MicroRNA-326-5p restaurado inibe a apoptose neuronal e atenua o dano mitocondrial por meio da supressão de STAT3 em lesão de isquemia / reperfusão cerebral

Resumo

Os estudos exploraram amplamente o papel dos microRNAs (miRNAs) na lesão de isquemia / reperfusão cerebral (CI / RI). Mas o mecanismo específico de miR-326-5p em CI / RI ainda é indescritível. Portanto, este estudo foi desmascarar o mecanismo do miR-326-5p / transdutor de sinal e ativador do eixo da transcrição-3 (STAT3) em CI / RI. Dois modelos (privação de oxigênio e glicose [OGD] em neurônios corticais primários de ratos e oclusão da artéria cerebral média [MCAO] em ratos Sprague-Dawley) foram estabelecidos para imitar CI / RI in vitro e in vivo, respectivamente. Os ensaios de perda e ganho de função foram realizados com neurônios tratados com OGD e com ratos MCAO. Posteriormente, foram testados viabilidade, apoptose, estresse oxidativo e potencial de membrana mitocondrial em neurônios tratados com OGD, bem como alterações patológicas, apoptose e potencial de membrana mitocondrial em tecidos cerebrais de ratos MCAO. Foi detectada a expressão de mitofusina-2 (Mfn2), miR-326-5p e STAT3 em neurônios tratados com OGD e em tecidos cerebrais de ratos MCAO. Mfn2 e miR-326-5p foram reduzidos, e STAT3 foi elevado em neurônios tratados com OGD e tecidos cerebrais de ratos MCAO. miR-326-5p expressão de STAT3 direcionada e regulada negativamente. Restaurar miR-326-5p ou reduzir a viabilidade reforçada de STAT3, inibir a apoptose e o estresse oxidativo, aumentar o potencial de membrana mitocondrial e aumentar a expressão de Mfn2 em neurônios tratados com OGD. A regulação positiva do miR-326-5p ou da regulação negativa do STAT3 aliviou as alterações patológicas, inibiu a apoptose e aumentou o potencial da membrana mitocondrial e a expressão de Mfn2 em tecidos cerebrais de ratos com MCAO. Este estudo elucida que miR-326-5p regulado para cima ou STAT3 regulado para baixo protege contra CI / RI ao elevar a expressão de Mfn2.

Introdução

Lesão de isquemia / reperfusão cerebral (IC / RI) é um tipo de lesão cerebral seguida de acidente vascular cerebral isquêmico [1]. A característica mais característica da I / R cerebral é a isquemia cerebral transitória inicial após a reperfusão [2]. O CI / RI ativa a apoptose neuronal e causa danos ao hipocampo e cortical [3]. Atualmente, a aplicação clínica mais comum é trombolítica para CI / RI [4]. No entanto, a reperfusão aumentaria a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), levando a danos no DNA intracelular, danos relacionados ao estresse oxidativo, oxidação de proteínas e peroxidação lipídica, deteriorando ainda mais a barreira hematoencefálica e edema [5]. Assim, a urgência de buscar novas opções direcionadas é a prioridade para CI / RI.

MicroRNAs (miRNAs) são amplamente considerados como papéis potenciais e prognósticos em CI / RI [6, 7]. Por exemplo, um artigo demonstrou que miR-202-5p atenua dano neuronal e déficits neurológicos, bem como dano celular induzido por privação de oxigênio e glicose (OGD) em ratos modelo com oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em lesão isquêmica [8] . Além disso, foi descoberto que a regulação positiva de miR-98 melhora os resultados neurológicos em camundongos com acidente vascular cerebral I / R [9] e a superexpressão de miR-451 alivia a apoptose cerebral isquêmica em camundongos com CI / RI [10]. Especificamente, miR-326-5p tem capacidade pró-angiogênica para células progenitoras endoteliais e pode melhorar a função cardíaca após infarto agudo do miocárdio [11]. No entanto, o estudo giratório em miR-326-5p em CI / RI ainda está em sua infância. Transdutores de sinal e ativador transcricional (STAT) são uma família única de proteínas que é ativada por CI / RI [12]. STAT3 foi previsto como um alvo de miR-326-5p no site de bioinformática; assim, estudamos o papel de STAT3 mediado por miR-326-5p em CI / RI. STAT3 deteriora processos neuroinflamatórios isquêmicos e lesão cerebral secundária ao liberar mediadores pró-inflamatórios [13, 14]. Especificamente, a via da quinase 2 ativada por Janus (JAK2) / STAT3 desempenha um papel funcional no bloqueio da apoptose celular induzida por CI / RI [15]. A mitofusina-2 (Mfn2) é um fator de fusão mitocondrial que pode proteger contra I / RI cardio-cerebrovascular [16] e melhorar a apoptose neuronal induzida por hipóxia em danos cerebrais isquêmicos [17]. Também foi registrado que o Mfn2 exerce efeito protetor sobre o CI / RI [18].

