W, respectivamente. Após a irradiação, as amostras foram rapidamente removidas e cada epiderme e derme foram rapidamente separadas por raspagem suave com pinças cirúrgicas. Uma solução de 100 ng / mL nAg100 foi usada para a análise da taxa de recuperação e do diâmetro médio do nAg após a irradiação (200 W, 30 s).

Administração transdérmica de nAg100 e Ag ⁺

Camundongos Slc:ICR fêmeas de nove semanas de idade foram divididos em 6 grupos de 3 camundongos por grupo, de acordo com seu peso corporal. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano. O cabelo nas costas foi raspado com um aparador de cabelo (Panasonic®, Osaka, Japão) e uma lâmina de barbear (Gillette®, Alemanha). Em seguida, nAg100 e Ag ⁺ (20 μg / cm ² ) foram aplicados diretamente a uma área de superfície de 2,25 cm ² (1,5 cm × 1,5 cm) de pele dorsal e firmemente coberta com filme plástico não absorvente. Um pedaço de gaze do mesmo tamanho foi colocado sobre o filme plástico. Uma bandagem elástica autoadesiva foi usada para cobrir a gaze envolvendo a pele e a pele foi deixada coberta por 5 dias.

Pré-tratamento de amostras de pele e sangue

Cinco dias após o tratamento, sangue periférico do plexo venoso retro-orbital e pele dorsal foi coletado para análise. Em seguida, 2,25 cm ² (1,5 cm x 1,5 cm) as amostras de pele dorsal foram excisadas com tesouras e pinças cirúrgicas. Cuidado especial foi tomado para evitar danos aos tecidos durante a excisão. As camadas SC foram removidas sequencialmente com pedaços de fita adesiva de 2 cm (Scotch®, 3M), antes de separar a epiderme da derme. Os pedaços de fita adesiva foram pressionados na área tratada da pele dorsal, após o que foi aplicada pressão constante por 10 s. Vinte pedaços de fita adesiva foram necessários para remover todo o SC de cada rato. Em seguida, a derme e a epiderme foram separadas com irradiação de microondas e homogeneizadas com PBS ( w / v proporção de 1:10). O sangue coletado, bem como homogenatos de derme e epiderme, foram tratados com NaOH 0,1 mol / L a v / v proporção de 1:1 e incubados separadamente por 3 h a 37 ° C. Após a incubação, a massa bruta de prata nas misturas de sangue, epiderme e derme foi analisada com espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS). Quantificação e avaliação das propriedades físicas de nAgs e Ag ⁺ foram realizados usando sp-ICP-MS.

Medição da massa bruta da prata

Para medir a concentração total de prata nas amostras de sangue, SC, epiderme e derme, foi usado um sistema Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As condições sob as quais a análise foi realizada foram as seguintes:RF power 1550 W; gás portador 1,05 L / min Ar; e tempo de permanência de 100 ms. As medições foram repetidas três vezes no modo MS. Ródio foi usado como o padrão interno para Ag. Os elementos alvo das análises ICP-MS foram ¹⁰³ Rh e ¹⁰⁷ Ag. As soluções padrão de ag e ródio foram obtidas na Wako.

sp-ICP-MS Análise e cálculo

Um Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) foi usado para a análise sp-ICP-MS. As condições de análise foram as seguintes:potência RF 1550 W; gás portador 1,05 L / min Ar; tempo de permanência 10 ms; e tempo de análise 30 s. Ferramentas de cálculo de partícula única - RIKILT publicado pela Wagenen Food Safety Research (Wageningen University, Wageningen, Holanda) - foram usadas para calcular o tamanho da partícula [20].

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism versão 5.0 para Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). A significância estatística foi estabelecida em P <0,05.

