Restaurando miR-133a-3p ou Reduzindo PSAT1 Limita Aneurisma Intracraniano por Danos Endoteliais Inibindo Via GSK3β/β-Catenina

Resumo

O papel funcional do microRNA-133a-3p (miR-133a-3p) no aneurisma intracraniano (AI) não é claro. Este estudo investigou o papel regulador do miR-133a-3p na regulação do AI induzido por lesão endotelial vascular através da via de sinalização fosfoserina aminotransferase 1 (PSAT1)/glicogênio sintase quinase 3β (GSK3β)/β-catenina. Tecidos de arteríolas intracranianas normais e de AI foram coletados de pacientes com trauma cerebral e AI. A expressão de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β e β-catenina nos tecidos foi determinada por RT-qPCR e western blot. Células endoteliais (CEs) de AI humano foram cultivadas e tratadas com mimético de miR-133a-3p e si-PSAT1 para determinar suas funções em migração, apoptose e proliferação de CEs. A expressão de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenina, Ki-67, CiclinaD1, Bax e Bcl-2 nas CEs foi testada por RT-qPCR ou western blot. Além disso, modelo de rato de AI foi estabelecido para detectar alterações patológicas e expressão de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenina, VEGF e MMP-9 em tecidos de AI in vivo. A expressão de miR-133a-3p relacionou-se com número e tamanho de AI. A expressão de miR-133a-3p estava diminuída e a de PSAT1, GSK3β e β-catenina aumentada no AI. A restauração do miR-133a-3p e depleção de PSAT1 aliviaram alterações patológicas; reduziram expressão de PSAT1, GSK3β e β-catenina no AI; suprimiram apoptose e avançaram proliferação e migração de CEs de AI, além de reduzir expressão de VEGF e MMP-9 em tecidos de AI in vivo. Nosso estudo sugere que a superexpressão de miR-133a-3p ou downregulação de PSAT1 restringem danos a células endoteliais e avançam proliferação endotelial via inibição da via GSK3β/β-catenina no AI. O miR-133a-3p pode ser um potencial marcador candidato e alvo terapêutico para AI.

Apresentação da Hipótese

Neste estudo, especulamos que o eixo miR-133a-3p/PSAT1 pode afetar o AI induzido por dano de células endoteliais através da modulação da via GSK3β/β-catenina.

Teste da Hipótese

Para verificar esta hipótese, coletamos amostras clínicas, células endoteliais (CEs) de AI humano e estabelecemos modelos de rato de AI para elucidar as funções de miR-133a-3p e PSAT1 no processo de AI.

Implicações da Hipótese

Nosso estudo confirma a hipótese de que a superexpressão de miR-133a-3p ou downregulação de PSAT1 restringem danos a células endoteliais e avançam proliferação endotelial via inibição da via GSK3β/β-catenina no AI. Estes achados fornecem nova visão para uma nova terapia alvo para AI.

Introdução

O aneurisma intracraniano (AI) é um distúrbio cerebrovascular caracterizado por artéria anormalmente abaulada no cérebro e hemorragia subaracnoide (HSA) causada pela ruptura do AI, acompanhada de alta fatalidade e morbidade [1]. Como doença destrutiva, a patogênese do AI não foi esclarecida [2]. O AI é uma forma familiar rara, mas geralmente considera-se resultado de lesão vascular adquirida causada por hipertensão, tabagismo e outros fatores de risco tradicionais [3]. Embolização endovascular ou clipe microcirúrgico têm sido utilizados para prevenir ruptura futura de aneurisma não rompido em pacientes com alto risco [4]. Embora progresso significativo tenha sido feito na cirurgia de AI, recuperação pós-operatória ruim ainda ocorre [5]. A situação difícil do tratamento de AI torna necessário explorar mais o mecanismo e encontrar nova estratégia terapêutica.

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes que modulam expressão de genes-alvo via inibição da tradução no nível pós-transcricional ou mediação da degradação de mRNA [6]. Revelou-se que miR-133a-3p atua como inibidor tumoral em várias neoplasias malignas e sua superexpressão inibe crescimento de células de câncer colorretal (CCR) [7]. Estudo anterior mostrou que, ao bloquear glutaminólise mediada por autofagia, miR-133a-3p suprime metástase e crescimento de câncer gástrico [8]. Também, miR-133a-3p participa na regulação do desenvolvimento cardíaco e hipertrofia cardíaca [9]. Estudo demonstrou que upregulação de miR-195-5p declina angiogênese e resistência à cisplatina em câncer ovariano via supressão da via de sinalização GSK3β/β-catenina dependente de fosfoserina aminotransferase 1 (PSAT1) [10]. Outro estudo relatou que miR-365 reprime invasão e crescimento de carcinoma espinocelular esofágico (CECE) através da modulação de PSAT1 [11]. PSAT1 é enzima implicada na biossíntese de serina; originalmente purificada de cérebros de ovelha e presente em altos níveis em muitos tecidos [12]. Documentou-se que PSAT1 medeia progressão do ciclo celular em câncer de mama através da modulação da via GSK3β/β-catenina [13]. Liu et al. também apontam que PSAT1 exerce função no desenvolvimento de CECE e prevê sobrevivência ruim; portanto, pode ser alvo promissor para terapêutica anticancerígena [14]. Dadas as análises acima, este estudo esperava contribuir para nova abordagem sobre o papel funcional do eixo miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-catenina no AI.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional do Primeiro Hospital de Ensino da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Tianjin. Todos os participantes assinaram termo de consentimento informado. Todos os experimentos com animais seguiram o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório por Comitês Internacionais.

