Nanopartículas de Albumina Sérica Humana Carregadas com Resveratrol e Direcionadas por PEG–RGD: Circulação Prolongada, Biocompatibilidade Aprimorada e Supressão Potente de Tumor Pancreático

Resumo

A albumina sérica humana (HSA) é um transportador natural, não imunogênico, que pode encapsular fármacos lipofílicos e melhorar sua farmacocinética. Projetamos nanopartículas de HSA carregadas com resveratrol (RV) conjugadas com arginina-glicina-aspartato (RGD) via um ligante de polietileno glicol (PEG) (NPs HRP–RGD) para alcançar entrega direcionada a tumores pancreáticos. As nanopartículas exibem diâmetro uniforme de 120 ± 2,6 nm, eficiência de encapsulação de RV de 62,5 ± 4,21%, e liberação sensível a pH de 58,4 ± 2,8% a pH 5,0 e 37 °C. Revestimentos de PEG e HSA melhoram marcadamente a biocompatibilidade do RV. Imagem confocal mostra captação de 47,3 ± 4,6% das NPs HRP–RGD em células PANC-1, superando controles não direcionados. In vivo, as NPs HRP–RGD estendem a meia-vida do RV 5,43 vezes, alcançando acúmulo tumoral 3,01 e 8,1 vezes maior que NPs HRP e RV livre, respectivamente. O tratamento de camundongos portadores de tumor com NPs HRP–RGD suprimiu completamente o crescimento tumoral por 35 dias, sem toxicidade sistêmica. Esses dados demonstram que as NPs HRP–RGD fornecem uma plataforma robusta e biocompatível para terapia direcionada de câncer pancreático.

Introdução

O câncer pancreático permanece uma das malignidades mais letais, com sobrevida média inferior a seis meses e taxa de sobrevida de 5 anos abaixo de 6%. Tratamentos convencionais — cirurgia, radioterapia e quimioterapia convencional — são prejudicados por efeitos colaterais graves e eficácia limitada. O resveratrol (RV), um polifenol natural de uvas e soja, mostra atividade anticancerígena em vários tipos de tumor, mas sofre de baixa solubilidade, depuração rápida e distribuição não específica. Estratégias de encapsulação, particularmente usando transportadores endógenos como HSA, podem aumentar a solubilidade do fármaco, estender a circulação e permitir funcionalização para direcionamento ativo. A HSA é não tóxica, não imunogênica e possui grupos carboxilo e amino reativos para conjugação. A PEGilação prolonga ainda mais o tempo de residência sanguínea.

Métodos

Materiais

Todos os reagentes foram obtidos da Sigma Aldrich, Seebio Biotech e Pierce Biotech. Albumina sérica humana (≥96% pureza), resveratrol (≥99%) e peptídeo RGD (≥97%) foram usados sem purificação adicional.

Síntese de Nanopartículas HSA–RV

Resveratrol (6 mg em 1 mg mL⁻¹ DMSO) foi misturado com HSA (10 mg mL⁻¹) e agitado por 6 h à temperatura ambiente para formar coacervados. Reticulação com 0,5% glutaraldeído (100 µL) seguida de diálise produziu NPs HSA–RV. NPs em branco foram preparadas identicamente sem RV.

Conjugação de PEG–RGD e Formação de NPs HRP–RGD

PEG-2000-COOH foi ativado com SATA e acoplado a RGD na presença de EDC, formando SATA-PEG-RGD. Após redução com hidroxilamina, o produto foi purificado e reagido com NPs HSA–RV ativadas com SPDP para produzir NPs HRP–RGD. Reagentes em excesso foram removidos por diálise e filtração.

Caracterização

• Tamanho e polidispersão: Espalhamento dinâmico de luz (DLS) e MEV.
• Carga do fármaco: Espectrofotometria UV-Vis a 306 nm.
• Cinética de liberação: Bolsa de diálise (MWCO 8–12 kDa) em PBS a pH 5,0, 6,5, 7,4, 9,0, 37 °C.

Biocompatibilidade e Hemólise

Hemácias foram incubadas com NPs HRP–RGD (10–200 µg mL⁻¹) por 3 h a 37 °C. Razões de hemólise foram calculadas contra PBS (controle negativo) e água desionizada (controle positivo).