Resultados e discussão

Estratégias para construir um método para determinar a quantidade e as propriedades físicas de nAgs em cada camada de pele

A fim de determinar a quantidade e as propriedades físicas de nAg em cada camada de pele, é necessário solubilizar completamente as amostras de pele e preparar amostras passíveis de análise de sp-ICP-MS. Também é essencial separar a epiderme e a derme, sem perdas durante a recuperação ou alterações nas propriedades físicas do nAg, pois o nAg não absorvido por via transdérmica pode, às vezes, ser eliminado durante a remoção do SC por meio de fita adesiva [21].

No que diz respeito à solubilização das amostras de pele, relatamos anteriormente que o pré-tratamento com NaOH é uma técnica ideal para a quantificação, bem como para a análise das propriedades físicas do nAg em tecidos animais, como fígado, coração, pulmões, rins e baço [16]. Portanto, o pré-tratamento com NaOH foi aplicado às amostras de pele usadas neste estudo.

O tratamento hidrotérmico, que leva ao amolecimento das fibras de colágeno e à digestão enzimática aprimorada, que promove a separação na junção derme-epidérmica (EDJ), é amplamente utilizado para separar a pele nas camadas epidérmica e dérmica [22]. Embora esses tratamentos separem com eficiência as camadas da pele, o nAg nas camadas pode ser ionizado em uma solução aquosa, resultando em uma alteração em suas propriedades físicas. É relatado que um pulso curto de irradiação de microondas permite que a pele seja separada em camadas epidérmicas e dérmicas por meio da geração de calor que interrompe o EDJ [23, 24]. Portanto, aplicamos irradiação de microondas sem incubação à solução por um curto período de tempo.

Coletivamente, propusemos uma estratégia (ilustrada na Figura 1), que foi validada analisando as taxas de recuperação e alterações nas propriedades físicas do nAg em cada camada da pele.

Otimização de métodos de pré-tratamento para detecção de nAg100 na epiderme e derme

Referimo-nos ao nosso estudo anterior para otimizar um método de pré-tratamento para solubilizar amostras de pele. Ishizaka et al. [15] relataram que, entre vários tipos de reagentes de solubilização, como NaOH e HNO _3, O pré-tratamento com NaOH foi ótimo. Assim, testamos HNO ₃ e NaOH como reagentes de solubilização ácida e alcalina, respectivamente. Os homogenatos de epiderme e derme separados das amostras de pele de camundongo foram misturados com nAg100 para obter uma concentração final de Ag de 100 ng / mL seguido por tratamento com cada reagente de solubilização a 37 ° C. Em primeiro lugar, avaliamos a taxa de recuperação do Ag após o tratamento com esses reagentes. A análise de ICP-MS indicou que uma taxa de recuperação de quase 100% foi alcançada por NaOH e HNO ₃ tratamento apenas (Fig. 2a). A seguir, para avaliar as mudanças nas propriedades físicas em função de cada tratamento, analisamos as concentrações de recuperação de cada partícula e íon. A análise de sp-ICP-MS indicou que nAg100 foi quase completamente ionizado por HNO ₃ . Isso sugeriu que HNO _3, como o reagente ácido, dissolveu as partículas e as converteu em íons, conforme também relatado em estudo anterior [15]. Em contraste, a maioria do nAg100 tratado com NaOH permaneceu como partículas, e não como íons (Fig. 2b). Assim, o NaOH permitiu que a maioria do nAg100 permanecesse na forma de partícula. Finalmente, as distribuições dos diâmetros das partículas foram avaliadas a fim de analisar as propriedades físicas em detalhes. HNO ₃ o tratamento alterou o diâmetro médio das partículas de 100 nm para 40 nm, o que correspondeu à ionização do nAg100. Por outro lado, o diâmetro médio das partículas após o tratamento com NaOH foi de aproximadamente 100 nm, correspondendo ao tamanho inicial das partículas (Fig. 2c). Isso sugeriu que o pré-tratamento com NaOH foi ideal para detectar nAg100 na pele de camundongo.