Em uma palavra, uma investigação menos aprofundada descobriu o papel combinado de miR-326-5p e STAT3 em CI / RI. Dado isso, este estudo é lançado com a hipótese de que miR-326-5p atenua CI / RI por meio do direcionamento de STAT3.

Materiais e métodos

Declaração de Ética

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais do Hospital Afiliado da Universidade de Yangzhou; Universidade de Yangzhou, e foi realizado com o Guia para o Cuidado e Uso de Ratos Experimentais do Hospital Afiliado da Universidade de Yangzhou; Universidade de Yangzhou.

Animais Experimentais

Ratos Sprague-Dawley adultos machos (6–8 semanas de idade, 250 ± 30 g) do Centro de Medicina Comparativa, Universidade de Yangzhou (Yangzhou, China), foram mantidos em um ambiente livre de patógenos específico com livre acesso a comida e água, (24 ± 1) ° C, (50 ± 5)% umidade e ciclo claro / escuro de 12 h.

Isolamento e identificação celular

Os ratos foram sacrificados por decapitação e seus cérebros foram cortados em 1 mm ³ para configurar as suspensões de células, as quais foram misturadas com solução de azul de tripano a 0,4% a 9:1 (a concentração final de azul de tripano foi de 0,04%) e a densidade celular e a taxa de sobrevivência foram calculadas por hemocitômetro. As células (1 × 10 ⁶ células / mL) foram semeadas em um frasco de cultura de células pré-revestido com L-polilisina (0,1 mg / mL) a 5 × 10 ⁶ células por frasco. Quando as células aderiram às paredes, foram incubadas com o meio renovado (NeurobasalA + B27 + L-glutamina) e continuamente cultivadas por 6–7 dias com o meio trocado pela metade a cada 2–3 dias.

Identificação de células:neurônios corticais de rato foram utilizados para preparar lâminas de neurônios que foram incubadas com o anticorpo policlonal de coelho anti-Nestina (NES) primário (1:200), bem como a imunoglobulina anti-coelho de cabra marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) G (1:50, ambos da Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA). Posteriormente, as células foram seladas com um inibidor anti-fluorescente e observadas por microscopia de fluorescência.

Estabelecimento do modelo OGD

Os neurônios foram cultivados em uma solução de Earle sem glicose e expostos a uma mistura de gás de 95% N ₂ e 5% CO ₂ . Após 30 min de ventilação com pressão positiva, formou-se um ambiente hipóxico no qual as células foram incubadas (simulação de isquemia por OGD in vitro). Após 90 min de incubação, as células foram incubadas com o meio de células de manutenção após a solução de Earle sem glicose ser removida. As células foram cultivadas rotineiramente para experimentos subsequentes (simulação de reperfusão por reperfusão de oxigênio-glicose in vitro). O meio normal sob normóxia serviu como controle.

Os neurônios foram divididos em grupo controle; o grupo OGD, o grupo de controle negativo (NC) (neurônios tratados com OGD transfectados com oligonucleotídeos embaralhados), o grupo miR-326-5p agomir (neurônios tratados com OGD transfectados com miR-326-5p agomir), o grupo sh-STAT3 (Neurônios tratados com OGD transfectados com STAT3 shRNA) e o grupo miR-326-5p agomir + superexpressão (oe) -STAT3 (neurônios tratados com OGD transfectados com miR-326-5p agomir e vetor pcDNA-STAT3). Os oligonucleotídeos e vetores foram todos fornecidos pela GenePharma (Shanghai, China).

