Entrega de tetraedro de DNA aumenta a apoptose induzida por doxorrubicina de células de câncer de cólon HT-29

Resumo

Como um carreador de droga nanométrica com a vantagem de modificabilidade e biocompatibilidade adequada, a entrega de DNA tetraedro (DNA tetra) tem esperança de aumentar a eficiência inibitória de drogas anticâncer não direcionadas. Nesta investigação, a doxorrubicina (Dox) foi montada em um tetra de DNA modificado com ácido fólico por meio da química do clique para preparar um agente antitumoral direcionado. A eficiência de captação celular foi medida por meio de imagens fluorescentes. A citotoxicidade, a eficiência de inibição e o mecanismo correspondente na linha celular de câncer de cólon HT-29 foram avaliados por ensaio de MTT, curva de proliferação celular, western blot e citometria de fluxo. Nenhuma citotoxicidade foi induzida pelo DNA tetra, mas a taxa de captação celular aumentou obviamente resultante da penetração tetra-facilitada do DNA através da membrana celular. Consequentemente, o ácido fólico-DNA tetra-Dox aumentou significativamente a eficiência antitumoral com níveis aumentados de apoptose. Em detalhes, 100 μM foi a concentração efetiva e um período de incubação de 6 h foi necessário para a indução da apoptose. Em conclusão, o tetraedro de DNA de tamanho nanométrico foi um sistema de entrega seguro e eficaz para Dox e, correspondentemente, aumentou a eficiência anticâncer.

Histórico

A doxorrubicina (Dox) é um dos agentes antineoplásicos mais amplamente usados, e vários estudos clínicos demonstraram que a Dox pode impedir de forma impressionante o crescimento das células tumorais em vários ciclos de crescimento celular, inibindo a síntese de RNA e DNA [1, 2]. Estudos anteriores sugeriram que a proliferação de células tumorais foi efetivamente bloqueada na fase G1, e a metástase também foi inibida por Dox em uma determinada concentração [3]. Além disso, a inibição efetiva pode ser alcançada em uma dose relativamente menor quando comparada com outras drogas anticâncer [4]. No entanto, Dox geralmente induziu efeitos colaterais resultantes da falta de direcionamento específico para células tumorais e inibição não seletiva de DNA e RNA, o que limitou seriamente as aplicações clínicas [5, 6]. Enquanto isso, a baixa capacidade de ingestão celular reduz o acúmulo de Dox nas células tumorais [7]. Portanto, um sistema de entrega eficiente para Dox deve ser desenvolvido para tornar o Dox um direcionamento mais específico e eficaz, mais facilmente para ser encapsulado e de excelente capacidade de ingestão e biocompatibilidade.

Carreadores de drogas nanométricas, como lipossomas e nanopartículas inorgânicas, podem facilitar a penetração do Dox na membrana da célula tumoral, melhorando a eficiência do direcionamento [8]. No entanto, a entrega baseada em lipossomas não pode reduzir os efeitos colaterais às células normais devido ao direcionamento relativamente pobre; enquanto isso, os transportadores inorgânicos, como as nanopartículas de sílica mesoporosa, não podem ser completamente biodegradados in vivo, dificultando o processo de absorção adicional do medicamento e trazendo potencial bio-toxicidade. Para estes sistemas de entrega funcional, a complexidade da preparação, a inomogenização das estruturas das nanopartículas e a baixa eficiência de encapsulação obstaculizam as expansões clínicas [9,10,11]. Como um carreador de fármaco de tamanho nanométrico com excelente desempenho na entrega de fármacos, estruturas baseadas em DNA, como DNA tetraedro (DNA tetra), podem penetrar na membrana evitando a incompatibilidade entre o DNA eletro-negativo e a membrana plasmática [12,13, 14,15,16,17]. As drogas e as moléculas de direcionamento podem ser ligadas covalentemente ao tetraedro de DNA. Além disso, a fácil absorção e biodegradação das sequências tetraédricas de DNA evitam a retenção por muito tempo. Drogas aptâmeras ricas em guanina, como AS1411, foram entregues com sucesso em células tumorais A549 e realizadas como agentes de direcionamento e inibidores [18]. Fatores regulatórios imunológicos, como CpG e siRNA, também podem ser entregues às células tumorais via DNA tetra transportador para regular as respostas imunes [19]. Com as vantagens de baixa toxicidade, biocompatibilidade adequada e direcionamento ajustável, o DNA tetra mostrou biossegurança e potencial para entrega Dox.

