Nanopartículas Bimetálicas Cu:Ag: Eficácia Antibacteriana Aumentada Contra Cepas Resistentes a Antibióticos – Estudo de Docagem Molecular

Métodos

Materiais

Cloreto de cobre (II) (CuCl₂·0,2H₂O, 98,9%) e nitrato de prata (AgNO₃) como precursores, polivinilpirrolidona (PVP, peso molecular médio de 40.000) como agente estabilizador, borohidreto de sódio (NaBH₄, 99,9%) e ácido L-ascórbico (C₆H₈O₆, 99,0%) como agentes redutores e hidróxido de amônio (NH₄OH) foram utilizados no presente estudo após aquisição da Sigma Aldrich, EUA.

Síntese de NPs Bimetálicas Cu:Ag

NPs bimetálicas Cu:Ag foram preparadas usando o método de co-precipitação conforme retratado na Fig. 1. Em água desionizada, 1,25 g de PVP e 0,5 g de ácido ascórbico foram adicionados e agitados vigorosamente a 100 °C. Duas soluções de 40 mL de hidróxido de amônio foram preparadas individualmente; em uma solução, 1,7 g de cloreto de cobre e na outra 1,7 g de nitrato de prata foram adicionados. Estas duas soluções são então vertidas uma após a outra na solução inicialmente preparada com a adição de 0,5 g de NaBH₄. Posteriormente, a solução final foi agitada a 100 °C por 4 h para torná-la homogênea e depois centrifugada a 6000 rpm para extração completa das NPs. As NPs bimetálicas obtidas foram secas a 100 °C para eliminação completa de umidade e impurezas, garantindo que os produtos bimetálicos preparados estavam em forma pura [12]. Similarmente, quatro amostras com várias concentrações de Ag (mol 2,5%, 5%, 7,5% e 10%) foram preparadas com razões fixas de Cu.

Atividade Antimicrobiana

O potencial bactericida in vitro de NPs bimetálicas Cu:Ag foi avaliado contra bactérias patogênicas S. aureus, E. coli e A. baumannii isoladas de leite mastítico bovino usando o método de difusão em poços. Ágar sal manitol, ágar MacConkey e ágar Lauria Bertani foram espalhados com bactérias isoladas com crescimento ativado 1,5 × 10⁸ UFC/mL. Após solidificação do meio, cinco poços foram preparados usando pipeta amarela com dimensões de 15 mm de diâmetro e dez microlitros (5 µg/mL). NPs bimetálicas Cu:Ag recém-preparadas foram carregadas nos poços com diferentes razões em comparação com dez microlitros de amoxicilina (5 µg/mL) como controle positivo e 50 µL de ADI como controle negativo. A atividade bactericida das NPs bimetálicas Cu:Ag sintetizadas foi determinada medindo zonas de inibição (em mm) formadas após incubação por 15 h a 37 °C.

Análise Estatística

A atividade bactericida das NPs sintetizadas com medidas de zona de inibição (mm) foi considerada estatisticamente significativa usando SPSS 20.0, análise de variância unidirecional (ANOVA) [57].

Estudo de Docagem Molecular

Antibióticos diminuem o crescimento bacteriano e causam morte de bactérias através de danos à parede celular, interrupção de processos bioquímicos, danos à membrana celular e penetração através de biofilme [38]. Nas últimas décadas, muitas nanopartículas com potencial atividade bactericida foram relatadas, que matam bactérias seja através de disrupção da parede celular ou bloqueando a fonte de alimento por mecanismo similar a antibióticos conhecidos [39,40,41]. Portanto, enzimas pertencentes a estas vias bioquímicas são consideradas alvos importantes e atraentes para descoberta de antibióticos [12]. Aqui, enzimas-chave da via biossintética da parede celular (i.e., β-lactamase) e da via biossintética de ácidos graxos (i.e., FabH e FabI) foram selecionadas como alvos possíveis para avaliar o mecanismo de interação de NPs bimetálicas Cu:Ag com seu bolsão ativo como inibidores (ver Fig. 2).