Usando lipofectamina 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific), oligonucleotídeos embaralhados, miR-326-5p agomir, STAT3 shRNA ou miR-326-5p agomir e pcDNA-STAT3 foram transfectados em neurônios de rato primários e a eficácia de transfecção foi testada por transcrição reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR) ou Western blot após 48 h.

Ensaio de 3- (4, 5-Dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT)

Os neurônios foram suspensos em 1 × 10 ⁶ células / mL e cultivadas por 0, 24 e 48 h, respectivamente. Em um ambiente estéril, os neurônios foram incubados por 2–4 h em solução de MTT a 10% e adicionados com 150 μL de solução dissolvida de Formanzan (Dimetil Sulfóxido) até que o cristal estivesse suficientemente dissolvido. O valor da densidade óptica (DO) foi medido em um leitor de microplaca a 570 nm.

Ensaio de apoptose de citometria de fluxo

Os neurônios foram separados com 0,25% de tripsina, centrifugados a 2.000 rpm e ressuspensos em PBS. Em seguida, os neurônios foram centrifugados a 2.000 rpm e o pellet foi ressuspenso por tampão de ligação e incubado sucessivamente com 5 μL de Anexina V-FITC e 5 μL de iodeto de propídio (PI). Um citômetro de fluxo foi aplicado para detectar a taxa de apoptose.

Detecção do potencial da membrana mitocondrial JC-1

As células na placa de 6 poços foram enxaguadas com PBS, adicionado com 1 mL de meio de cultura de células e 1 mL de solução de trabalho de coloração JC-1 (50 mL de JC-1, 8 mL de água ultrapura e 2 mL de tampão de coloração JC-1) (SolarbioScience) , Pequim, China) e incubados por 15 min. O tampão de coloração 1 × JC-1 foi configurado por 4 mL de água destilada e 1 mL de tampão de coloração JC-1. Após a incubação, as células foram tripsinizadas, ressuspensas em tampão JC-1 e testadas em um citômetro de fluxo. A proporção relativa de fluorescência verde foi calculada.

Detecção de estresse oxidativo

Os níveis de ROS intracelulares foram medidos pelo kit de detecção de diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCF-DA) (Abcam). Em suma, os neurônios foram separados com 0,25% de tripsina, ressuspensos e incubados com 10 μm de DCF-DA por 30 min. Em seguida, a fluorescência do DCF com excitação / emissão de luz a 495 nm / 529 nm foi medida por espectroscopia de fluorescência (BD Biosciences).

A detecção de malondialchehyche intracelular (MDA), conteúdo de glutationa (GSH) e atividade de superóxido dismutase (SOD) foi detectada por colorimetria química usando kits de ensaio comerciais (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China). O valor de DO foi medido por um leitor de microplaca.

Estabelecimento de modelo de rato

Os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 μg / kg). Uma incisão mediana foi feita no pescoço, a carótida externa foi ligada e a artéria carótida comum foi bloqueada com um clipe arterial. Uma sutura de náilon monofilamentar 3-0 revestida com silicone foi cuidadosamente inserida na artéria carótida interna até a resistência à luz. Após 90 minutos de isquemia cerebral transitória, a sutura foi retirada e a reperfusão foi realizada por mais 24 horas. O grupo sham recebeu o mesmo tratamento, exceto que a sutura não entrou na artéria carótida interna. Durante a operação, um leito termostático foi utilizado para manter a temperatura retal em 37 ± 0,5 ° C [19].

Os ratos foram alocados em 6 grupos (n =6) e injetados com plasmídeo ou miR em cerebroventricular lateral antes do estabelecimento de modelos MCAO, incluindo o grupo sham, o grupo MCAO (ratos modelados), o grupo NC (ratos modelados com injeção cerebroventricular lateral de 5 μL de oligonucleotídeos embaralhados [100 μM]), o grupo miR-326-5p agomir (ratos modelados com injeção cerebroventricular lateral de 5 μL miR-326-5p agomir [100 μM]), o grupo sh-STAT3 (ratos modelados com injeção cerebroventricular lateral de 5 μL de vetor de interferência STAT3 [100 μM]) e o grupo miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (ratos modelados com injeção cerebroventricular lateral de 5 μL miR-326-5p agomir [100 μM] e 5 μL Vetor de superexpressão STAT3 [100 μM]) [20, 21].

