Biossensores plasmônicos aprimorados de imunoensaio de nanopartícula-óxido de grafeno híbrido à base de óxido de grafeno

Resumo

Neste estudo, propomos um nanocompósito de folha de óxido de grafeno-nanopartícula de ouro modificado (AuNP-GO) para detectar duas interações diferentes entre proteínas e nanocompósitos híbridos para uso em aplicações biomédicas. As folhas GO possuem alta bioafinidade, o que facilita a fixação de biomoléculas a grupos carboxila e tem levado ao seu uso no desenvolvimento de mecanismos de detecção. Quando as folhas GO são decoradas com AuNPs, elas introduzem ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR) na transferência de energia de ressonância de mudanças espectrais. Nossos resultados sugerem um futuro promissor para imunoensaios livres de rótulos baseados em AuNP-GO para detectar biomarcadores de doenças e diagnosticar rapidamente doenças infecciosas. Os resultados mostraram a detecção de antiBSA em 10 ng / ml de proteína interferente não específica de hCG com respostas dinâmicas variando de 1,45 nM a 145 fM e um LOD de 145 fM. Considerando a ampla gama de aplicações potenciais de folhas GO como um material hospedeiro para uma variedade de nanopartículas, a abordagem desenvolvida aqui pode ser benéfica para a integração futura de nanopartículas com nanofolhas GO para detecção de sangue. As excelentes características anti-interferência permitem o uso do biossensor em análises clínicas e diagnósticos de teste de ponto de atendimento (POCT) de produtos de imunoensaio rápido, e também pode ser uma ferramenta potencial para a medição de biomarcadores em soro humano.

Histórico

Materiais baseados em moléculas de carbono, como nanotubos de carbono [1, 2], bolas de carbono (buckminsterfullereno, C60) [3], grafeno bidimensional [4,5,6] e óxido de grafeno (GO) [7,8,9 , 10,11] têm sido amplamente utilizados em biossensores. Dentre eles, a estrutura de folha bidimensional de grafeno é um material ideal para permitir filmes finos com alta condutividade [12, 13] e excelentes características de permeabilidade óptica [14] e alta biocompatibilidade [15, 16]. Por essas razões, o material à base de grafeno é amplamente utilizado na tecnologia de detecção biomédica e eletroquímica [17, 18]. Além disso, o tipo fotoelétrico de tecnologia de sensoriamento biológico é principalmente baseado em GO [19,20,21]. Como os grupos de óxidos podem ser ajustados para absorver e irradiar um gap de luz [22, 23], é comumente usado em fluorescência [24], ressonância plasmônica de superfície (SPR) [8,9,10,11,19,20,21 ] e tecnologia de detecção de ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) [25, 26]. Em particular, GO tem grupos funcionais químicos únicos (pontes epóxi, grupos hidroxila, grupos carboxila em pares (carboxila e carbonila)) que melhoram a afinidade e a ligação covalente de biomoléculas.

A síntese de material grafeno combinado com nanopartículas (como Pt, Au, Ag, Pd e ZnO) tem sido amplamente estudada para o desenvolvimento de novas tecnologias de nanocompósitos. Em particular, o uso de nanopartículas de ouro (AuNPs) tem sido utilizado como mecanismo de transferência de energia por espectroscopia colorimétrica e de absorção. Além disso, durante a última década, a pesquisa sobre AuNPs em luz visível destacou as características únicas de ressonância plasmônica. Como o ajuste do tamanho e da forma dos AuNPs pode alterar a mudança do comprimento de onda de absorção óptica, os AuNPs podem ser usados ​​para aumentar a absorção de plasma e amplificação do sinal [27, 28]. Portanto, AuNPs têm sido amplamente utilizados em uma ampla gama de aplicações, como componentes optoeletrônicos, devido às suas propriedades ópticas e optoeletrônicas especiais para melhorar a extração de luz [29, 30] e as reações de absorção de luz [31,32,33]. Além disso, AuNPs são biocompatíveis e têm sido estudados para seu uso em detecção química, imagem biomédica, terapia do câncer [34, 35], carreador de drogas [32, 33], terapia fototérmica [36,37,38], agente de contraste [39], radiossensibilizador [40] e aplicações de biossensor [33, 41,42,43].