Neste estudo, partículas funcionais de tetraedro de DNA montadas com Dox como fármaco anticâncer, e ácido fólico como moléculas de reconhecimento específicas [20], foram projetadas, sintetizadas e caracterizadas. A eficiência anticâncer foi avaliada em células de câncer de cólon considerando receptores de folato regulados significativamente na superfície da membrana celular. Especificamente, o nível de captação celular, o grau de apoptose induzida por Dox e a inibição da proliferação celular foram medidos em linhas de células HT-29.

Métodos

Regentes e equipamento

As cadeias de oligonucleotídeos de DNA foram adquiridas na TAKARA em Dalian, China. Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e soro fetal bovino foram adquiridos da Gibco em NY, EUA. A penicilina e a estreptomicina foram adquiridas na Beyotime biotechnology em Xangai, China. Ácido fólico, doxorrubicina, 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2- H brometo de tetrazólio (MTT) e agarose foram adquiridos da Sigma-Aldrich em MO, EUA. Todos os anticorpos foram adquiridos da Abcam Company em Xangai, China. Outros reagentes foram adquiridos da Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd., em Xangai, China.

O espectrofotômetro UV-Vis (Thermo Evolution 201) e a incubadora de temperatura constante foram adquiridos da Thermo Fisher nos EUA; máquina centrífuga (GT10-1) foi adquirida de Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd .; O espectrofotômetro de fluorescência (UV-1800) foi adquirido na Shimadzu Corporation. A microscopia confocal de varredura a laser (Visitech) foi adquirida das empresas Leica; O instrumento de reação em cadeia da polimerase (PCR, T100), a eletroforese de proteínas e o aparelho de eletroforese de ácido nucleico foram adquiridos na Bio-Rad Company; o analisador de tamanho de partícula de luz dinâmico foi adquirido da Beckman Company; placas de cultura de células com 96 ou 24 poços foram adquiridas da Dow Corning Corporation. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC, Agilent 1200) com coluna C18 foi adquirida da Agilent Technologies.

A linhagem de células de câncer de cólon humano HT-29 foi mantida em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina em uma atmosfera umidificada contendo 95% de ar e 5% de dióxido de carbono a 37 ° C .

Síntese e purificação do tetraedro de DNA

Nesta investigação, a síntese seguiu os procedimentos esquemáticos na Fig. 1, e as sequências de DNA de fita simples (ssDNA) do tetraedro de DNA são fornecidas na Fig. 1 também. Em detalhes, cada ssDNA foi dissolvido em 0,5 × tampão TE, e o valor de densidade óptica (DO) correspondente do DNA foi determinado por espectrofotômetro de UV a 260 nm. Tampão TE adicional foi suplementado para fazer quatro cadeias na mesma concentração. A proporção de mistura de quatro ssDNAs foi de 1:1:1:1 a 1 μM em 100 μL. A reação foi realizada em uma máquina de reação em cadeia da polimerase (PCR) com as condições de ciclagem:95 ° C, 10 min, resfriado naturalmente a 4 ° C. Todo o DNA de fita simples foi purificado por HPLC com 260 nm como pico de absorção característico. No espectro de HPLC, o tempo de pico do DNA tetra foi mais rápido do que o da fita simples e o produto foi coletado no ponto de tempo correspondente.

Diagrama esquemático de ácido fólico-DNA tetra-Dox, DNA tetra-Dox e ácido fólico-DNA tetra. As sequências de DNA de fita simples de tetraedro de DNA foram fornecidas. O processo de direcionamento para células tumorais, penetrando através da membrana celular e inserindo os DNAs foram descritos

Síntese e caracterização de ácido fólico-DNA tetra-Dox

Grupos de hidrogênio livre de Dox e ácido fólico foram modificados com grupo azida e então acoplados com 3′-OH de ssDNA via reação química de clique [21]. Ao adicionar uma quantidade diferente de ssDNA marcado com grupo funcional, a proporção de grupos funcionais pode ser estequiometricamente controlada por meio de hibridização específica de cadeias laterais. Para a síntese de ácido fólico-DNA tetra, a razão molar de ácido fólico e DNA tetraedro foi estabelecida como 1:1. Para a síntese de DNA tetra-Dox, a razão molar de Dox e DNA tetraedro foi estabelecida como 4:1. Para a síntese de ácido fólico-DNA tetra-Dox, a razão molar de ácido fólico, DNA tetraedro e Dox foi, respectivamente, definida como 1:1:3. Todas as sínteses foram realizadas em nível micromolar a 37 ° C e então armazenadas a 4 ° C [22].