Coleta de espécimes

Os ratos foram sacrificados por anestesia, os corações foram perfundidos e os cérebros inteiros foram obtidos. Os tecidos com lesão cerebral foram cortados em 1 × 1 × 1 mm ³ massas de tecido para preparação de seção de parafina, RT-qPCR, análise de western blot e detecção de potencial de membrana mitocondrial.

Detecção do potencial da membrana mitocondrial no córtex cerebral

O córtex cerebral de ratos SD foi separado e cortado em 1 mm ³ . Os blocos de tecido foram colocados em uma rede de náilon 300 mesh e adicionados com PBS. Em seguida, a suspensão de células foi centrifugada a 1000 r / min, adicionada com etanol a 70% e centrifugada a 1000 r / min novamente. Posteriormente, a amostra foi ressuspensa em 1 mL de PBS e a suspensão (1 × 10 ⁶ células, 100 μL) foi reagido com solução corante Rhodamine123 (10 μL, 5 μg / mL) e analisado em um citômetro de fluxo a 488 nm.

Coloração HE

O tecido cerebral do rato foi imerso em paraformaldeído 4% por 24 h, e seções de parafina foram preparadas, cortadas em 4 μm, espalhadas em água a 40 ° C e cozidas a 60 ° C. Rotineiramente desparafinados e hidratados, os cortes de parafina foram corados com solução de coloração HE. Após a coloração por HE, os neurônios lesados apresentaram contração do núcleo, edema celular, vacuolização e núcleos escurecidos. O microscópio óptico (Nikon, Japão) foi usado para obter a imagem e o número de neurônios sobreviventes (mm ² ) do córtex isquêmico.

Coloração TUNEL

Os cortes de parafina foram desparafinados e desidratados com álcool 100%, 95%, 80% e 70%. Em seguida, as seções foram imersas em paraformaldeído a 4%, seguido de incubação com tampão de citrato de sódio 0,1% Triton X-100 por 20 min e a mistura de reação TUNEL por 1–1,5 h. A seguir, os cortes foram desenvolvidos em solução de peroxidase e diaminobenzidina (DAB), contracorada por hematoxilina, desidratados em álcool gradiente, permeabilizados e selados em goma neutra. As seções foram observadas em um microscópio de luz para contagem de células TUNEL-positivas. Partículas amarelo acastanhado no núcleo foram definidas como células TUNEL-positivas (células apoptóticas).

Imunohistoquímica

As seções foram desparafinadas, hidratadas e recuperadas pelo antígeno citrato, e a catalase endógena foi bloqueada por 3% H ₂ O ₂ . Cada seção foi adicionada com soro de cabra (50 μL), incubado com o anticorpo primário (50 μL) e reagiu com o anticorpo secundário (50 μL) e estreptavidina marcada com peroxidase de rábano (50 μL). Os cortes foram revelados por DAB e contracorados por hematoxilina, seguida de desidratação gradiente com álcool, permeabilização com xileno e selamento de goma neutra. Os cortes foram observados ao microscópio (o citoplasma ou núcleo do tecido cerebral isquêmico era amarelo ou amarelo-acastanhado). Os valores de OD foram medidos e calculados a média.

RT-qPCR

A extração de RNA total de tecidos e células foi realizada por Trizol (Invitrogen). A expressão do mRNA foi analisada por qPCR usando SYBR Green PCR Mix (Applied Biosystems, CA, EUA) e o sistema de PCR em tempo real QuantStudio TM 6Flex (Applied Biosystems). Primers de transcrição reversa de haste-loop específicos e primers forward / reverse (BioTNT, Shanghai, China) foram projetados para analisar os níveis de miRNA. A Tabela 1 listou todos os primers. O 2 ^{- △△ CT} método foi adotado para calcular os níveis de miRNA ou mRNA.