Parâmetros estruturais 3D das enzimas selecionadas foram obtidos do Protein Data Bank com código PDB: 4U0X (Resolução 2,03 Å) para β-lactamase [42] e 6AH9; Resolução 1,74 Å [43] para redutase enoil-[proteína transportadora de acil] (FabI) de A. baumannii. A β-lactamase (estrutura 3D) com ID PDB: 1MWU; Resolução 2,6 Å [44] e FabI com código PDB: 4CV1; Resolução 1,95 [45] de S. aureus, enquanto para FabH de E. coli tem código PDB: 4Z8D; Resolução 2,0 Å [46].

O estudo de docagem molecular de NPs bimetálicas Cu:Ag foi realizado usando software ICM Molsoft v3.8–4a ou superior (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) para identificar interações de ligação com resíduos-chave do sítio ativo [47]. A ferramenta de preparação de proteína/receptor do ICM foi usada para otimização e preparação da estrutura dos alvos enzimáticos selecionados. As etapas envolveram adição de átomos de H polares, deleção de moléculas de água e minimização de energia usando parâmetros padrão. A molécula de ligante co-cristalizada foi removida para dar espaço para docagem das NPs. O bolsão de ligação foi definido usando caixa de grade especificando a posição do ligante cristalizado. A conformação com menor energia de ligação das 10 conformações docadas superiores foi selecionada em cada caso para analisar padrão de interação e tendência de ligação de NPs bimetálicas Ag-Cu dentro do bolsão ativo. Softwares Pymol e Discovery Studio Visualizer foram empregados para análise e representação 3D das interações de ligação [48]. A estrutura de NPs bimetálicas Cu:Ag foi recuperada do PubChem em formato .sdf.

Caracterização

Análise estrutural e pureza de fase foram observadas usando DRX (PAN analytical X'pert pro DRX) com radiação Cu-Kα (λ = 0,154 nm, 20° a 80°). A presença de modos vibracionais correspondentes a vários grupos funcionais foi avaliada usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) com espectrômetro Perkin Elmer. Espectros de absorção foram adquiridos usando espectrofotômetro UV-visível Genesys 10S. MEV de emissão de campo acoplado com espectrômetro EDS (JSM-6610LV) e HR-TEM (JEOL JEM 2100F) foram empregados para visualizar morfologias de superfície. O software ICM v3.8-4a ou superior (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) foi usado para análise de docagem molecular.

Resultados e Discussão

A análise de DRX foi realizada para avaliar a constituição de fases e estrutura cristalina dos produtos formulados. A Figura 3a revela o padrão de DRX plotado entre 20° e 80°. No bimetálico Cu:Ag, reflexos observados em ~ 38,2°, 46°, 64,4° e 77,1° são atribuídos aos facetas (111), (200), (220) e (311) da fase fcc Ag de acordo com JCPDS No. 04-0783 [32, 49,50,51,52]. No caso de Cu, difrações aparecendo em 32,6°, 44,2° e 51° denotaram planos de rede (110), (111) e (200) que confirmaram a presença de CuO estruturado fcc e Cu metálico, respectivamente, e bem correspondentes com JCPDS No. 04-0836 [32, 53,54,55,56]. No padrão extraído, picos de Ag e Cu foram observados, significando a presença de NPs constituindo ambas as fases Ag e Cu. Além disso, a existência de CuO em amostras com menor teor de Ag (ex.: 1:0,025, 1:0,050 e 1:0,075) revela que NPs de Cu foram oxidadas e exibiram comportamento não protetor em alta temperatura devido a menores concentrações de Ag [52]. Inversamente, na amostra com maior teor de Ag (1:0,1), pico de CuO exibe baixa intensidade, indicando formação de produto parcialmente livre de óxido [57]. Isso sugere que resistência à oxidação melhorada de NPs bimetálicas ocorrerá devido à adição de Ag [52]. Nenhum pico adicional de impureza foi detectado dentro dos limites de detecção do instrumento enquanto cada plano cristalográfico compreende sítios energeticamente distintos baseados em densidade atômica. Tanto NPs de Cu quanto de Ag têm facetas de alta densidade atômica em (111) que serviram para expor a orientação máxima de planos [51, 58]. Usando a lei de Bragg, o espaçamento d de Ag e Cu foram encontrados como 0,24 e 0,21 nm, respectivamente, que correspondem ao plano distinto (111) de ambos os elementos e estava em linha com achados de HR-TEM (Fig. 6) [51, 59,60,61,62]. Anéis SAED correspondentes (Fig. 3b-d) obtidos dos produtos bimetálicos preparados exibem padrões de anéis distintos que demonstram produtos bem cristalizados e concordam bem com padrões de DRX.