Separação de amostras de pele em epiderme e derme por irradiação de micro-ondas e avaliação das taxas de recuperação e alterações nas propriedades físicas de nAgs

A fim de separar as amostras de pele em camadas epidérmicas e dérmicas, aplicamos diferentes condições de irradiação de micro-ondas que foram relevantes para nosso estudo e relatamos anteriormente como um sucesso [24] e comparamos seu desempenho com relação à separabilidade da pele e mudanças no propriedades físicas. Foi observado que nas condições de 200 W por 10 s, 600 W por 30 s, 600 W por 60 s, 950 W por 30 s e 950 W por 60 s, a pele não se separou em camadas epidérmicas e dérmicas ( Fig. 3a). Além disso, a pele foi apenas parcialmente separada em camadas epidérmicas e dérmicas nas condições de 200 W por 60 s, 600 W por 10 s e 950 W por 10 s. Em contraste, a pele só foi completamente separada em camadas epidérmicas e dérmicas após irradiação a 200 W por 30 s. Esses resultados indicam que a irradiação a 200 W por 30 s é ideal para a separação da camada de pele.

A fim de verificar se essa irradiação de microondas a 200 W por 30 s afetou as propriedades físicas do nAg100, determinamos as propriedades físicas do Ag nas camadas epidérmicas e dérmicas. Os homogenatos de epiderme e derme, cada um misturado com 100 ng / mL de nAg100, respectivamente, foram lisados com NaOH e irradiados a 200 W por 30 s. A análise de Sp-ICP-MS revelou que a maioria do nAg100 tratado com irradiação de micro-ondas permaneceu como partículas, e o mesmo aconteceu com o grupo não tratado (Fig. 3b). A fim de analisar as propriedades físicas em detalhes, as distribuições dos diâmetros das partículas também foram avaliadas. A partícula média tinha quase 100 nm de diâmetro, que correspondia ao tamanho inicial da partícula (Fig. 3c). Esses achados sugerem que a irradiação de microondas de amostras de pele a 200 W por 30 s é uma abordagem promissora para separar a pele com eficiência em camadas epidérmicas e dérmicas, sem alterar as propriedades físicas do nAg100.

Coletivamente, esses resultados indicam que desenvolvemos com sucesso um sistema para determinar semiquantitativamente as propriedades físicas do nAg100 em cada camada da pele. Especificamente, o método envolve o seguinte:(i) remoção de nAg100 não absorvido por via transdérmica, removendo o SC com o método de remoção de fita [21]; (ii) separação da pele em camadas epidérmicas e dérmicas por meio de irradiação de microondas; (iii) solubilização da epiderme e derme com tratamento com NaOH; e (iv) a determinação semiquantitativa das propriedades físicas do Ag em cada camada da pele usando sp-ICP-MS.

Avaliação prática determinando a quantidade e as propriedades físicas de nAg100 e Ag ⁺ em camadas de pele de mouse in vivo

A fim de avaliar a aplicação prática desta abordagem, analisamos a quantidade e as propriedades físicas do Ag na epiderme e derme, bem como no sangue periférico, após a pele do camundongo ter sido exposta a nAg100 e Ag ⁺ na Vivo. Cinco dias após a exposição, separamos a pele em epiderme e derme em condições otimizadas para irradiação de microondas e solubilizamos com NaOH, conforme descrito na seção anterior. A análise de ICP-MS indicou que o Ag estava presente em todos os tecidos (como epiderme, derme e sangue) de todos os grupos. Na derme e no sangue, Ag no Ag ⁺ -grupo exposto tendeu a ser aumentado, em comparação com o grupo exposto a nAg100 (Fig. 4a). Os dados sugeriram que, embora as formas de íons e partículas fossem absorvidas por via percutânea e distribuídas como relatado anteriormente [8, 9], era mais fácil para as formas iônicas se infiltrarem nas camadas profundas do tecido do que para as formas de partículas.