Sujeitos do Estudo

De janeiro 2016 a março 2018, casos de HSA causada por AI tratados na neurocirurgia do Primeiro Hospital de Ensino da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Tianjin foram selecionados. Amostras patológicas de 75 casos de AI obtidas por microcirurgia foram reunidas e classificadas como grupo AI, incluindo 29 homens e 46 mulheres com 31-55 anos, idade média 44,98 ± 6,79 anos. Pacientes com trauma cerebral tratados no mesmo período foram selecionados como grupo controle. Também 75 casos de tecidos normais de arteríolas intracranianas foram coletados por cirurgia traumática ou descompressão interna, incluindo 43 homens e 32 mulheres com 34-56 anos, idade média 48,14 ± 8,68 anos. Pacientes com histórico de hipertensão, diabetes ou tumores foram excluídos. Não houve diferença marcante em gênero e idade entre grupos (ambos P > 0,05).

Tratamento e Preservação de Amostras

Após ressecção cirúrgica, algumas amostras dos dois grupos foram fixadas com formaldeído, desidratadas com álcool gradiente de baixa para alta concentração e incluídas em parafina. Então, as amostras foram fatiadas para coloração hematoxilina-eosina (HE) e imuno-histoquímica. Algumas amostras foram rapidamente colocadas em tanques de nitrogênio líquido e transferidas para freezer a -80 °C para western blot e RT-qPCR. Algumas foram fixadas com glutaraldeído para microscopia eletrônica, e outras para isolamento de CEs.

Observação por Microscopia Eletrônica

Amostras fixadas com 3% glutaraldeído, depois re-fixadas com 1% tetróxido de ósmio. Desidratadas com acetona, incluídas em Epon812, fatiadas em secções semifinas de 3 μm. Por fim, coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo e observadas por microscópio eletrônico de transmissão H-600IV (Hitachi, Tóquio, Japão).

Coloração HE

Secções de parafina preparadas foram assadas a 60 °C por 30 min. Após etapas acima, fatias de tecido foram fixadas em xileno, desidratadas com álcool absoluto gradiente e limpas com tampão fosfato salino (PBS). Fatias coradas com hematoxilina, tratadas em amônia por alguns segundos, coradas com eosina por 2 min, desidratadas e clareadas. Então, fatias gotejadas com goma neutra e seladas com lamínula. Finalmente, microscópio (Nikon, Tóquio, Japão) adotado para observação e registro.

Coloração Imuno-histoquímica

Kit de imuno-histoquímica da Zymed Laboratories (San Francisco, CA, EUA). Fatias de parafina desparafinadas e hidratadas, imersas em solução de xileno por 5 min × 3 vezes. Fatias colocadas em álcool absoluto 100% por 3 min × 2 vezes e depois em álcool 95-75% por 3 min cada. Após desparafinação, fatias incubadas com 3% peróxido de hidrogênio por 15 min para eliminar atividade de peroxidase endógena. Fatias gotejadas com solução de bloqueio e incubadas com soro de cabra normal por 15 min, depois sondadas com anticorpo primário contra metaloproteinase de matriz (MMP)-9 (5 μg/mL) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (1:250, Abcam, Cambridge, MA, EUA) (PBS para controle negativo (NC)) e incubadas por 1-2 h. Fatias re-sondadas com solução de anticorpo secundário biotinilado por 30-60 min. Fatias adicionadas com fluido de trabalho streptavidina/peroxidase marcado por peroxidase de raiz-forte, gotejadas com solução de diaminobenzidina (DAB) recém-preparada, contracoradas e bloqueadas. Imagem adquirida por sistema de imagem Nikon SPOT FlexTM. Área de expressão de proteínas MMP-9 e VEGF medida por software de análise quantitativa imuno-histoquímica. Cinco campos de alta potência detectados aleatoriamente na área de acúmulo de células positivas em cada amostra, e a absorbância média de cada tela usada como valor médio para análise estatística.

Isolamento e Cultura de CEs

CEs isoladas de tecidos de arteríolas intracranianas normais e de AI e cultivadas. Tecido fatiado em fragmentos de 3 mm² e incubado por 25 min em 0,1% colagenase B/0,1% dispase (Roche, Basileia, Suíça). Tecido destacado, triturado por 2 min com pipeta de 2 mL, filtrado por coador de 100-µm (BD Biosciences, NJ, EUA) para isolar CEs. Suspensão celular centrifugada e re-suspensa em meio de cultura MV2 contendo fatores de crescimento e 20% soro fetal bovino (PromoCell, Heidelberg, Alemanha). Células semeadas em pratos revestidos com fibronectina (Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, EUA) com densidade de 10⁴ células/cm² (1 μg/cm²) e cultivadas por 1 dia com 5% CO₂. No dia seguinte, células lavadas com PBS para remover células não aderidas e colocadas em meio fresco. Ao atingir ~80-100% confluência, culturas expostas a imunoseparação por contas revestidas com Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, UK) (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Hampshire, UK) para obter CEs puras. CEs ligadas às contas revestidas com lectina coletadas com concentrador de partículas magnéticas enquanto células não ligadas removidas via lavagem com meio basal duas vezes. Células UEA-positivas re-suspensas em meio de cultura e semeadas em pratos revestidos com fibronectina para melhorar adesão e crescimento. Culturas tornaram-se confluentes em 4-6 dias.