A funcionalidade dos AuNPs foi modificada pela adição do reticulador para evitar a oxidação e atuar como um transportador de fitoquímicos ou vetores; assim, esta combinação pode aumentar a biocompatibilidade e bioatividade [44,45,46]. Os reticulantes, como cistamina (Cys) ou ácido 8-mercaptooctanóico (MOA), são ativados por monocamadas automontadas de tiol terminadas em ácido carboxílico (SAMs) em uma superfície de Au modificada. O MOA se liga à superfície do Au através do ligante tiol (extremidade -SH), resultando em monocamadas.

Além disso, a pesquisa em material metálico de plasmon também foi amplamente divulgada. Por exemplo, nanopartículas de casca de núcleo de metal plasmônico [47], nanostars [48] e nanopartículas de óxido de estanho dopado com flúor [49] mostraram aumentar a lacuna de banda de energia, o que os torna desejáveis ​​em células solares e aplicações de detecção.

Além disso, o uso de híbridos AuNP-GO baseados em síntese química [50,51,52] e auto-montagem eletrostática [53] foi relatado em aplicações de sensor, energia e catalítica. Nos últimos anos, uma quantidade crescente de pesquisas tem se concentrado no uso de híbridos AuNP-GO em biossensores. Esses híbridos têm se mostrado úteis no desenvolvimento de tecnologia de plataforma eletroquímica [54,55,56,57,58,59] e espalhamento Raman aprimorado por superfície (SERS) [56, 59] para melhorar a aplicação em ensaios biológicos. No entanto, atualmente não há relatórios relevantes sobre o uso de tecnologia de biossensor de imunoensaio rápido colorimétrico ou a olho nu. Por exemplo, biossensores eletroquímicos de DNA baseados em híbridos AuNP-GO têm sido usados ​​para detectar biomarcadores de câncer de mama para permitir um diagnóstico precoce. Com este biossensor, o limite de detecção (LOD) de 0,16 nM foi obtido com uma sensibilidade de 378 nA / nM para o biomarcador ERBB2 [54]. Além disso, um aptasensor eletroquímico baseado em nanocompósito de óxido de grafeno de redução pontilhada AuNP (rGO-AuNP) foi usado para detectar seletivamente uma concentração de 3,3′4,4′-bifenilos policlorados (PCB77) entre 1 pg L ^{- 1} e 10 μg L ^{- 1} , com um LOD de 0,1 pg L ^{- 1} [55]. Além disso, os híbridos AuNP-GO têm sido usados ​​como um biossensor de base eletroquímica para detectar peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ), com respostas dinâmicas alimentares variando de 0,1 a 2,3 mM e um LOD de 0,01 mM [57]. Outro bom exemplo é a utilização de híbridos AuNP-GO [56, 59] e AuNP-grafeno [59] para biossensores baseados em SERS em diversas aplicações, bem como bioimagem medido por SERS.

Neste estudo, propomos um método alternativo de síntese química e auto-montagem eletrostática de híbridos AuNP-GO usando auto-montagem camada a camada. Também analisamos a sensibilidade de detecção biológica das folhas AuNPs e GO combinadas modificadas e sua resposta imune de proteína. Nós projetamos dois tipos de imunoensaios livres de marcadores de proteínas baseados em AuNP-GO e avaliamos seu tempo de resposta e sensibilidade nas interações antígeno-anticorpo. Os excelentes recursos de detecção dos compósitos de grafeno-AuNP incluem ultra-alta sensibilidade e a afinidade das interações de biomoléculas que influenciam a detecção de uma ampla gama de biomoléculas com alta especificidade. Essas características implicam que esses compostos têm um papel promissor em aplicações futuras e o potencial de ser a rota preferida de detecção de doenças em aplicações de diagnóstico clínico.