Neste estudo, a série de tetra complexos de DNA foi caracterizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com gel de separação a 8% (39% Acr-Bis) para verificar a pureza e os tamanhos moleculares relativos. As amostras consistiam nas diferentes tetraestruturas de DNA e tampão de carregamento 6 × com proporção de mistura de 2:1. As amostras foram coradas e analisadas após eletroforese em gel por 90 min a 110 V. Para descobrir as diferenças nos tamanhos das partículas, as amostras de DNA tetra também foram escaneadas por instrumentos de espalhamento dinâmico de luz (DLS) com luz dinâmica.

Captação celular tetra-facilitada de DNA

Para as diferentes estruturas de acoplamento projetadas nesta pesquisa, as taxas de absorção pelas células HT-29 foram comparadas para descobrir a eficiência de entrega da droga. A eficiência de absorção celular foi avaliada e quantificada utilizando o espectro de fluorescência característico de Dox, isto é, luz de excitação a 470 nm e luz de emissão a 590 nm. As células HT-29 em 2 × 10 ⁵ / mL foram semeados em placas de 24 poços e cultivados por 24 h. As células foram incubadas com várias tetraestruturas de DNA a 10 μM por mais 24 h. O meio foi então descartado e as células foram enxaguadas com PBS três vezes. Para a fixação das células, paraformaldeído a 4% foi adicionado imediatamente à temperatura ambiente para uma co-incubação de 30 min, e as células foram enxaguadas com PBS três vezes novamente. Por fim, as placas de 24 poços foram observadas em microscópio confocal a laser para comparar a eficiência de captação celular com base na intensidade da luz de emissão.

Citotoxicidade e eficiência anticâncer

A citotoxicidade e a eficiência anticâncer foram avaliadas por meio do ensaio de MTT, onde ocorre uma reação redox entre o MTT em DMSO e a succinato desidrogenase intracelular. As células HT-29 foram semeadas em placas de cultura de 96 poços e cultivadas por 24 h.

Para a citotoxicidade do DNA tetra como carreador do fármaco, foi adicionado meio contendo tetraestruturas de DNA na concentração de 0-100 μM para outra incubação de 24 ou 48 h. Em seguida, 100 μL de solução de MTT (5 mg / mL) foram adicionados a cada poço e a mistura foi incubada a 37 ° C por 4 h. O líquido foi então removido e as células foram lisadas e dissolvidas com 200 μL de DMSO. A absorbância do sobrenadante foi medida a 570 nm por Microrreader. A amostra HT-29 não tratada foi considerada grupo controle.

Para o tetraedro de DNA acoplado ao ácido fólico ou Dox, de um lado, as pesquisas se concentraram na estabilidade, biossegurança e eficiência de inibição; por outro lado, se o Dox do DNA tetra-Dox tem propriedades antitumorais comparáveis como antes ou não também foi explorado. Portanto, a citotoxicidade e a eficiência antitumoral de tetra complexos de DNA foram avaliadas. Os complexos respectivamente a 100 μM foram incubados com células HT-29. Amostras de células foram coletadas a cada 6 horas e então detectadas pelo ensaio MTT para avaliar o efeito do período de incubação. Atenção especial foi dada à diferença na eficiência anticâncer resultante das variações das estruturas. Além disso, os efeitos da concentração na inibição de HT-29 após o tratamento com ácido fólico-DNA tetra-Dox foram avaliados em 0–200 μM por meio de ensaios de MTT.