Identificação de CEs

CEs identificadas por coloração imunocitoquímica com anticorpo de superfície celular CD31 e antígeno relacionado a fator VII. Células limpas duas vezes com PBS, fixadas com 4% paraformaldeído, incubadas com 3% H₂O₂ por 10-15 min para eliminar atividade de peroxidase endógena e depois incubadas com 0,1% Triton X-100 por 10 min para permeabilizar células. Células gotejadas com anticorpo primário específico: Fator VII (1:200), CD31 (1:400, Roche, Basileia, Suíça) e incubadas a 4 °C durante a noite. Então, células gotejadas com imunoglobulina G (1:50) marcada com anticorpo secundário peroxidase de raiz-forte. Células incubadas a 37 °C por 45 min e desenvolvidas por DAB evitando luz por 4 min. Desenvolvimento de cor terminado com água destilada e fotografia observada sob microscópio. Células observadas sob microscópio de fluorescência invertido de contraste de fase, células positivas e número total contados aleatoriamente de 10 campos visuais. Taxa de células com coloração positiva = (número de células positivas/número total de células) × 100%. Grupo NC correspondente estabelecido e anticorpo primário substituído por PBS, demais etapas realizadas como acima.

Agrupamento e Transfecção de Células

Para estudar efeitos entre miR-133a-3p e PSAT1 em CEs de AI, CEs agrupadas em: grupo controle (CEs vasculares normais sem transfecção), grupo AI (CEs vasculares de AI sem transfecção), grupo mimético NC (transfectado com mimético NC de miR-133a-3p), grupo mimético miR-133a-3p (transfectado com mimético miR-133a-3p), grupo si-NC (transfectado com si-PSAT1 NC), grupo si-PSAT1 (transfectado com si-PSAT1), e grupo mimético miR-133a-3p + superexpressão (oe)-PSAT1 (transfectado com mimético miR-133a-3p e oe-PSAT1). Entre eles, mimético NC, mimético miR-133a-3p, si-PSAT1, si-NC e oe-PSAT1 foram projetados e sintetizados pela GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Transfecção realizada estritamente conforme instruções do reagente de transfecção Lipofectamine^TM 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA).

Citometria de Fluxo

Meio de cultura descartado, células lavadas duas vezes com PBS. Células destacadas com 0,25% tripsina, centrifugadas a 800 rpm por 5 min, suspensas com 1× buffer de ligação, densidade ajustada a 1×10⁷ células/mL. Suspensão celular (100 μL) incubada com 5 μL iodeto de propídio (PI, 20 μg/mL) e anexina V-FITC por 20 min, depois misturada com 400 μL 1× buffer de ligação. Citômetro de fluxo (BD FACSArial I cell sorter) utilizado para detectar apoptose celular dentro de 1 h. Resultados: quadrante inferior esquerdo (Q4) no mapa de dispersão mostrou células vivas saudáveis (FITC⁻/PI⁻), quadrante inferior direito (Q3) como células apoptóticas precoces (FITC⁺/PI⁻), quadrante superior direito (Q2) como células apoptóticas tardias e apoptóticas (FITC⁺/PI⁺); taxa de apoptose = porcentagem de apoptose precoce (Q3) + porcentagem de apoptose tardia (Q2).

Ensaio MTT

Células destacadas com tripsina para preparar suspensão celular. Células contadas sob microscópio invertido. Concentração ajustada a 5×10⁴ células/mL. Células semeadas em placa de cultura de 96 poços. Após 48 h, células incubadas com 20 μL solução MTT por 4 h. MTT em cada poço dissolvido com 150 μL dimetil sulfóxido. Valor de densidade óptica (DO) das CEs medido em comprimento de onda de 570 nm. Taxa de proliferação das CEs calculada com base no valor DO.

Teste de Arranhão

Células de cada grupo semeadas em placa de 24 poços com 2×10⁵ células/poço. Três poços paralelos por grupo. Ao atingir ~90% confluência, plano de crescimento celular arranhado com ponteira estéril descartável de micropipeta de 1 mL; cada poço arranhado uma vez e comprimento e profundidade do arranhão consistentes. Após arranhão, células flutuantes removidas, meio de cultura substituído por fresco, e espaçamento do arranhão observado sob microscópio após 24 h de cultura. Área de cicatrização do arranhão enumerada por software National Instrument Vision Assistant 8.6. Migração celular = área de cicatrização do arranhão/área inicial do arranhão × 100%.

Animais de Experimento e Estabelecimento de Modelos de Rato de AI

Oitenta e quatro ratos Sprague-Dawley (SD) com 7 semanas e peso de 180-200 g (Centro de Animais de Laboratório, Academia de Ciências Médicas Militares, Pequim, China) selecionados. Ratos alojados em centro experimental animal. Condições controladas a 22-25 °C e 50-60% umidade com luz natural. Todos ratos alimentados em gaiolas padrão com 4 ratos/gaiola. Água potável urbana e ração comum. Forros trocados a cada 3 dias, gaiolas lavadas e esterilizadas. Ratos de AI modelados conforme referência [15]. AI rompido identificado quando sintomas ocorreram [16]: 1, declínio de atividade de comer/beber com perda de peso (~10% em 24 h); 2, flexão do torso e membros anteriores ao levantar; 3, andar de um lado em postura normal; 4, inclinar para um lado em repouso, sem atividade espontânea. Ratos com sintomas eutanasiados 3 meses após cirurgia. Tecidos de AI obtidos durante cirurgia e perfundidos com PBS, e corante azul contendo ácido glutâmico perfundido na artéria cerebral.