Métodos / Experimental

Materiais

A grafite foi adquirida na Graphene Supermarket (Graphene Laboratories Inc., Reading, MA, EUA). As folhas GO foram obtidas a partir de flocos de grafite usando um método modificado de Hummer [60] seguido por estilhaçamento ultrassônico por 5 h para um tamanho de floco de 0,1-1 μm e espessura de 1,1 nm. Dicloridrato de cistamina (Cys, 96%), tetracloroaurato de hidrogênio (III) tri-hidratado (HAuCl ₄ · 3H ₂ O), ACS, 99,99% (base de metais) e Au 49,5% min foram adquiridos da Alfa Aesar Co. (EUA). Citrato de sódio (HOC (COONa) (CH ₂ COONa) ₂ · 2H ₂ O) foi adquirido de J.T. Baker Chemical Co. (EUA). Albumina de soro bovino (BSA, SI-B4287, Sigma-Aldrich, EUA), anticorpo anti-albumina bovina produzido em coelho (antiBSA, SI-B1520, Sigma-Aldrich, EUA), N -hidroxissuccinimida (NHS) e 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) foram adquiridos a Sigma-Aldrich Inc. (EUA). As imunoglobulinas (Ig) da estrutura do anticorpo antiBSA foram produzidas pelos linfócitos B e segregadas no plasma. As formas monoméricas das moléculas de Ig eram glicoproteínas com peso molecular de cerca de 150 kDa. Cada monômero de Ig era capaz de se ligar a duas moléculas de antígeno. Todos os reagentes e solventes foram usados ​​sem purificação adicional.

Usamos três diferentes condições de temperatura a 550, 400 e 100 ° C com tempos de ebulição de 5, 5 e 120 minutos, respectivamente, para controlar a redução das nanopartículas. Essas diferentes temperaturas reduziram as nanopartículas para obter o mesmo espectro de absorção em 520 nm, conforme visto claramente no arquivo adicional 1:Figura S1.

Síntese de AuNPs

O método utilizado para a obtenção de AuNPs baseou-se na utilização de citrato de sódio como agente redutor para redução de íons tetracloroaurato taurina em água. Um volume de 15 mL de HAuCl ₄ · 3H ₂ A solução de O contendo 1 mM de Au foi submetida a refluxo e 1,8 mL de citrato de sódio 38,8 mM (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ ) solução foi adicionada à solução em ebulição (550 ° C, 1100 rpm). A redução dos íons ouro pelos íons citrato foi concluída após 5 min, e a solução foi fervida por mais 30 min (400 ° C, 900 rpm) e depois deixada para resfriar até a temperatura ambiente [36, 61, 62]. Este método produz AuNPs esféricos com um diâmetro médio de cerca de 15 nm, e uma concentração reduzida de 0,8 mL de citrato de sódio 38,8 mM pode ser usado para produzir AuNPs com um diâmetro médio de cerca de 60 nm [63, 64]. A reação química é a seguinte:HAuCl _{4 (aq)} + C ₆ H ₅ O ₇ Na _{3 (aq)} → Au _(s) + CO ₂ + HCOOH.

Preparação de GO com base em um antígeno alvo

Projetamos um método de imunoensaio para preparar folhas GO, conforme mostrado na Fig. 1. Usamos uma solução de folha GO de 200 μL a uma concentração de 0,1 g / le a ativação de grupos terminais carboxila na superfície das folhas GO para ligação covalente a formação para imobilizar cadeias de hidrocarbonetos foi realizada usando uma mistura de 400 μM (EDC) / 100 μM (NHS) em uma proporção de volume de 1:1. A proteína BSA foi imobilizada nas extremidades das folhas GO usando EDC / NHS para ativar e promover reações de ligação covalente entre grupos carboxila em GO e –HN ₂ de BSA. A superfície -COOH ativada foi então submetida a forte imobilização covalente por meio de uma amina (NH ₂ ) reação de acoplamento com 20 μl de proteína BSA a uma concentração de 100 μg / ml. Finalmente, usamos uma centrífuga para remover repetidamente a proteína BSA não imobilizada na superfície GO. O procedimento alvo do antígeno GO-BSA é mostrado na Fig. 1.

