Nanogéis Baseados em PNIPAM Sensíveis a Temperatura e pH para Liberação Controlada Dupla de β-Lapachona

Resumo

Nanogéis de poli-N-isopropil acrilamida (PNIPAM) foram copolimerizados com ácido acrílico (AAc) para ajustar a temperatura crítica de solução inferior (LCST). Os nanogéis PNIPAM-co-AAc resultantes exibem duas transições de fase de volume distintas, com o LCST aumentando conforme o teor de AAc aumenta. Quando carregados com β-lapachona (β-LP), a liberação do fármaco é governada tanto por temperatura quanto por pH, e é fortemente influenciada pela razão de AAc. Notavelmente, a formulação PNIPAM-co-AAc20 retém <10% de liberação do fármaco em pH ácido-neutro e temperatura corporal, enquanto libera >70% em pH básico. Esses achados demonstram que nanogéis de PNIPAM sensíveis a temperatura e pH são carreadores promissores para liberação de fármacos específica do intestino via administração oral.

Introdução

Nanocarreadores sensíveis a estímulos são cada vez mais empregados em liberação de fármacos, imagem e diagnósticos. Entre os gatilhos usados — pH, temperatura, redox, campo magnético, luz — temperatura e pH permanecem os mais amplamente explorados para liberação controlada. PNIPAM, um polímero termossensível, colapsa acima de seu LCST (~32 °C) devido a interações hidrofóbicas, enquanto grupos carboxila desprotonados no AAc introduzem repulsão eletrostática adicional que desloca o LCST para cima. A copolimerização de PNIPAM com AAc oferece portanto uma plataforma ajustável que pode responder tanto a temperatura quanto a pH. β-Lapachona, um agente anticancerígeno natural, tem janela terapêutica limitada devido ao seu metabolismo rápido e toxicidade fora do alvo; encapsulação em nanogéis responsivos pode mitigar esses inconvenientes. Neste estudo, relatamos a síntese de nanogéis PNIPAM-co-AAc com teor variável de AAc, seu comportamento de liberação de fármaco de duplo estímulo e sua eficácia citotóxica em células fibroblásticas.

Métodos

Materiais

NIPAM (97%, Sigma-Aldrich), N,N'-metilenobisacrilamida (MBA), AAc, água destilada, EtOH, persulfato de potássio (KPS, 98%, Dae Jung), β-LP (Produtos Naturais) e PBS eram grau analítico e usados como recebidos.

Síntese de Nanogéis PNIPAM-co-AAc

Em um balão de 500 mL, 2,26 g de NIPAM, 0,154 g de MBA e 0-0,145 g de AAc foram dissolvidos em 200 mL de água a 75 °C. Após purga com nitrogênio, 37,5 mg de KPS foi adicionado e a mistura foi refluxada por 10 min, produzindo solução turva. O polímero foi dialisado (12-14 kDa) por 7 dias, congelado em nitrogênio líquido e liofilizado por 3 dias para obter nanogéis secos (PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10, PNIPAM-co-AAc20).

Carregamento de β-LP

1 mg de nanogel seco foi dissolvido em 1 mL de EtOH, e 0,1 mg de β-LP foi adicionado. A mistura foi agitada durante a noite no escuro, então dialisada (6-8 kDa), congelada e liofilizada. Os nanogéis carregados com β-LP resultantes foram armazenados a 4 °C.

Caracterização

Morfologia foi examinada por MET (200 kV) e MEV de emissão de campo (15 kV). Espectros de FT-IR foram registrados em espectrômetro Nicolet 6700. Carregamento e liberação do fármaco foram quantificados por espectroscopia UV-Vis (200-800 nm). LCST foi determinado por espalhamento dinâmico de luz (DLS) em incrementos de 1 °C de 30 a 50 °C.

Estudos de Liberação do Fármaco

10 mL de nanogéis carregados com β-LP foram colocados em tubos de diálise de 3,5 kDa e incubados a 24 °C e 37 °C em PBS a pH 2, 4, 7,4 e 8,0. Em pontos de tempo especificados (0-12 h), alíquotas de 2 mL foram retiradas e analisadas por UV-Vis. Liberação cumulativa foi calculada relativa ao total de β-LP carregado.