Tratamento e Intervenção de Ratos de AI

84 ratos aleatoriamente separados em 7 grupos com 12 ratos cada. Métodos de tratamento: grupo normal (sem modelagem); grupo AI (injetado estereotaticamente com 100 μL mistura PBS e Lipofectamine 2000); grupo mimético NC (injeção estereotática com 100 μL mistura mimético NC miR-133a-3p e Lipofectamine 2000); grupo mimético miR-133a-3p (injeção com 100 μL mistura mimético miR-133a-3p e Lipofectamine 2000); grupo si-NC (injeção com 100 μL mistura si-PSAT1 NC e Lipofectamine 2000); grupo si-PSAT1 (injeção com 100 μL mistura si-PSAT1 e Lipofectamine 2000); grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (injeção com 100 μL mistura mimético miR-133a-3p, oe-PSAT1 e Lipofectamine 2000). Todas injeções realizadas uma vez ao dia, ratos mantidos em laboratório animal livre de patógenos específicos (SPF) por 12 semanas. Após 12 semanas, ratos anestesiados e cavidade torácica aberta. Da ventrículo esquerdo intubando na aorta, sangue liberado cortando veia cava. Simultaneamente, 30 mL salina com heparina sódica (37 °C) perfundida através do duto, então 10% poliformaldeído/0,1 M tampão fosfato (pH 7,4) injetado lentamente no cérebro. Após fixação por perfusão, cérebro aberto. Anel arterial na base do crânio separado e removido sob microscópio cirúrgico, alterações de aneurismas observadas e características patológicas examinadas. Mimético NC, mimético miR-133a-3p, si-NC, si-PSAT1 e oe-PSAT1 compostos pela Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China).

Detecção de Hemodinâmica

Taxa de fluxo sanguíneo no final da artéria carótida comum esquerda testada antes de 3 dias da cirurgia e 12 semanas após intervenção. Método: ratos colocados no quadro animal da máquina de anestesia para inalação, parâmetros de fluxo ajustados. Após respiração estável e sem reação ao tocar cauda, ratos fixados em mesa de operação com elástico. Pelo do pescoço raspado com barbeador elétrico. Detector Doppler ultrassom colorido ligado, velocidade do fluxo sanguíneo no final da artéria carótida comum esquerda medida e dados registrados após sonda untada com agente de acoplamento adequado. Após medição, ratos cuidadosamente devolvidos à gaiola para manter trato respiratório desobstruído até acordar da anestesia.

RT-qPCR

RNA total extraído com kit RNA simple total RNA extraction (TIANGEN Biotechnology Co., Ltd., Pequim, China). RNA de alta qualidade confirmado por análise ultravioleta e eletroforese de desnaturação por formaldeído, RNA transcrito reversamente em DNA complementar por PrimeScript RT reagent Kit. Reação PCR realizada com SYBR Permix Ex Taq^II (Takara, Dalian, Liaoning, China). Primers PCR projetados e sintetizados pela Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Pequim, China) (Tabela 1). U6 selecionado como parâmetro interno para miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenina, Bax, Bcl-2, Ki-67 e CiclinaD1 com gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) como parâmetro interno. Dados medidos por 2^−ΔΔCt.

Análise de Western Blot

Proteínas totais extraídas de células e tecidos, amostras quantificadas por Kit de Ensaio de Proteína por Ácido Bicinchônico (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China). Amostras misturadas com 1/4 volume de tampão de amostra 5× e fervidas por 5 min. Gel de separação 10% e gel concentrado 5% selecionados para eletroforese. Membrana incubada em 5% leite em pó desnatado por 60 min. Membrana incubada com anticorpos primários: PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), β-catenina (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), CiclinaD1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 μg/mL), VEGF (1:1000) (todos Abcam, Cambridge, MA, EUA). Então, membrana incubada com anticorpo secundário (1:2000) por 60 min. Membrana imersa em solução de reação eletroquimioluminescência (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) por 1 min, coberta por filme plástico após remoção do fluido. Membrana exposta por raio-X, resultado observado após revelação e fixação. GAPDH (1:10000, Abcam) usado como controle de carga, imagem de proteína analisada por software ImageJ2x.

Ensaio de Luciferase de Dupla Reporte

Relação alvo entre miR-133a-3p e PSAT1 e sítio de ligação entre miR-133a-3p e região 3' não traduzida (3'UTR) de PSAT1 previstos por site de bioinformática (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Sequência da região promotora 3'UTR de PSAT1 contendo sítio de ligação de miR-133a-3p amplificada e clonada em plasmídeo luciferase pGL3-basic (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japão) para construir plasmídeo wild-type (WT) (PSAT1-WT) de 3'UTR de PSAT1, enquanto plasmídeo recombinante mutante (MUT) PSAT1-MUT formulado por mutação do sítio de ligação de miR-133a-3p no PSAT1-WT com kit de mutagênese pontual (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japão). CEs vasculares em fase logarítmica de crescimento semeadas em placa de 96 poços. Quando confluência ~70%, plasmídeos PSAT1-WT e PSAT1-MUT misturados com mimético NC e plasmídeos mimético miR-133a-3p por Lipofectamine 2000 e co-transfectados em CEs vasculares. Células coletadas e lisadas 48 h após transfecção, atividade de luciferase verificada por kit de detecção de luciferase (Promega Corporation, Madison, WI, EUA).

Análise Estatística

Todos dados analisados por software SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EUA). Dados de enumeração indicados por taxa ou porcentagem, análise por qui-quadrado ou teste de Fisher. Dados de medição com distribuição normal expressos por média ± desvio padrão. Comparação entre dois grupos por teste t, comparação entre múltiplos grupos por ANOVA unidirecional seguida de teste post hoc de Tukey. Valor P < 0,05 considerado significante.

Resultados

Dados Gerais de Pacientes com AI

Conforme Tabela 2, dados gerais do grupo AI e controle comparados. Informações específicas listadas na Tabela 2.