Interação GO-BSA. O grupo carboxila das folhas GO pode ser ativado usando a reação EDC / NHS e a preparação do GO com base no antígeno alvo para GO-BSA

Preparação de AuNPs e AuNP-GO com base em uma sonda de anticorpo

Executamos a funcionalização de superfície usando Cys com AuNPs de 15 nm em um volume de 200 μL. Os AuNPs foram modificados quimicamente usando uma monocamada auto-montada de tiol derivatizada de Cys. Os AuNPs foram imersos em uma solução de Cys (10 mM) por 2 h em temperatura ambiente. Por causa da forte ligação AuNP – S (ligação tiol), Cys pode se conectar facilmente a AuNPs e –NH ₂ grupos expostos na superfície de AuNPs – Cys – NH ₂ . Em seguida, adicionamos 20 μl de anticorpos (antiBSA) de 100 μg / ml de proteína para imobilizar a superfície dos AuNPs, seguido por centrifugação repetida para remover Cys não imobilizados na superfície dos AuNPs. Água desionizada foi então usada para remover quaisquer AuNPs não imobilizados (Cys é uma estrutura de aminotiol que não precisa ser ativada por EDC / NHS). O Cys anexado aos AuNPs tinha amina (–NH ₂ ) grupos acoplados covalentemente com grupos carboxil (–COOH) na superfície de antiBSA. Finalmente, usamos centrifugação repetida para remover a proteína antiBSA não imobilizada da superfície dos AuNPs. Uma série de concentrações de proteína antiBSA foi preparada por diluição em série de 100 μg / ml a 1 pg / ml. A preparação da sonda AuNP-antiBSA em diferentes concentrações de anticorpos é mostrada na Fig. 2a.

Interações AuNP-antiBSA e AuNP-GO-antiBSA. Preparação do a AuNPs e b AuNP-GO com base em sonda de anticorpo

Usamos AuNPs preparados usando o método de folha GO para modificar o nanocompósito AuNP-GO. Os AuNPs foram preparados usando o método de redução de citrato de sódio, e o tamanho dos AuNPs de 60 nm foi modificado usando Cys (5 mM). Em seguida, usamos EDC / NHS para ativar os grupos –COOH na superfície das folhas GO. Os Cys anexados aos AuNPs incluíam –NH ₂ grupos covalentemente acoplados com grupos –COOH na superfície das folhas GO. Os AuNPs na superfície das folhas GO foram imobilizados usando um ligante Cys para promover reações de ligação covalente entre os AuNPs e GO. O acoplamento covalente oferece um método fácil e estável para a funcionalização da superfície de colagem em folhas GO. As folhas GO foram completamente enxaguadas com água desionizada para remover o GO não ligado na superfície do AuNP-linker. O AuNP-Cys formou um novo composto de AuNP-GO, seguido pela imobilização com diferentes concentrações de diluição de 100 μg / ml a 1 pg / ml de proteína sonda de anticorpo (antiBSA) para formar AuNP-GO-antiBSA, como mostrado na Fig. 2b.