Análise de Western Blot

As amostras de proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 10% e eletrotransferidas em uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Depois disso, a membrana de PVDF foi bloqueada com leite em pó desnatado a 5% em solução salina contendo Tris, sondada com os anticorpos primários e re-sondada com o anticorpo secundário por 2 h. Em seguida, as bandas de proteínas foram analisadas com tampão de fosfatase alcalina contendo Nitroblue cloreto de tetrazólio e 5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato e quantificadas pelo software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EUA). Os principais anticorpos foram STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, EUA) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA).

Ensaio do gene Dual Luciferase Reporter

O STAT3 3′UTR contendo sítios de ligação miR-326-5p de tipo selvagem (WT) ou mutante (Mut) foi clonado no vetor pmirGLO (Promega, WI, EUA), denominado como STAT3-WT e STAT3-Mut. As células foram semeadas em uma placa de 24 poços em 2 × 10 ⁴ células / poço e co-transfectadas com 100 ng de STAT3-WT ou vetor de luciferase STAT3-Mut e 50 nM miR-326-5p agomir ou it agomir NC em 70% de confluência. A atividade da luciferase foi medida usando o Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Corporation, WI, EUA).

Análise estatística

O software estatístico SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) foi usado para a análise dos dados. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). A diferença entre dois grupos foi analisada pelo teste t de Student, enquanto as comparações múltiplas foram analisadas pela análise de variância (ANOVA) de um fator, seguida pelo teste post hoc de Tukey. P representou teste bilateral e P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A regulação para cima de miR-326-5p ou a regulação para baixo de STAT3 atenua a apoptose de neurônios corticais tratados com OGD

Cultivados por uma semana, os neurônios corticais dos ratos foram diferenciados e amadurecidos. Microscopicamente, os neurônios mostraram corpos neuronais maiores, citoplasma mais transparente, núcleo grande com baixa densidade e forte índice de refração. Os corpos dos neurônios eram cônicos ou redondos e os dendritos eram escalonados e aderidos às paredes (Fig. 1a, b). NES foi um marcador químico específico de neurônios cerebrais para localizar neurônios com alta especificidade por meio de ensaio de imunofluorescência. Os neurônios se ligaram especificamente ao NES e mostraram fluorescência verde (Fig. 1c).

O ensaio de MTT foi aplicado para detectar a viabilidade dos neurônios corticais (Fig. 1d). Os resultados demonstraram que a viabilidade do neurônio cortical de rato foi prejudicada no grupo OGD e no grupo miR-326-5p agomir + oe-STAT3 versus o grupo controle e o grupo miR-326-5p agomir, mas aumentou no miR-326-5p grupo agomir e grupo sh-STAT3 contra o grupo NC (todos P <0,05).

A apoptose do neurônio cortical de rato foi determinada por citometria de fluxo, enquanto a expressão de Bcl-2 e Bax mRNA por RT-qPCR (Fig. 1e-g). Os resultados explicaram que, em comparação com o grupo de controle e o grupo miR-326-5p agomir, o grupo OGD e o grupo miR-326-5p agomir + oe-STAT3 demonstraram aumento da taxa de apoptose, redução da expressão de Bcl-2 e aumento da expressão de Bax (todos P <0,05). Com os grupos NC, ao contrário, a taxa de apoptose foi reduzida, o nível de Bcl-2 foi elevado e o nível de Bax foi suprimido no grupo agomir miR-326-5p e no grupo sh-STAT3 (todos P <0,05).

A regulação ascendente de miR-326-5p ou a regulação descendente de STAT3 aumenta o Mfn2 e o nível potencial da membrana mitocondrial em neurônios corticais após lesão de OGD

A expressão de Mfn2 em neurônios corticais tratados com OGD foi detectada por análise de western blot (Fig. 2a, b). Com relação ao grupo de controle e ao grupo miR-326-5p agomir, a expressão da proteína Mfn2 reduziu no grupo OGD e no grupo miR-326-5p agomir + oe-STAT3, enquanto aumentou no grupo miR-326-5p agomir e sh Grupo -STAT3 versus o grupo NC (todos P <0,05).