Expressão de miR-133a-3p Relaciona-se com Número e Tamanho de AI

Analisando relação entre expressão de miR-133a-3p e características clinicopatológicas de AI, detalhado na Tabela 3 que, com base na expressão relativa média de miR-133a-3p no AI, 75 casos distribuídos em dois grupos: alta expressão de miR-133a-3p (n=47) e baixa expressão (n=28). Relação entre miR-133a-3p e diferentes parâmetros clinicopatológicos analisada estatisticamente por qui-quadrado ou teste de Fisher. Resultados mostraram que expressão de miR-133a-3p não relacionada a idade, gênero, forma e posição do aneurisma (todos P > 0,05), mas associada a número e tamanho do aneurisma (ambos P < 0,05).

Expressão de miR-133a-3p Diminuída e PSAT1, GSK3β, β-Catenina Aumentadas em Tecidos de AI

Expressão de miR-133a-3p no AI determinada por RT-qPCR, resultados revelaram que, em relação a tecidos normais de arteríolas intracranianas (grupo controle), expressão de miR-133a-3p reduzida nos tecidos de AI (grupo AI) (P < 0,05) (Fig. 1a). RT-qPCR e western blot manifestaram que expressão de PSAT1, GSK3β e β-catenina aumentada nos tecidos de AI em relação aos normais (todos P < 0,05) (Fig. 1a-c).

Alterações Patológicas de Aneurisma e Expressão de MMP-9 e VEGF em Tecidos de AI

Observando diretamente tecidos normais de arteríolas intracranianas e de AI, no grupo controle vasos em tecidos arteriais eram vermelho brilhante sem placas ateroscleróticas óbvias e trombo lateral no lúmen. Tumor de tecidos de aneurisma do grupo AI majoritariamente marrom ou vermelho escuro, aparência escrotiforme ou fusiforme, textura mostly resistente. Ao cortar tumor, apareciam placas ateroscleróticas brancas ou vermelho escuro na parede de algumas amostras, planas, redondas ou ovais. Em algumas amostras, trombo mural na cavidade do tumor, textura mole. Espessura da parede do tumor afinava gradualmente do colo, alguns com apenas membrana fibrosa fina no ápice, alguns até rompidos. Fenda de aneurisma rompido localizada no ou próximo ao ápice.

Coloração HE mostrou que sob microscópio de luz, espessura da parede de tecidos normais de arteríolas intracranianas era uniforme; estrutura anatômica de camadas íntima, média e adventícia clara e íntegra; morfologia das células de cada camada normal; sarcolema de células adjacentes frequentemente formavam junções apertadas; células inflamatórias da parede raras. No grupo AI, protrusões locais formadas na cavidade vascular lateral distal no ápice da bifurcação da artéria intracraniana na parede do aneurisma tornaram-se obtusas e menores, CEs locais perdidas. Pequeno número de amostras mostrou migração de camada de células musculares lisas para íntima e proliferação miógena de células íntimas. CEs diminuíram ou desapareceram. Camada endotelial composta por células mióintimais hiperplásicas e CEs linearmente arranjadas, ou por CEs apoptóticas e células sanguíneas aderidas ao lúmen. Vacúolos degenerados e apresentaram interrupção de continuidade. Alguns descamados junto com membrana basal, fibras de colágeno íntimas aumentadas. Aterosclerose alterada, parede da arteríola obviamente mais fina e preenchida com grande número de tecidos conjuntivos em escada. Infiltração celular inflamatória e difusão parcial observadas em todas camadas, principalmente na média e adventícia. Depósitos de lipídios e cristais de colesterol observados em algumas células. Algumas paredes de tumor completamente ou localmente afinadas e expandidas para fora (Fig. 2a, b).

Secções de tecidos normais e de AI observadas por microscópio eletrônico: em tecidos normais, fibras da matriz da parede vascular cerebral visíveis claramente, sem lesão endotelial, picnose celular ou degeneração. Em tecidos de AI, lesão endotelial óbvia, picnose ou degeneração vacuolar, número de células musculares lisas da média diminuído, maioria com picnose nuclear, agregação de cromatina e corpos apoptóticos visíveis. Algumas células mostravam inchaço mitocondrial e desaparecimento de estrutura interna normal. Matriz extracelular formando citoesqueleto embaçada e mostrava flocos amorfos. Muitos fragmentos nas partes ausentes das células (Fig. 2c, d).

Coloração imuno-histoquímica para testar expressão de MMP-9 e VEGF: não houve expressão de MMP-9 e VEGF em 75 casos do grupo controle. Existiam 60 casos de expressão positiva de MMP-9 em 75 amostras de AI. Expressão positiva de MMP-9 apareceu nas membranas íntima e adventícia da parede de AI, mas não uniforme. Caracterizada por citoplasma marrom-amarelado. Expressão positiva de VEGF em 66 de 75 casos de AI. Na parede de AI, alta expressão positiva na média e adventícia, baixa na íntima. Também caracterizada por citoplasma marrom-amarelado (Fig. 2e, f). Expressão de MMP-9 e VEGF nos dois grupos na Tabela 4.

Identificação de CEs Vasculares

Expressão de fator VIII e CD31 em CEs analisada por coloração imuno-histoquímica. Resultados relataram que CEs vasculares reagiram positivamente a anticorpos de antígenos relacionados a fator VIII e CD31, taxa positiva 95%. Além disso, grande número de partículas marrons no citoplasma, quinta passagem de células com coloração marrom dramaticamente maior que passagem primária (Fig. 3a, b).