Western Blot e citometria de fluxo

Para caracterizar a apoptose celular induzida por Dox facilitada pela entrega de DNA tetra, amostras de proteínas de células tratadas foram aquecidas e quebradas usando líquido de pirólise, analisadas por 12% SDS-PAGE sob a condição de 100 V em corrente constante para amostras separadas e, em seguida, transferidas a membranas de PVDF de 0,22 μm de diâmetro por 1 h. As amostras foram bloqueadas com leite desnatado por 1 hora. Depois de serem lavadas três vezes com PBST, as amostras foram incubadas durante a noite com anti-caspase-3 de coelho. Em seguida, as amostras foram sondadas com um anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho por 1 h e, em seguida, lavadas com PBST e fotografadas por meio do sistema de imagem de proteína Bio-Rad. Além disso, GAPDH foi escolhida como proteína de referência interna desde sua expressão estável nas células.

A citometria de fluxo foi ainda utilizada para quantificar os níveis de apoptose na concentração selecionada e no ponto de tempo por meio de ensaios de MTT. As células HT-29 foram incubadas com inibidores por um período de tempo e, em seguida, medidas por citometria de fluxo quantitativa usando o método de dupla coloração com Anexina V-PI.

Quantificação da proliferação celular

O método de contagem de células foi usado para quantificar a proliferação celular com o tempo. Em detalhes, após serem tratadas com ácido fólico-DNA tetra-Dox por um período de tempo a 100 μM, as células foram digeridas por tripsina a 0,25% por 30 s e, em seguida, o volume igual de meio completo foi adicionado para encerrar a reação. O sobrenadante foi descartado após centrifugação em 1000 rpm por 3 min, e as células foram ressuspensas com meio completo. O número de células em cada ponto de detecção foi registrado em microscópio óptico por meio de placas de contagem de células, a fim de traçar a curva de proliferação celular.

Análise Estatística

Nesta pesquisa, as significâncias das diferenças foram determinadas usando o t de Student teste (bicaudal; variância igual de duas amostras). P <0,05 significa diferenças significativas entre grupos diferentes.

Resultados

Preparação de ácido fólico-DNA tetra-Dox

No processo de síntese específico, Dox foi misturado com tetraedro de DNA em diferentes proporções para completar o carregamento e montagem de Dox ( w _m =543,52) e ácido fólico ( w _m =441,4). Como mostrado na Fig. 2a, devido a que Dox e ácido fólico são monômeros com peso molecular relativamente baixo e semelhante, o DNA em um tetraedro e os conjugados com uma molécula funcional tinham pesos moleculares aproximadamente equivalentes. No entanto, Dox ou ácido fólico se reunindo com todos os quatro vértices do DNA do tetraedro fez com que o tamanho molecular do tetra aumentasse obviamente. Conforme mostrado na Fig. 2b, a maior parte do tamanho do monômero tetraédrico de DNA era inferior a 15 nm. Com o aumento dos grupos de acoplamento, a estrutura simétrica do DNA tetra foi destruída e o tamanho médio das partículas dos compostos aumentou significativamente. Em particular, a expansão de tamanho do tetra-Dox de ácido fólico-DNA estendeu o diâmetro do meio para 20 nm.

Caracterização de DNA tetra com diferentes constituintes. a Da esquerda para a direita:escada de DNA, DNA tetra, ácido fólico-DNA tetra, ácido fólico-DNA tetra-Dox e DNA tetra-Dox com imagem em 8% SDS-PAGE. b A distribuição de tamanho do DNA tetra, ácido fólico-DNA tetra, ácido fólico-DNA tetra-Dox e DNA tetra-Dox detectado por meio de dispersão de luz dinâmica

Eficiência na administração de medicamentos

Após ser incubado com diferentes tetraestruturas de DNA por 24 h, a eficiência intracelular de Dox foi avaliada com imagens de fluorescência, onde a fluorescência vermelha intracelular é a fluorescência característica de Dox; portanto, as células incubadas com DNA tetra não exibiram nenhum sinal fluorescente, como mostrado na Fig. 3a, e os sinais vermelhos de células incubadas com ácido fólico-DNA tetra-Dox e complexos de DNA tetra-Dox foram obviamente maiores do que com Dox, o que significa a eficiência de captação celular significativamente aumentada de Dox resultante do DNA tetra facilitou a penetração através da membrana, bem como a estabilidade intracelular dos conjugados entre Dox e DNA tetra.