O potencial de membrana mitocondrial detectado por JC-1 descobriu que (Fig. 2c, d) em relação ao grupo de controle e grupo agomir miR-326-5p, o nível de potencial de membrana mitocondrial diminuiu no grupo OGD e o agomir miR-326-5p + Grupo oe-STAT3 (todos P <0,05). Em relação aos grupos NC, o nível de potencial de membrana mitocondrial aumentou no grupo miR-326-5p agomir e no grupo sh-STAT3 (todos P <0,05).

Os conteúdos de ROS e MDA e as atividades de GSH e SOD em neurônios corticais tratados com OGD foram determinados e os resultados indicaram que versus o grupo controle e o grupo miR-326-5p agomir, o grupo OGD e o miR-326-5p agomir + oe O grupo -STAT3 apresentou conteúdo de ROS e MDA aumentados e atividades de GSH e SOD prejudicadas (todos P <0,05). Em comparação com os grupos NC, o grupo agomir miR-326-5p e o grupo sh-STAT3 apresentaram conteúdo reduzido de ROS e MDA e atividades de GSH e SOD reforçadas (todos P <0,05) (Fig. 2e – g).

A regulação ascendente de miR-326-5p ou a regulação negativa de STAT3 impede o dano patológico de neurônios corticais e inibe a apoptose em ratos com CI / RI

A coloração HE foi adotada para observar o dano patológico dos tecidos cerebrais (Fig. 3a, b), mostrando que no grupo sham, os neurônios eram normais em estrutura e ordenadamente arranjados com citoplasma vermelho pálido, núcleo azul e nucléolo claro. No grupo MCAO, no grupo NC e no grupo miR-326-5p agomir + oe-STAT3, com exceção da necrose, observou-se que os neurônios estavam desordenadamente arranjados e com coloração mais escura, com ruptura da membrana nuclear, desaparecimento da estrutura celular, carioponose profunda núcleo corado e lise em grande quantidade. No grupo agomir miR-326-5p e no grupo sh-STAT3, o inchaço dos neurônios foi aliviado e os neurônios foram organizados em ordem, e as células necróticas foram reduzidas, indicando um melhor status em relação ao grupo MCAO e ao grupo NC.

A coloração TUNEL foi utilizada para a detecção de apoptose neuronal e RT-qPCR para a expressão de mRNA de Bcl-2 e Bax em tecidos cerebrais. Os resultados mostraram que (Fig. 3c-e) em comparação com o grupo sham e o grupo miR-326-5p agomir, a taxa TUNEL-positiva aumentou, a expressão de mRNA de Bcl-2 diminuiu e a expressão de mRNA de Bax aumentou no grupo MCAO e o grupo miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (todos P <0,05). Baixa taxa TUNEL-positiva e expressão de mRNA de Bax, e maior expressão de mRNA de Bcl-2 foram mostradas no agomir miR-326-5p e no grupo sh-STAT3 do que no grupo NC (todos P <0,05).

A regulação ascendente de miR-326-5p ou a regulação descendente de STAT3 aumenta o nível potencial da membrana mitocondrial em tecidos cerebrais em ratos com CI / RI

A detecção da expressão da proteína Mfn2 em tecido cerebral de rato foi realizada por imuno-histoquímica, e os resultados mostraram que (Fig. 4a, b) a expressão da proteína Mfn2 mais baixa foi testada no grupo sham e no grupo agomir miR-326-5p versus o grupo MCAO e o miR-326-5p agomir + oe-STAT3 grupo, enquanto a maior expressão da proteína Mfn2 foi medida no grupo miR-326-5p agomir e o grupo sh-STAT3 em vez do grupo NC (todos P <0,05).

A detecção do nível de potencial de membrana mitocondrial descobriu que (Fig. 4c) em comparação com o grupo sham e o grupo agomir miR-326-5p, o nível de potencial de membrana mitocondrial diminuiu no grupo MCAO e no miR-326-5p agomir + oe-STAT3 grupo, enquanto aumentou no grupo agomir miR-326-5p e no grupo sh-STAT3 em contraste com o grupo NC (todos P <0,05).

miR-326-5p Targets STAT3

A expressão de miR-326-5p e STAT3 em neurônios corticais e tecidos cerebrais foi detectada por RT-qPCR e análise de western blot. Em neurônios corticais in vitro, uma diminuição sugerida na expressão de miR-326-5p e um aumento na expressão de STAT3 no grupo OGD em relação ao grupo de controle (ambos P <0,05). Com relação ao grupo NC, expressão de miR-326-5p elevada e expressão de STAT3 reduzida no grupo agomir miR-326-5p (ambos P <0,05); Expressão STAT3 diminuída ( P <0,05) no grupo sh-STAT3. Em contraste com o grupo miR-326-5p agomir, a expressão de STAT3 foi aumentada no grupo miR-326-5p agomir + oe-STAT3 ( P <0,05) (Fig. 5a – c).