Upregulação de miR-133a-3p e Downregulação de PSAT1 Suprimem Apoptose e Avançam Proliferação e Migração de CEs no AI

Citometria de fluxo, RT-qPCR e western blot adotados para observar apoptose e expressão de Bax e Bcl-2 em CEs de AI após tratamento com mimético miR-133a-3p ou si-PSAT1. Indicou que, comparado ao grupo controle, taxa de apoptose e expressão de Bax elevadas no grupo AI e expressão de Bcl-2 diminuída (todos P < 0,05). Apoptose celular e expressão de Bax e Bcl-2 no grupo AI, mimético NC e si-NC sem mudança significativa (todos P > 0,05). Comparado aos grupos si-NC e mimético NC, taxa de apoptose no grupo si-PSAT1 e mimético miR-133a-3p suprimida, expressão de Bax diminuída, expressão de Bcl-2 aumentada (todos P < 0,05). Versus grupo mimético miR-133a-3p, taxa de apoptose e expressão de Bax aumentadas, expressão de Bcl-2 reduzida no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos P < 0,05) (Fig. 4a-e).

Ensaio MTT, RT-qPCR e western blot utilizados para observar proliferação e expressão de Ki-67 e CiclinaD1 em CEs de AI após tratamento com mimético miR-133a-3p ou si-PSAT1. Mostrou que, em contraste ao grupo controle, atividade de proliferação e expressão de Ki-67 e CiclinaD1 reduzidas no grupo AI (todos P < 0,05). Sem diferença significativa em atividade de proliferação e expressão de Ki-67 e CiclinaD1 entre grupos AI, mimético NC e si-NC (todos P > 0,05). Em relação aos grupos si-NC e mimético NC, atividade de proliferação e expressão de Ki-67 e CiclinaD1 aumentadas nos grupos si-PSAT1 e mimético miR-133a-3p (todos P < 0,05). Em comparação ao grupo mimético miR-133a-3p, atividade de proliferação e expressão de Ki-67 e CiclinaD1 reduzidas no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos P < 0,05) (Fig. 4f, i).

Migração de CEs em cada grupo após tratamento com mimético miR-133a-3p ou si-PSAT1 por 24 h observada por teste de arranhão. Revelou que migração de células no grupo AI inibida em relação ao grupo controle (P < 0,05). Sem mudança marcante em migração celular dos grupos AI, si-NC e mimético NC (todos P > 0,05). Comparado aos grupos si-NC e mimético NC, migração celular nos grupos si-PSAT1 e mimético miR-133a-3p elevada (ambos P < 0,05). Versus grupo mimético miR-133a-3p, migração celular diminuída no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (P < 0,05) (Fig. 4j, k).

miR-133a-3p Restaurado e PSAT1 Depletado Reduzem Expressão de PSAT1, GSK3β e β-Catenina em CEs de AI

RT-qPCR usado para detectar expressão de miR-133a-3p em CEs de AI; mostrou que, comparado ao grupo controle, expressão de miR-133a-3p no grupo AI reduzida (P < 0,05). Expressão de miR-133a-3p nos grupos AI, mimético NC e si-NC não mudou marcadamente (P > 0,05). Expressão de miR-133a-3p no grupo mimético miR-133a-3p aumentada em relação ao grupo mimético NC (P < 0,05). Em contraste com grupo si-NC, sem mudança distinta em expressão de miR-133a-3p no grupo si-PSAT1 (P > 0,05). Versus grupo mimético miR-133a-3p, expressão de miR-133a-3p sem diferença significativa no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (P > 0,05) (Fig. 5a).

Expressão de PSAT1, GSK3β e β-catenina em CEs de AI testada por western blot e RT-qPCR. Indicou que, em relação ao grupo controle, expressão de PSAT1, GSK3β e β-catenina no grupo AI aumentada (todos P < 0,05). Expressão nos grupos AI, mimético NC e si-NC não mudou dramaticamente (todos P > 0,05). Expressão nos grupos mimético miR-133a-3p e si-PSAT1 degradada em relação aos grupos mimético NC e si-NC (todos P < 0,05). Em relação ao grupo mimético miR-133a-3p, expressão de PSAT1, GSK3β e β-catenina elevada no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos P < 0,05) (Fig. 5a-c).

Upregulação de miR-133a-3p e Downregulação de PSAT1 Aliviam Alterações Patológicas de Tecidos de AI

Testando alterações hemodinâmicas de ratos após modelagem, monitoramos velocidade do fluxo sanguíneo em cada grupo 3 dias antes da cirurgia e 12 semanas após intervenção. Mostrou que não houve diferença óbvia na velocidade do fluxo sanguíneo em cada grupo 3 dias antes da cirurgia (P > 0,05). Após 12 semanas de intervenção, velocidade do fluxo sanguíneo de ratos no grupo AI deprimida em relação ao grupo normal (P < 0,05). Sem diferença distinta no grau de diminuição da velocidade nos grupos AI, mimético NC, si-NC e mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos P > 0,05). Comparado aos grupos si-NC e mimético NC, velocidade do fluxo sanguíneo aumentada nos grupos mimético miR-133a-3p e si-PSAT1 (ambos P < 0,05). Em contraste ao grupo mimético miR-133a-3p, velocidade diminuída no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (P < 0,05) (Fig. 6a).

Alterações de tecidos de AI verificadas por coloração HE. Resultados mostraram que no grupo normal, fibras elásticas na camada média de tecido vascular intracraniano eram organizadas, estrutura normal de proteína elástica em onda aparecia, sem quebra e degradação. Em relação ao grupo normal, lúmen de tecido vascular intracraniano alargado, estrutura de onda de proteína elástica normal desaparecida, fibra elástica na camada média de vaso de proteína elástica local quebrada, algumas fibras elásticas completamente degradadas no grupo AI. Sem mudança distinta na morfologia de tecidos de AI nos grupos si-NC, mimético NC, AI e mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1. Em contraste com grupos si-NC e mimético NC, estrutura de onda de proteína elástica em tecido vascular intracraniano de ratos nos grupos mimético miR-133a-3p e si-PSAT1 existia, estrutura vascular de proteína elástica local ligeiramente desordenada, mas sem fratura e dissolução (Fig. 6b).