Espectros FTIR foram registrados entre 500 e 4000 cm⁻¹ conforme apresentado na Fig. 3e; a banda transmitida posicionada entre 600 e 900 cm⁻¹ é causada pela formação de ligação Cu:Ag [63]. A banda observada em ~ 1200 e 1400 cm⁻¹ é atribuída a C-O e C-H, respectivamente; picos aparecendo em ~ 1800 e 2100 cm⁻¹ correspondem a ligações C=O e N-H devido a PVP e NH₄OH [64]. Transmitâncias observadas em ~ 2800 cm⁻¹ e 3400 cm⁻¹ são atribuídas à presença de C≡N e grupo hidroxila (O-H) [64].

A Figura 4a mostra os espectros de absorção de NPs bimetálicas Ag-Cu com bandas de absorção claras situadas em 340, 410 e 500 nm, que são atribuídas à absorção de ressonância plasmônica de superfície de Ag e Cu metálicos [52]. A banda aparecendo em 410 nm tipicamente surge devido à presença de NPs de Ag, e o pico posterior posicionado em 510 nm é atribuído à existência de NPs de Cu [52, 57,58,59, 65,66,67]. Pode-se sugerir que NPs bimetálicas são desenvolvidas com fases distintas de Ag e Cu, em vez de desenvolvimento bimetálico, o que também foi afirmado pelos resultados de DRX discutidos anteriormente [52]. Leve deslocamento para o vermelho na banda de absorção em 410 nm e aumento na absorção máxima com aumento do teor de Ag foram observados [58]. Usando a equação de Tauc,

$$[\alpha h\nu = K\left( {h\nu - E_g} \right)^{n} ]$$ (1)

onde α é considerado coeficiente de absorção [2,303 log(T/d), T é luz transmitida e d mostra espessura da célula de amostra], h simboliza constante de Planck (6,62607015 × 10⁻³⁴ Js), \(\nu\) é frequência da luz, K mostra índice de absorção, e E_g é igual à energia da banda de energia em eV. O valor de "n" está relacionado ao tipo de transição eletrônica da banda de energia [13, 26, 68, 69]. A banda de energia dos produtos bimetálicos preparados foi calculada e encontrada como 3,2, 2,9, 2,7 e 2,6 eV, conforme demonstrado na Fig. 4b-e.

De imagens de MEV (Fig. 5a-d) de nanocompósitos bimetálicos Cu:Ag como sintetizados, observou-se que partículas de pequeno tamanho foram depositadas na superfície de partículas grandes. Um aumento no teor de Ag de 2,5 a 7,5% levou à formação de várias partículas com morfologia variável que finalmente culminou em NPs Cu:Ag volumosas. Além disso, acúmulo de partículas de Ag irregulares e minúsculas foi aumentado com o aumento da concentração de dopante, sugerindo aparecimento de mais blocos espalhados em sua superfície. Isso significa a grande influência que a dopagem de Ag em Cu tem na morfologia, o que foi confirmado adicionalmente com micrografias de HR-TEM (ver Fig. 5e-h).