Em tecidos cerebrais in vivo, em relação ao grupo sham, menor miR-326-5p e maior STAT3 apareceu no grupo MCAO (ambos P <0,05). Em relação ao grupo NC, a expressão de miR-326-5p aumentou enquanto a expressão de STAT3 diminuiu no grupo de agomir miR-326-5p (ambos P <0,05). A expressão de STAT3 diminuiu no grupo sh-STAT3 ( P <0,05). Com o grupo miR-326-5p agomir por contraste, a expressão de STAT3 elevada no grupo miR-326-5p agomir + oe-STAT3 ( P <0,05) (Fig. 5d – f).

Os potenciais locais de segmentação miR-326-5p em STAT3 3′UTR foram encontrados por DIANA e software miRDB (Fig. 5g). STAT3 3′UTR contendo o local de ligação WT miR-326-5p e local de ligação Mut foram construídos e inseridos no plasmídeo pmirGLO. A ligação de miR-326-5p a STAT3 3′UTR foi ainda validada por ensaio repórter de luciferase. O ensaio de repórter de luciferase revelou que miR-326-5p agomir reduziu a atividade relativa de luciferase de STAT3-WT, mas não STAT3-Mut (Fig. 5h), implicando que STAT3 era um gene alvo direto de miR-326-5p.

Discussão

CI / RI é a principal causa de morte cerebrovascular [22]. Os miRNAs são indicados para estar envolvidos em CI / RI [23]. No entanto, o entendimento abrangente do mecanismo relacionado ao miR-326-5p ainda é insuficiente em CI / RI. Assim, este estudo tem como objetivo descobrir os papéis concretos de miR-326-5p em CI / RI com ênfase no recíproco combinado de miR-326-5p e STAT3. Produtivamente, este estudo declarou que a regulação positiva de miR-326-5p atenuou CI / RI e elevou a expressão de Mfn2 por meio da inibição de STAT3.

No início, a expressão de miR-326-5p foi determinada para reduzir em CI / RI in vivo e in vitro. Posteriormente, organizamos uma série de ensaios e descobrimos que a regulação positiva do miR-326-5p aumentou a viabilidade dos neurônios e a função mitocondrial, elevou a expressão de Mfn2 e restringiu o estresse oxidativo e a apoptose. Além disso, experimentos in vivo em ratos verificaram ainda mais os papéis funcionais do miR-326-5p restaurado em CI / RI. Na verdade, está comprovado que miR-326 alto está correlacionado com a longa sobrevida global de pacientes com glioblastoma, o tipo comum de tumor cerebral [24]. Além disso, a expressão do miR-326 foi ainda evidenciada como sendo reduzida na doença de Parkinson e o miR-326 poderia suprimir a apoptose de neurônios dopaminérgicos e reduzir a resposta inflamatória [25]. Exceto por isso, a redução no miR-326-5p se manifesta nas células progenitoras endoteliais no curso do infarto do miocárdio, e a introdução de superexpressão de células progenitoras endoteliais pode promover a recuperação da função cardíaca [11]. Houve um estudo que ilustra que a regulação positiva de miR-326 melhora a função comportamental, aumenta a viabilidade neuronal e deprime a apoptose neuronal em camundongos com doença de Alzheimer [26]. Além disso, está documentado que a regulação positiva de miR-326 pelo mimetizador de miR-326 pode suprimir a óxido nítrico sintase induzível em neurônios dopaminérgicos na doença de Parkinson [27].