Alta Expressão de miR-133a-3p e Baixa Expressão de PSAT1 Reduzem PSAT1, GSK3β, β-Catenina, VEGF e MMP-9 em Tecidos de AI In Vivo

Expressão de miR-133a-3p em tecidos de AI in vivo testada por RT-qPCR, sugeriu que, em relação ao grupo normal, expressão de miR-133a-3p diminuída no grupo AI (P < 0,05). Expressão nos grupos AI, mimético NC e si-NC não mudou obviamente (todos P > 0,05). Expressão no grupo mimético miR-133a-3p elevada em relação ao grupo mimético NC (P < 0,05). Comparado ao grupo si-NC, sem mudança marcante em expressão de miR-133a-3p no grupo si-PSAT1 (P > 0,05). Versus grupo mimético miR-133a-3p, expressão de miR-133a-3p sem diferença significativa no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (P > 0,05) (Fig. 7a).

Expressão de PSAT1, GSK3β e β-catenina em tecidos de AI in vivo testada por western blot e RT-qPCR. Apareceu que, em contraste com grupo normal, expressão de PSAT1, GSK3β e β-catenina no grupo AI aumentada (todos P < 0,05). Expressão nos grupos AI, mimético NC e si-NC não mudou marcadamente (todos P > 0,05). Expressão nos grupos mimético miR-133a-3p e si-PSAT1 diminuída comparada aos grupos mimético NC e si-NC (todos P < 0,05). Versus grupo mimético miR-133a-3p, expressão de PSAT1, GSK3β e β-catenina aumentada no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos P < 0,05) (Fig. 7a-c).

Western blot usado para verificar expressão de VEGF e MMP-9 em tecidos de AI in vivo; resultados perceberam que, comparado ao grupo normal, expressão de VEGF e MMP-9 no grupo AI aumentadas (ambos P < 0,05). Expressão nos grupos AI, mimético NC e si-NC não mudou obviamente (todos P > 0,05). Em relação aos grupos mimético NC e si-NC, expressão de VEGF e MMP-9 nos grupos mimético miR-133a-3p e si-PSAT1 diminuíram (todos P < 0,05). Versus grupo mimético miR-133a-3p, expressão de VEGF e MMP-9 elevadas no grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos P < 0,05) (Fig. 7d, e).

PSAT1 é Gene Alvo de miR-133a-3p

Software de predição online (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) utilizado para prever e analisar sítio alvo de PSAT1 ligando a miR-133a-3p, e sequência da região 3'UTR combinada por PSAT1 e miR-133a-3p. Para provar que sítio de ligação predito de miR-133a-3p resultou em mudança na atividade de luciferase, sequência mutante e sequência wild de 3'UTR de PSAT1 deletando sítio de ligação de miR-133a-3p foram projetadas. Atividade de luciferase verificada por co-transfecção de mimético miR-133a-3p e WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) ou MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) plasmídeos recombinantes em CEs vasculares. Resultados revelaram que mimético miR-133a-3p não teve efeito distinto em atividade de luciferase no grupo Mut-miR-133a-3p/PSAT1 (P > 0,05), enquanto atividade de luciferase no grupo Wt-miR-133a-3p/PSAT1 declinou marcadamente (P < 0,05) (Fig. 7f, g).

Discussão

AI é dilatação anormal de artéria intracraniana, que enfraquece parede arterial empurrando continuamente para fora a parede vascular, resultando em maior risco de ruptura [17]. Em estudo de Liu et al., mostrou que alguns miRNAs estão envolvidos na modulação da proliferação de células musculares lisas vasculares, estreitamente associada ao AI [18]. Estudo recente forneceu prova de que miRNAs circulantes podem ser usados como novo biomarcador para avaliar possibilidade de AI em indivíduos de alto risco [19]. Costuma-se considerar que PSAT1 pode estar envolvido em condições do espectro da esquizofrenia e altera metabolismo de serina [20]. Estudo atual desenhado para explorar papel regulador de miR-133a-3p na lesão endotelial vascular modulada e AI desencadeado através da modulação da via de sinalização PSAT1/GSK3β/β-catenina.

Neste estudo, relação entre expressão de miR-133a-3p e características clinicopatológicas de AI analisada, resultados demonstraram que expressão de miR-133a-3p não relacionada a idade, gênero, forma e posição do aneurisma, mas associada a número e tamanho. Alguns estudiosos consideram que tensão de cisalhamento do fluxo sanguíneo regional na parede arterial induz expressão de proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) e proteína inflamatória de macrófago 1α (MIP-1α) por fibroblastos e CEs vasculares na parede vascular. Fatores quimiotáticos altamente reativos MCP-1 e MIP-1α causam agregação de macrófagos na parede vascular e medeiam resposta inflamatória, induzem excitação do fator de transcrição nuclear c-Jun e regulam ativação de proteína ativada 1 (AP-1), ativam promotor de MMP-9 em seu domínio estrutural para aumentar expressão de mRNA de MMP-9, finalmente induzem dissolução da matriz extracelular da parede vascular, causando formação de AI [21-23]. Saito et al. [24] encontraram que células positivas para MMP-9 eram principalmente de macrófagos da média e adventícia da artéria, certificando que MMP-9 expresso por macrófagos medeia degeneração da parede arterial, levando à formação de aneurisma arterial. Estudos acima indicam que MMP-9 ligado à formação de AI. Resultados de nosso estudo revelaram que MMP-9 upregulado no AI; assim, especulamos que miR-133a-3p pode estar envolvido na ocorrência e desenvolvimento de AI regulando via PSAT1/GSK3β/β-catenina e further regulando MMP-9. Em nosso estudo, encontramos que restauração de miR-133a-3p reduziu expressão de PSAT1, GSK3β, β-catenina e MMP-9 em tecidos de AI. Realizaremos pesquisas futuras para verificar nossos achados.