Para elaborar ainda mais sobre a morfologia e espaçamento d do bimetálico preparado, HR-TEM com resolução de 10 nm foi empregado. Na Fig. 6a, espaçamento d (0,21 nm) de NPs de Cu corresponde à faceta (111) de Cu, como também evidente nos resultados de DRX (Fig. 3a). A Figura 6b retrata leve aumento no espaçamento de camada (0,21 a 0,22 nm) e mostra NPs de Ag com distância interplanar de 0,24 nm que corresponde ao plano (111). Similarmente, Fig. 6c, d mostra espaçamentos de camada calculados e fases separadas do bimetálico enquanto Fig. 6e demonstra forma de partícula de NPs de Ag e Cu. As partículas em imagens de HR-TEM são vistas possuindo estrutura núcleo-casca. Na Fig. 6d dentro de uma única partícula, franjas de rede emanando de Cu e Ag foram registradas. Isso sugere fortemente a formação de NPs bimetálicas núcleo-casca com diferentes razões Cu:Ag produzindo NPs quase-esféricas irregulares. Além disso, imagem de TEM mostrou partículas parecendo regiões escuras e claras. Esta variação de contraste dentro de uma única partícula pode indicar a presença de dois materiais constituintes distintos sugerindo a criação de partículas bimetálicas Cu:Ag [70, 71].

A presença de pico distinto no espectro EDS e composição elementar originária do bimetálico afirmou a formação bem-sucedida de NPs Cu:Ag. A Figura 7a representa espectro EDS obtido da amostra 1:0,050 que mostra picos claros de Cu e Ag. A Figura 7b é retirada da amostra 1:0,10 onde picos para C e O foram detectados em amostras dopadas. Estes aparecem pois abas de carbono são utilizadas para segurar amostras durante exame de MEV e/ou devido a contagens de fundo no sensor MEV-EDS.

A eficácia bactericida in vitro de NPs bimetálicas Cu:Ag usando ensaio de difusão em poços de ágar é apresentada na Tabela 1. Os resultados demonstram relação diretamente proporcional entre concentração de NPs sintetizadas e zonas de inibição (mm). Zonas de inibição estatisticamente significativas (P < 0,05) registradas para (2,5, 5, 7,5 e 10% em peso) dopante Ag contra S. aureus, E. coli e A. baumannii variaram de 0,85–2,8 mm, 0,55–1,95 mm e 0,65–1,85 mm, respectivamente, ver Tabela 1. Todos os resultados foram comparados com ADI (0 mm) e amoxicilina (4 mm) como controle negativo e positivo, respectivamente. Similarmente, % de eficácia de NPs dopadas aumentou (21,2–70%), (13,7–48,7%) e (16,2–46,2%) contra S. aureus, E. coli e A. baumannii, respectivamente. No geral, NPs bimetálicas Cu:Ag foram mais potentes contra S. aureus (Gram-positivo) comparadas com E. coli e A. baumannii (Gram-negativo).

Tamanho, concentração e forma de NPs afetam diretamente o estresse oxidativo produzido por nanoestruturas. A eficácia bactericida na forma de zonas de inibição (mm) melhorou devido a maior dopagem em % em peso de NPs bimetálicas Ag-dopado Cu devido à maior disponibilidade de cátions (++). A ação bactericida em relação a tamanho e concentração descreve uma relação inversa com o tamanho [58, 59]. Nanoestruturas produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) eficientemente que residem em membranas celulares bacterianas levando à extrusão de organelas celulares e, finalmente, morte das bactérias [60]. Além da produção de ROS, interação catiônica de Ag⁺ e Cu⁺⁺ com partes carregadas negativamente da membrana celular bacteriana resulta em eficácia bactericida aprimorada em concentrações crescentes através de lise celular e colapso bacteriano [58, 61].

Aplicações biológicas de várias classes de nanopartículas têm sido extensivamente estudadas nas últimas décadas. Devido às características únicas de NPs, elas têm sido amplamente utilizadas por seu potencial como agentes bactericidas com capacidade de substituir antibióticos tradicionais. NPs interagem com células bacterianas, interrompem permeação de membrana celular e destroem vias metabólicas-chave [72]. O mecanismo específico de toxicidade de nanopartículas para bactérias precisa ser explorado. Acredita-se que NPs interagem com célula bacteriana envolvendo forças eletrostáticas, forças de van der Waals ou interações hidrofóbicas que finalmente resultam em morte das bactérias. Enzimas têm sido relatadas como principal fator de virulência envolvido em infecção bacteriana e alvejá-las para inibir sua atividade ajuda a combater a infecção causada [73]. Aqui, estudo de docagem molecular de NPs Cu:Ag contra alvos enzimáticos da parede celular junto à via biossintética de ácidos graxos identificou padrão de interação de ligação dessas NPs dentro do bolsão ativo. Tendo em vista o potencial antibacteriano in vitro dessas NPs contra A. baumannii, S. aureus e E. coli, os alvos enzimáticos foram selecionados destes microrganismos para obter insight sobre possível mecanismo por trás de sua atividade bactericida.