Eficiência de captação de células HT-29 após incubação com diferentes complexos por 24 h. a Detecção de microscopia confocal (o vermelho é a luz de excitação de fluorescência de Dox, barra de escala =10 μm). b Intensidade de fluorescência celular. ** P <0,05 quando comparado com o grupo de DNA tetra

A análise quantitativa adicional da intensidade de fluorescência (Fig. 3b) evidenciou os achados visuais, e não houve diferença significativa entre os complexos de ácido fólico-DNA tetra-Dox e DNA tetra-Dox ( P <0,05). A metodologia de co-incubação de drogas e células impede a exibição completa da capacidade de direcionamento do ácido fólico. A relativa alta concentração confirmou o reconhecimento específico dos receptores de folato, que é teoricamente mais óbvio nas aplicações in vivo com o complexo sistema circulante. Em resumo, o DNA tetra delivery garantiu a eficiência anticâncer do Dox.

Citotoxicidade e eficiência anticâncer

Primeiro, a viabilidade de células HT-29 co-incubadas com diferentes concentrações de DNA tetra foram examinadas usando o ensaio MTT. Não houve citotoxicidade óbvia de tetra-tratamento de DNA em células HT-29 em 0–100 μM por 24 e 48 h (Fig. 4a). Conseqüentemente, o tetraedro de DNA de tamanho nanométrico forneceu uma plataforma de transporte de droga bio-segura.

A citotoxicidade e a eficiência antitumoral de complexos Dox e DNA tetra para células HT-29. a A viabilidade de células HT-29 incubadas com DNA tetra em diferentes concentrações por 24 ou 48 h. b A eficiência antitumoral de complexos Dox a 100 μM. c A viabilidade de células HT-29 incubadas com ácido fólico-DNA tetra-Dox em diferentes concentrações por 24 ou 48 h

Em segundo lugar, resultante da diferença na eficiência de entrega de Dox, o ácido fólico-DNA tetra-Dox e o DNA tetra-Dox exibiram uma eficiência de inibição mais significativa em 48 h (Fig. 4b). Devido à falta de componentes anticâncer eficazes, o ácido tetra-fólico do DNA levou a uma diminuição desprezível (<10%) da viabilidade durante a co-incubação de 48 horas. Devido a que Dox não consegue penetrar objetivamente na membrana, a diminuição da viabilidade celular induzida por Dox foi menor do que os outros grupos. Particularmente, o tetra-Dox de ácido fólico-DNA mostrou uma diminuição mais precoce e significativa 6 h após a incubação, provando que o direcionamento de ácido fólico ajuda as drogas a se localizar na membrana e fazer com que o Dox tenha efeito mais oportuno. Em contraste, o DNA tetra-Dox começou a fazer efeito obviamente 12 h após a incubação, demonstrando a importância dos grupos de direcionamento.

Além disso, as células HT-29 foram tratadas com ácido fólico-DNA tetra-Dox a 0–200 μM para detectar a concentração efetiva (Fig. 4c). A viabilidade celular das células HT-29 diminuiu rapidamente com o aumento da concentração (0-100 μM) do complexo, mas não houve diferenças significativas entre a concentração de 100 e 200 μM, indicando uma forma dependente da dose de ácido fólico-DNA tetra- Dox, onde 100 μM pode ser considerado como uma concentração eficaz para efeito antitumoral. Além disso, a viabilidade celular mudou significativamente de 24 a 48 h para os grupos de 10, 20 e 50 μM, indicando que o período de incubação também foi um fator que afetou a eficiência anticâncer baseada em ácido fólico-DNA tetra-Dox.

Apoptose induzida por ácido fólico-DNA tetra-Dox

Nesse sentido, com base nos ensaios de western blot (Fig. 5a), houve aumento significativo da expressão da caspase-3 induzida pelo ácido fólico-DNA tetra-Dox e DNA tetra-Dox, comprovando que a apoptose foi a principal forma de Dox- morte celular induzida.