Em seguida, avaliamos a proporção de nAg e Ag ⁺ em cada amostra. Na Idade ⁺ -grupo exposto, quase todo o Ag foi detectado na forma iônica na epiderme, derme e sangue, indicando que Ag ⁺ foi absorvida percutaneamente e distribuída sem alteração nas propriedades físicas. Por outro lado, no grupo exposto ao nAg100, aproximadamente 70% do Ag na epiderme e derme estava presente na forma de partícula, enquanto o Ag restante estava ionizado. Além disso, o Ag detectado no sangue periférico estava quase totalmente ionizado e a forma de partícula dificilmente foi detectada (Fig. 4b). Por fim, avaliamos o tamanho das partículas nas camadas epidérmicas e dérmicas, onde foram detectadas principalmente formas de partículas. A análise de sp-ICP-MS revelou que os tamanhos de partícula detectados em ambas as camadas foram de aproximadamente 70–80 nm, correspondendo à taxa na qual nAg100 é ionizado (Fig. 4c). Esses dados sugerem que, quando a pele é exposta ao nAg100, ele pode ser absorvido e distribuído ao ser ionizado.

Como relatado anteriormente, os ligantes de superfície das nanopartículas afetaram sua absorção na pele [25, 26]. Por exemplo, nanopartículas de ouro modificadas com um grupo amino foram absorvidas pelo camundongo e pela pele humana em maior extensão do que nanopartículas de ouro modificadas com grupo carboxila em experimentos ex vivo [25]. Além disso, a análise da dinâmica molecular indicou que a capacidade de penetração na pele diminuiu de nanopartículas de ouro neutras hidrofóbicas para catiônicas e aniônicas nessa ordem [26]. A este respeito, foi inferido neste estudo que o nAg100 tinha menos probabilidade de penetrar no SC na epiderme, a barreira cutânea inicial, porque o nAg100 foi modificado com citrato e carregado negativamente. Portanto, a razão para as partículas serem observadas na derme e no sangue pode ser que as partículas penetraram tanto pelos poros quanto pela epiderme.

Também foi relatado que a penetrabilidade das nanopartículas de ouro foi melhorada pela modificação com peptídeos de penetração celular, como Tat e R7 [25]. Portanto, no futuro, modificações semelhantes podem ser consideradas para nAgs a fim de aplicá-los mais profundamente na pele. Além disso, pode ser necessário reduzir o tamanho dos nAgs, pois o efeito da modificação da superfície é maior com uma área de superfície específica maior.

Conclusões

Neste estudo, desenvolvemos uma abordagem de pré-tratamento para determinar semiquantitativamente as propriedades físicas de nAg100 em cada camada de pele com sp-ICP-MS. Usando essa abordagem, mostramos que a exposição da pele ao nAg100 pode fazer com que o nAg100 seja ionizado, absorvido e distribuído em camadas mais profundas. Portanto, para compreender as respostas biológicas ou toxicidade associada à exposição da pele ao nAg100, pode ser necessário considerar não apenas a distribuição do nAg100 e seu tamanho de partícula, mas também o do Ag ⁺ do nAg100, que se funde nos tecidos da pele. Portanto, essa abordagem mostra-se promissora como uma técnica fundamental que pode ser usada para análise de risco.

Disponibilidade de dados e materiais

O compartilhamento de dados não se aplica a este artigo, pois nenhum conjunto de dados foi gerado ou analisado durante o estudo atual.

Abreviações

ENPs:: Nanopartículas projetadas
nAg ::: Nanopartícula de prata
Ag ⁺ :: Íons de prata
sp-ICP-MS:: Espectrometria de massa de plasma de partícula única indutivamente acoplada
SC:: Estrato córneo
nAg100:: Nanopartícula de prata com diâmetro de 100 nm
AgNO ₃ :: Nitrato de prata
NaOH:: Hidróxido de sódio
HNO ₃ :: Ácido nítrico
PBS:: Salina tamponada com fosfato
ICP-MS:: Espectrometria de massa com Plasma indutivamente acoplado
EDJ:: Junção epidérmico-dérmica

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