Melhor conformação docada observada no caso de NPs Bimetálicas Cu:Ag com β-lactamase de A. baumannii revelou interação de ligação de hidrogênio com Glu272 (2,8 Å) e Ser286 (3,2 Å) junto com interação de contato metálico com Val292 enquanto o escore de docagem foi −4,013 kcal/mol (Fig. 8a). Similarmente, escore de ligação de NPs bimetálicas Ag-Cu observado contra β-lactamase de S. aureus foi −4,981 kcal/mol possuindo interação de ligação de hidrogênio com Ser403 (3,2 Å), Tyr519 (3,6 Å), Gln521 (3,0 Å) e Asn464 (3,1 Å) conforme mostrado na Fig. 8b.

Segundo alvo enzimático selecionado no estudo atual, FabI, pertence à via biossintética de ácidos graxos e previsões de docagem molecular sugeriram NPs bimetálicas Cu:Ag como inibidor potencial contra este alvo. NPs Bimetálicas Cu:Ag mostraram bom escore de ligação (-3,385 kcal/mol) contra FabI de A. baumannii tendo ligação de hidrogênio com Ser201 (2,7 Å), Ala199 (3,5 Å) e Leu198 (3,3 Å) conforme representado na Fig. 8c. Similarmente, melhor conformação docada de NPs Ag-Cu com sítio ativo de FabI de S. aureus mostrou ligação de hidrogênio com Gly202 (2,5 Å) e Gln155 (2,5 Å) tendo escore de ligação −3,012 kcal/mol (Fig. 8d).

Além disso, a capacidade de ligação de NPs bimetálicas Cu:Ag contra FabH de E. coli também foi avaliada e o escore de ligação observado foi −4,372 kcal/mol tendo interação de ligação de hidrogênio com Thr254 (3,5 Å), HIE244 (2,6 Å) e Glu302 (3,0 Å) mostrado na Fig. 8e.

Conclusão

Nanopartículas bimetálicas Cu:Ag foram preparadas através do método de co-precipitação para uso em aplicações para combater doenças relacionadas a bactérias. Perfis de DRX confirmaram a presença de CuO estruturado fcc e Cu metálico e partículas de Ag. Picos de Ag e Cu foram observados, significando NPs bimetálicas envolvendo fases Ag e Cu. Planos observados na análise de DRX correspondem bem a anéis SAED. Grupos químicos anexados aos produtos formulados e banda de transmitância característica entre 600 e 900 cm⁻¹ foi causada pela formação de ligação Cu:Ag. Os espectros plotados de UV-vis mostraram absorção em 410 nm que tipicamente surge devido à presença de NPs de Ag, e pico posterior posicionado em 510 nm foi atribuído à existência de NPs de Cu. As partículas em imagens de HR-TEM foram vistas tendo estrutura núcleo-casca. NPs Cu:Ag claramente mostraram formação de NPs bimetálicas com diferentes razões Cu:Ag produzindo NPs quase-esféricas irregulares. Além disso, espaçamento d de NPs de Cu i.e., 0,21 nm corresponde à faceta (111) de Cu detectada nos resultados de DRX. Leve aumento no espaçamento de camada (de 0,21 a 0,22 nm) também mostra que NPs de Ag com distância de camada de 0,24 nm correspondeu ao plano (111). Estudo de docagem molecular mostrou boa concordância com atividade bactericida in vitro. A tendência de ligação de NPs bimetálicas Cu:Ag contra enzima β-lactamase da via biossintética da parede celular junto com enzimas FabI e FabH da via biossintética de ácidos graxos demonstrou seu potencial de inibição que precisa ser explorado mais através de estudos de inibição enzimática.