Ensaios de Viabilidade Celular

Fibroblastos NIH3T3 (2×10⁴ células/poço) foram tratados com β-LP livre, PNIPAM-co-AAc5-β-LP ou PNIPAM-co-AAc20-β-LP a 0-20 µg/mL. Após 3 h, ensaio MTT (595 nm) e coloração LIVE/DEAD® foram realizados para avaliar citotoxicidade.

Resultados e Discussão

Preparação e Morfologia

Imagens de MET e MEV (Fig. 1) revelaram nanogéis monodispersos com diâmetros médios de ~250 nm para PNIPAM-co-AAc5. Potenciais zeta diminuíram de -13,6 mV (PNIPAM) para -23,6 mV (PNIPAM-co-AAc20), refletindo aumento de grupos carboxila superficiais.

Comportamento Sensível à Temperatura

Medidas de DLS (Fig. 2) mostraram duas transições distintas de inchamento-colapso. A primeira transição iniciou em ~30 °C, e a segunda apareceu perto de 40 °C, deslocando-se para 45 °C para PNIPAM-co-AAc20. Assim, LCST aumenta com teor de AAc, consistente com relatos prévios.

Liberação de Fármaco de Duplo Estímulo

A 37 °C, PNIPAM-co-AAc20 liberou apenas ~61% de β-LP dentro de 6 h, enquanto PNIPAM e PNIPAM-co-AAc5 liberaram ~80%. Em pH 8,0, a liberação de PNIPAM-co-AAc20 aumentou ~10% comparado a pH neutro ou ácido (Fig. 3). Esses resultados confirmam que a liberação do fármaco é sinergicamente aumentada por pH básico e temperatura elevada.

Citotoxicidade In Vitro

β-LP livre reduziu a viabilidade celular mais que as formulações de nanogel. PNIPAM-co-AAc20 exibiu maior viabilidade celular a 20 µg/mL, correlacionando-se com sua menor liberação do fármaco a 37 °C. Coloração live/dead (Fig. 4) mostrou citotoxicidade pronunciada para PNIPAM-co-AAc5-β-LP a 3 h, enquanto PNIPAM-co-AAc20-β-LP permaneceu amplamente não tóxico até 6 h em pH 8,0, onde morte celular sinérgica foi observada.

Conclusões

Projetamos com sucesso nanogéis PNIPAM-co-AAc cujo LCST pode ser ajustado pelo teor de AAc. A formulação de alto AAc (20%) exibe liberação mínima de β-LP em temperatura fisiológica mas libera o fármaco eficientemente em pH básico, espelhando o ambiente do intestino delgado. Esses nanogéis responsivos a duplo estímulo representam portanto uma plataforma atraente para administração oral de β-lapachona direcionada ao intestino.

Abreviações

AAc

Ácido acrílico

DLS

Espalhamento dinâmico de luz

MEV-CE

Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo

FT-IR

Espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier

KPS

Persulfato de potássio

LCST

Temperatura crítica de solução inferior

MBA

N,N'-metilenobisacrilamida

PNIPAM

Poli-N-isopropil acrilamida

MET

Microscopia eletrônica de transmissão

β-LP

β-Lapachona

Figuras

Figura 1. Imagens de MET (a) e MEV (b) de nanogéis PNIPAM-co-AAc5. (c) Transição sol-gel a 30 °C. (d) Potencial zeta vs. teor de AAc. (e) Diâmetro hidrodinâmico a 30 °C e 50 °C.

Figura 2. Espectros de FT-IR de PNIPAM com 0-20% AAc.

Figura 3. Dependência da temperatura do diâmetro hidrodinâmico para PNIPAM e derivados PNIPAM-co-AAc a pH 7,4.

Figura 4. Liberação cumulativa de β-LP de PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 e PNIPAM-co-AAc20 a 24 °C e 37 °C (pH 7,4).

Figura 5. Liberação de β-LP de PNIPAM-co-AAc20 a pH 2, 4, 7,4 e 8,0.

Figura 6. Atividade anti-proliferativa de β-LP e nanogéis carregados com β-LP em células NIH3T3 após 3 h a 37 °C.

Figura 7. Coloração Live/Dead de células NIH3T3 tratadas com β-LP, PNIPAM-co-AAc5-β-LP e PNIPAM-co-AAc20-β-LP (pH 7,4 e pH 8,0).