Nosso estudo forneceu evidência substancial de que expressão de miR-133a-3p diminuída e PSAT1, GSK3β e β-catenina elevados no AI. Evidências emergentes sugerem que miR-133a-3p desempenha papel supressor em diferentes tumores. Estudo recente apresentou que expressão de miR-133a-3p dramaticamente degradada em tecidos de câncer de mama em contraste com tecidos não cancerosos [25]. Outro estudo afirmou que expressão de miR-133a-3p diminuída em tecidos de câncer de próstata (CP) avançado em relação a tecidos normais adjacentes ou lesões prostáticas benignas, especialmente em CP com metástase óssea [26]. Efeito promotor de PSAT1 em outras doenças encontrado em literaturas. Relatado que expressão de PSAT1 notavelmente aumentada em câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) e prevê desfecho clínico ruim [27]. Além disso, PSAT1 considerado gene mais upregulado em tumores de CCR e altamente expresso em pacientes com doença quimiorresistente [28]. Manifestou-se que atividade de GSK3β aumentada em tecidos cancerosos [29]. Além disso, nível de fosforilação de GSK3β e expressão de β-catenina nuclear também aumentados, sugerindo que via GSK3β/β-catenina pode participar na regulação de osteopontina [30].

Outros resultados de nossos dados sugeriram que upregulação de miR-133a-3p e downregulação de PSAT1 suprimiram apoptose e avançaram proliferação e migração de CEs de AI, reduziram expressão de VEGF e MMP-9 em tecidos de AI. Sugeriu-se anteriormente que superexpressão de miR-133a-3p retrai invasão, crescimento e mitose de células de carcinoma espinocelular oral alvo colágeno tipo I alfa 1 (COL1A1) [31]. Relatado que miR-133a-3p altamente expresso pode reprimir propagação de células de CECE, avançar apoptose celular, diminuir migração e invasão de células de CECE alvo COL1A1 [32]. Outro estudo verificou que upregulação transitória de miR-133a-3p suprime migração, invasão e crescimento de células de carcinoma de vesícula biliar alvo direto proteína de ligação a sinal de recombinação Jκ [33]. De modo similar, este estudo sugere que miR-133a-3p exerce seu papel no AI alvo PSAT1. Mostrou-se que superexpressão de PSAT1 impulsiona crescimento de células de CECE e invasão em matrigel in vitro, e injeção de camundongos com células de CECE com alta expressão de PSAT1 induz formação de tumor in vivo [14]. Outro estudo também relatou que PSAT1 altamente expresso prevê desfecho clínico ruim, bem como aumenta tumorigenese e proliferação celular in vivo e in vitro [13]. Pesquisa prévia geralmente confirma que PSAT1 avança progressão do ciclo celular, proliferação e tumorigenese através de experimentos de perda e ganho de função [27]. Indicou-se que MMPs compostos por série de enzimas que clivam substratos proteicos baseados em mecanismo conservado referente ativação de molécula de água ligada a sítio ativo através de íon Zn²⁺ [34]. MMP-9 é protease distinta que exerce influência imensa em muitos processos biológicos [35]. Estudo afirmou que MMP-9 elevado em grupos de aneurisma comparado ao controle [36]. Fator de crescimento endotelial vascular-A (VEGF-A) reconhecido como modulador chave da diferenciação endovascular de trofoblasto [37]. Estudo revelou que expressão silenciada de PSAT1 suprime expressão de VEGF, β-catenina e fosforilação de GSK3β [10].

Conclusão

Para concluir brevemente, nosso estudo confirma hipótese de que superexpressão de miR-133a-3p ou downregulação de PSAT1 restringem danos a células endoteliais e avançam proliferação endotelial via inibição da via GSK3β/β-catenina no AI. Estes achados fornecem nova visão para nova terapia alvo para AI. Estes achados ressaltam papel de miR-133a-3p no AI em relação à via PSAT1/GSK3β/β-catenina. No entanto, conclusão sobre efeitos de miR-133a-3p e PSAT1 não pode ser feita claramente devido a pesquisas limitadas conhecidas sobre isto. Necessita ser monitorado rigorosamente e reportado apropriadamente em futuros ensaios clínicos.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Não aplicável

Abreviações

miR-133a-3p:

MicroRNA-133a-3p

AI:

Aneurisma intracraniano

PSAT1:

Fosfoserina aminotransferase 1

GSK3:

β-glicogênio sintase quinase 3β

HSA:

Hemorragia subaracnoide

miRNAs:

MicroRNAs

CCR:

Câncer colorretal

CECE:

Carcinoma espinocelular esofágico

HE:

Hematoxilina-eosina

PBS:

Tampão fosfato salino

MMP:

Metaloproteinase de matriz

VEGF:

Fator de crescimento endotelial vascular

NC:

Controle negativo

DAB:

Diaminobenzidina

SFB:

Soro fetal bovino

UEAI:

Ulex europaeus agglutinins I

PI:

Iodeto de propídio

FITC:

V-fluoresceína isotiocianato

DMSO:

Dimetil sulfóxido

DO:

Densidade óptica

SD:

Sprague-Dawley

SPF:

Livre de patógenos específicos

GAPDH:

Gliceraldeído fosfato desidrogenase

BCA:

Ácido bicinchônico

3'UTR:

Região 3' não traduzida

WT:

Tipo selvagem

MUT:

Mutante

ANOVA:

Análise de variância

CPNPC:

Câncer de pulmão de não pequenas células

VEGF-A:

Fator de crescimento endotelial vascular-A