Caracterização de AuNPs e planilhas GO

A dispersão e morfologia das folhas AuNP-GO foram caracterizadas usando um microscópio eletrônico de transmissão de canhão de emissão de campo de 300 kV (FEG-TEM; Tecnai G2F30S-Twin, Philips-FEI, Amsterdam, Holanda) e um microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução ( HR-TEM) em um sistema FEI Tecnai G20 (Hillsboro, OR, EUA). A dispersão e a morfologia das folhas AuNP-GO e GO foram caracterizadas usando um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo analítico de resolução extrema JEOL JSM-7800F Prime (JEOL Inc., EUA). O espectro de transmitância ultravioleta-visível (UV-vis) de um espectrofotômetro de feixe duplo foi observado usando um espectrofotômetro UV-vis (U-2900, Hitachi High-Technologies Corporation, Tóquio, Japão) com um comprimento de onda de 200 a 1100 nm em temperatura ambiente . As medições Raman foram realizadas usando um sistema Raman microscópico (MRI, Protrustech Co., Ltd., Taiwan). Um espectrômetro resfriado a ar (AvaSpec-ULS2048L) com grade de 1800 linhas / mm e fenda de 50 μm foi usado como detector. As medições do espectrômetro infravermelho de transformada de Fourier (FTIR) foram feitas usando um espectrômetro Bruker Vertex 80v no modo de reflexão total atenuada (ATR) e um detector DTGS (64 varreduras) com uma resolução de 2 cm ^{- 1} em uma pelota de KBr no vácuo a uma pressão de cerca de 6 Pa. O Centro de Instrumentação da Universidade Nacional de Tsing Hua forneceu suporte para este trabalho. A espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) foi realizada usando as instalações do National Synchrotron Radiation Research Center, Hsinchu, Taiwan. Os experimentos de espectroscopia de fotoelétrons foram realizados usando uma linha de luz de espectroscopia U5 09A2 para XPS. Fótons com energias fixas de 380 e 900 eV foram usados ​​para C (1s) e Co (2p) ao longo dos experimentos de espectroscopia de fotoelétrons de nível de núcleo. Os experimentos foram realizados no modo de rendimento total de elétrons em um monocromador de grade esférica de alta energia de 6 m. Os fótons incidiram na superfície normal e os fotoelétrons foram coletados em um ângulo de 58 ° da superfície normal. As energias de ligação em todos os espectros referidos ao Au 4f ^7/2 nível do núcleo em 84,0 eV. Depois de subtrair o fundo linear, os espectros foram ajustados com funções gaussianas-lorentzianas mistas baseadas em um algoritmo de mínimos quadrados não linear [65].

Resultados e discussão

Análise de estrutura e morfologia

O tamanho dos AuNPs depende da natureza do agente redutor e das condições de formação e armazenamento. A análise SEM indicou que as folhas GO e AuNPs foram uniformemente fixadas na superfície GO, com um tamanho médio de AuNP de 60 nm (Fig. 3). A Figura 3a mostra imagens SEM das folhas GO no filme Au e que as folhas GO eram menores que 1 μm. Comparando GO e AuNP-GO, um elemento ouro pode ser observado no composto AuNP-GO. Isso indicou que os AuNPs foram adsorvidos com sucesso na superfície enrugada do GO. Os híbridos AuNP-GO sintetizados foram caracterizados usando TEM como mostrado na Fig. 3b. A Figura 3b, c mostra as condições de síntese. A concentração de 10 ml de solução em folha de GO era de 0,1 g / le 200 μl de solução de AuNP tinha uma concentração de 2,2 nM. As imagens TEM na Fig. 3a com uma barra de escala de 100 nm e Fig. 3b com uma barra de escala de 0,5 μm mostram diferentes amplificações do tamanho e mostram claramente que os AuNPs foram imobilizados na superfície das folhas GO. Os AuNPs tinham uma forma esférica, sugerindo que a funcionalidade carboxílica na superfície das folhas GO pode desempenhar um papel importante na formação de ligações covalentes químicas com os AuNPs, como mostrado na Fig. 2b.

Análise da morfologia da superfície do nanocompósito. a Imagens SEM de uma folha GO e b Imagem TEM do composto AuNP-GO. c A imagem TEM do filme ERGO AuNP-GO