Neste estudo, descobrimos que STAT3 era um gene alvo de miR-326-5p. Apoiado por um estudo avançado, é indicado que a expressão de STAT3 é negativamente regulada por miR-326 em células-tronco de carcinoma endometrial humano [28]. No presente estudo, medimos que a expressão de STAT3 foi aumentada em CI / RI. Atualmente, foi descoberto que a lesão de I / R e OGD induziriam a expressão de STAT3 a aumentar [29]. Curiosamente, a expressão de mRNA de STAT3 tende a um incremento em animais I / R [30]. Além disso, é relatado que a expressão da proteína STAT3 regula positivamente em CI / RI [31]. Em seguida, nosso estudo revelou que a regulação negativa de STAT3 teve efeitos terapêuticos em ratos CI / RI e neurônios tratados com OGD. Conforme apoiado por um estudo, conclui-se que a indução de miR-31 desestimula o estresse oxidativo pela inativação da via JAK / STAT3 no AVC isquêmico [32]. Além disso, a inibição da via JAK2 / STAT3 é benéfica para o comprometimento do estresse oxidativo em CI / RI [31]. Além disso, o knockdown da via JAK / STAT3 é identificado para aumentar a viabilidade celular e reduzir o estresse oxidativo e a apoptose de neurônios em lesão cerebral isquêmica [33]. Ultimamente, a via de sinalização JAK / STAT3 inibida é testemunhada para aliviar o infarto do miocárdio na lesão de I / R do miocárdio [34]. Como demonstrado, o STAT3 depletado prejudica a apoptose neuronal em ratos com lesão de substância branca [35]. Além disso, a supressão da apoptose neuronal e o alívio do tamanho do infarto cerebral são atribuídos à inibição de JAK2 / STAT3 em ratos com CI / RI [36].

Finalmente, nos concentramos nos efeitos de miR-326-5p e STAT3 na expressão de Mfn2 e descobrimos que o nível reduzido de Mfn2 em ratos com CI / RI e neurônios tratados com OGD poderia ser elevado restaurando miR-326-5p ou silenciando STAT3 . Conforme implicado por um estudo anterior, está documentado que Mfn2 está diminuído na última fase de reperfusão e mal expresso de Mfn2 exacerba CI / RI por meio da formação de autofagossomo restringida e fusão de autofagossomo e lisossoma [18]. Além disso, Mfn2 está implícito para reduzir até mesmo o desaparecimento na lesão de I / R em hepatócitos antigos [37]. No entanto, poucas pesquisas discutiram o mecanismo regulatório de miR-326-5p e STAT3 para Mfn2.

Conclusão

Em geral, este estudo elucidou os mecanismos de que miR-326-5p elevado inibe a apoptose neuronal, atenua o dano patológico dos neurônios e aumenta a expressão de Mfn2 via regulação negativa de STAT3 em CI / RI. O estudo pode atualizar o mecanismo potencial de miR-326-5p e STAT3 em CI / RI. No entanto, mais estudos ainda são necessários para um maior desenvolvimento do mecanismo molecular em CI / RI.

Disponibilidade de dados e materiais

Não aplicável.

Abreviações

miRNAs:: MicroRNAs
STAT3:: Transdutor de sinal e ativador da transcrição-3
OGD:: Privação de oxigênio e glicose
MCAO:: Oclusão da artéria cerebral média
ROS:: Espécies que reagem ao oxigênio
STAT:: Transdutores de sinal e ativador transcricional
Mfn2:: Mitofusina-2
FITC:: Isotiocianato de fluoresceína
NES:: Nestin
NC:: Controle negativo
Oe:: Superexpressão
RT-qPCR:: Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa
OD:: Densidade ótica
PI:: Iodeto de propídio
MDA:: Malondialchehyche
GSH:: Glutationa
SOD:: Superoxido dismutação
DAB:: Diaminobenzidina
PVDF:: Fluoreto de polivinilideno
WT:: Tipo selvagem
Mut:: Mutante
SD:: Desvio padrão
ANOVA:: Análise de variância unilateral

Formação e avaliação de substrato de silício com camadas de Si poroso altamente dopado formadas por corrosão química assistida por metal Sulfato de condroitina / policaprolactona / nanofibras eletrofiadas de gelatina com antitrombogenicidade e afinidade celular endotelial aprimorada como um andaime potencial para engenharia de tecidos …

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