Estudos Celulares

Células PANC-1 foram cultivadas em DMEM com 10% SFB. NPs HRP–RGD marcadas com FITC foram incubadas por 5 h, seguidas por imagem confocal e citometria de fluxo para avaliar captação. Citotoxicidade foi avaliada por ensaio CCK-8 em concentrações de 0–200 µg mL⁻¹. Morfologia apoptótica foi confirmada por coloração com Hoechst 33258.

Experimentos em Animais

Camundongos Balb/c nu foram injetados subcutaneamente com 1 × 10⁶ células PANC-1. Quando tumores atingiram ~80 mm³, camundongos foram randomizados (n = 5) em grupos de salina, RV, NPs HRP ou NPs HRP–RGD (10 mg kg⁻¹ equivalente a RV). Volume tumoral e peso corporal foram monitorados a cada 3 dias por 35 dias. Biodistribuição foi avaliada em 24 h via análise UV-Vis de tecido tumoral. Histopatologia de órgãos principais foi realizada post-mortem.

Resultados e Discussão

Fabricação e Propriedades Físico-Químicas das Nanopartículas

NPs HRP–RGD exibiram distribuição de tamanho estreita e unimodal (120 ± 2,6 nm) com morfologia esférica homogênea. Espectros UV-Vis confirmaram encapsulação de RV, enquanto emissão de fluorescência a 325 nm corroborou retenção de RV dentro das partículas.

Carga do Fármaco e Liberação Responsiva a pH

A eficiência de encapsulação atingiu pico de 62,5 ± 4,21%. Estudos de liberação mostraram liberação cumulativa de 58,4 ± 2,8% após 60 h a pH 5,0, comparado a taxas significativamente menores em pH fisiológico, destacando liberação tumor-específica.

Estabilidade e Biocompatibilidade Aprimoradas

Ao contrário do RV livre cristalino, NPs HRP–RGD permaneceram coloidalmente estáveis em PBS, DMEM e SFB por 4 semanas. Intensidade de fluorescência permaneceu >96% após 4 semanas, enquanto RV livre caiu para 12%. Ensaios de hemólise revelaram <5% hemólise até 200 µg mL⁻¹, correspondendo a controles de PBS.

Captação Celular Direcionada

Citometria de fluxo quantificou captação de 58,5 ± 3,5% das NPs HRP–RGD por células PANC-1, marcadamente maior que NPs HRP não direcionadas (16,2 ± 4,9%) e controles bloqueados com RGD (7,1 ± 5,1%). Imagem confocal corroborou entrega intracelular eficiente.

Atividade Antitumoral Potente In Vitro

NPs HRP–RGD exibiram citotoxicidade dependente de dose, reduzindo viabilidade de PANC-1 a <30% a 50 µg mL⁻¹, superando RV livre e NPs HRP. Coloração com Hoechst revelou condensação nuclear apoptótica característica.

Circulação Prolongada e Acúmulo Tumoral

NPs HRP–RGD estenderam a meia-vida plasmática do RV para 6,57 ± 0,9 h (vs. 1,21 ± 0,09 h para RV livre). Em 24 h, o conteúdo de RV no tumor no grupo HRP–RGD foi 3,01 e 8,1 vezes maior que NPs HRP e RV livre, respectivamente, indicando direcionamento eficaz por EPR e mediado por RGD.

Supressão Tumoral In Vivo e Segurança

O tratamento com NPs HRP–RGD interrompeu completamente o crescimento tumoral por 35 dias, sem recidiva. Pesos corporais permaneceram estáveis em todos os grupos. Histologia de coração, fígado, baço, pulmão e rim não mostrou alterações patológicas, confirmando segurança sistêmica.

Conclusões

NPs HRP–RGD representam uma plataforma clinicamente relevante que supera as limitações de solubilidade, farmacocinética e direcionamento do resveratrol livre. Combinando encapsulação em HSA, PEGilação e direcionamento por RGD, essas nanopartículas alcançam circulação sustentada, acúmulo tumor-específico e eficácia antitumoral robusta com toxicidade mínima. Este estudo suporta seu desenvolvimento adicional como modalidade terapêutica potente para câncer pancreático.

Abreviações

• CCK-8: Kit de Contagem Celular-8
• SFB: Soro Fetal Bovino
• FITC: Fluoresceína Isotiocianato
• HSA: Albumina Sérica Humana
• PEG: Polietileno Glicol
• RGD: Arginina-Glicina-Aspartato
• RV: Resveratrol
• PBS: Salino Fosfatado Tamponado