A expressão celular da caspase-3 relacionada à apoptose após ser tratada com diferentes complexos ( a ) e a citometria de fluxo de células HT-29 após serem incubadas com DNA tetra, Dox, DNA tetra-Dox e ácido fólico-DNA tetra-Dox ( b - e )

A citometria de fluxo (Fig. 5b-e) provou ainda que a incubação de 6 h com ácido fólico-DNA tetra-Dox a 100 μM induziu 68,7% de apoptose. Enquanto isso, os níveis de apoptose induzida por Dox e DNA tetra-Dox foram de apenas 32,8 e 60,5% com a mesma condição de incubação.

Inibição da proliferação celular

Com base nos ensaios de MTT, 100 μM foi a concentração eficaz para indução de apoptose e foi selecionada no experimento de proliferação celular. Conforme mostrado pela curva de proliferação celular (Fig. 6), devido ao processo demorado de captação celular, a inibição da proliferação celular não foi totalmente demonstrada durante o estágio inicial de co-incubação. Um efeito inibitório significativo foi apresentado após a incubação com ácido fólico-DNA tetra-Dox por mais de 6 h, comprovando a existência de endocitose tetra-intensificada de DNA. Enquanto isso, 6 h é um período de tempo comparativo com o período de tempo efetivo detectado na Fig. 4b.

Inibição da proliferação celular induzida pela incubação com ácido fólico-DNA tetra-Dox a 100 μM por diferentes períodos de tempo

Discussão

Como o meio comum de modificação de DNA, a reação química de clique tinha vantagens de alta eficiência de reação, controle de poço e operação fácil [21]. Eletroforetograma exibido com uma única marca (Fig. 2a), indicando que os produtos com alta pureza foram obtidos por acoplamento covalente via reação química de clique. A propriedade fluorescente do Dox o torna rastreável in vitro e in vivo; entretanto, a fluorescência no interior das células tumorais comprovou indiretamente a estabilidade do ácido fólico-DNA tetra-Dox durante o processo de penetração pela membrana celular. Portanto, o ácido fólico-DNA tetra-Dox foi capaz e estável para aplicações biomédicas.

O DNA tetra tem a capacidade de entregar drogas nas células. Todas as sequências de DNA usadas nesta pesquisa não foram codificadas para nenhuma informação genética. Assim, nenhum efeito colateral na expressão gênica e metabolismo celular foi relatado em todos os exames. Enquanto isso, devido à alta expressão do receptor de folato na superfície das células tumorais, o ácido fólico é selecionado como moléculas de direcionamento específico do sistema de distribuição de drogas para aumentar a eficiência de captação de tetra complexos de DNA. No entanto, com as circunstâncias do DNA tetra em concentração relativamente alta, a vantagem do direcionamento do receptor de folato não foi totalmente refletida in vitro. Consequentemente, para aplicação in vivo, o ácido fólico foi potencial para aumentar a eficiência de direcionamento no sistema circulante complexo.

Atualmente, as drogas anticâncer comumente trazem efeitos colaterais inesperados, então a pesquisa sobre o aumento da capacidade de direcionamento das células tumorais e eficiência de entrega tem sido um tema quente [23,24,25]. Estudos anteriores mostraram que a capacidade do tetraedro de DNA de transportar drogas se baseava em sua boa compatibilidade. O tetraedro de DNA é um recipiente artificial de modificação favorável e biocompatibilidade adequada. Neste estudo, o acoplamento bem-sucedido de Dox e ácido fólico com tetraedro de DNA alcançou um efeito inibitório satisfatório e levou à apoptose óbvia das células HT-29. Como o DNA tetra pode ser modificado e acoplado a fármacos e moléculas de direcionamento, foi realizado o enriquecimento da concentração local do fármaco na célula tumoral. Os resultados acima provaram o bom reconhecimento para células tumorais e o efeito inibitório intensificado correspondente via tetra-entrega de DNA, e este sistema de entrega de fármaco de tamanho nanométrico pode ser usado mais extensivamente.

Conclusões

Como uma estratégia de entrega de drogas desenvolvida recentemente, as estruturas de DNA de tamanho nanométrico são de baixo custo, alta estabilidade e viabilidade de síntese; entretanto, é bio-seguro devido à falta de atividade imunológica exógena. A estratégia de acoplamento de DNA tetraedro facilita a entrega direcionada de Dox, aumenta a eficiência anticâncer de Dox em células de câncer de cólon e fornece uma inspiração e uma ideia promissoras para o design de drogas.

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