Caracterizações de GO por espectroscopia XPS, Raman e FTIR

A Figura 4a mostra a análise espectral C 1s XPS de alta resolução das folhas GO. Os C1s de maior intensidade em uma energia de ligação de 284,6 eV corresponderam a grupos funcionais carbonil para C – C (sp2), e os picos em 285,6, 286,6, 288,2 e 289,4 eV corresponderam a C – C (sp3) em anéis aromáticos , C – O em grupos hidroxila e epóxi, C =O em grupos carbonila e O – C =O em grupos carboxila, respectivamente. Os espectros C 1s XPS das folhas GO em um substrato de filme de ouro mostraram que as porcentagens atômicas relativas de C – C (sp2), C – C (sp3), C – O, C =O e O – C =O foram 77,44, 2,16, 18,14, 1,77 e 0,49%, respectivamente [66]. A Figura 4b mostra a análise espectral Raman das folhas GO em solução de NaCl com picos de características espectrais a 1614 cm ^{- 1} (Banda G), 1355 cm ^{- 1} (Banda D), 2714 cm ^{- 1} (Banda 2D), 2947 cm ^{- 1} (Banda G + D) e ~ 3240 cm ^{- 1} (Banda 2D ’) [38, 67]. A formação das folhas GO foi ainda analisada para elucidar as propriedades de várias espécies oxigenadas usando espectros ATR-FTIR como mostrado na Fig. 4c. Este espectro de ATR-FTIR também revelou vários picos característicos de GO; C – O a 850 cm ^{- 1} devido a (C – O – C) vibrações de epóxido, C – O em 1080 cm ^{- 1} devido à vibração de alongamento de (C – O) alcoxi, C =C em 1500 ~ 1600 cm ^{- 1} devido às ligações aromáticas C =C e C – O a 1260 cm ^{- 1} devido a (C – O – C) vibrações assimétricas de epóxido. Os grupos carboxílicos nas bordas das folhas GO mostraram vibrações de alongamento –COOH, com picos em 1652 e 1731 cm ^{- 1} correspondendo a vibrações de alongamento C =O dos grupos carbonila. O espectro também mostrou três picos em 2900 cm ^{- 1} relacionado a vibrações de alongamento assimétrico e simétrico de –CH ₂ e um pico de deformação em 1462 cm ^{- 1} devido a grupos alquenos (C – H) localizados no plano de GO. Os espectros de FTIR de GO mostraram uma grande variedade de picos de banda larga de absorção de C – OH e H ₂ Vibrações O em 3370 cm ^{- 1} devido às vibrações de alongamento [67].

Análise espectral de folhas GO. a Digitalização de alta resolução XPS na região C1s, b Raman e c FTIR

Análise de GO e AuNP com propriedades de interação de proteína

Os espectros de UV-vis de GO e AuNPs aquosos com dispersões de interação de proteínas são apresentados na Fig. 5. Os AuNPs tiveram altos coeficientes de extinção e um tamanho único dependendo das bandas de absorção de plasmon de superfície (SP). Os AuNPs modificados de duas dimensões diferentes foram 15 e 60 nm para 520 e 540 nm de espectros de absorção de SP [68, 69]. A Figura 5a mostra a solução AuNP (520 nm) modificada com Cys a uma concentração de 5 mM com a banda de extinção AuNP-Cys [69]. Os espectros de UV-vis de dispersões GO aquosas produziram dois picos de absorção:o máximo em 230 nm correspondendo ao pico π – π * plasmon de ligações C – C aromáticas em aglomerados sp2 aromáticos de tamanhos diferentes e o ombro em 300 nm correspondendo ao n – π * pico do plasmon devido à presença de ligações epóxido e carbonila (C =O) (Fig. 5b) [9, 20]. Os espectros de UV-vis de GO – EDC / NHS e solução GO – EDC / NHS – BSA (Fig. 5b) demonstraram que GO – EDC / NHS e GO – EDC / NHS – BSA mostraram um pico em cerca de 270 nm, que foi provavelmente devido a fortes interações entre GO e grupos amina [70, 71]. A Figura 5c mostra os espectros de absorção das ligações para diferentes concentrações de antiBSA com AuNPs (60 nm). A Figura 1b mostra a solução de síntese da sonda AuNP-antiBSA (amostra B1). Os comprimentos de onda tiveram picos de absorção óbvios em 540 e 755 nm, com o comprimento de onda em 540 nm sendo causado principalmente pelos AuNPs (60 nm), e o pico em 755 nm correspondendo a um pico de absorção de combinação AuNP + Cys + antiBSA. Este resultado mostrou que um aumento na concentração de antiBSA induziu um aumento gradual na absorbância em 540 nm e um aumento contínuo na absorção perto do IR em 755 nm. As diferentes interações de ligação do antiBSA na superfície dos AuNPs causaram mudanças no índice de refração da superfície, que por sua vez foi transduzido em intensidade de absorbância do LSPR. A banda LSPR foi afetada pelo tamanho da partícula. Os AuNPs mostraram fortes bandas SPR na região visível. Com aumentos no índice de refração das partículas de tamanho médio, a mudança nas posições dos picos de SPR pode ser ajustada do visível para o infravermelho próximo. Nos resultados experimentais de interação de proteínas, misturamos AuNP-antiBSA como mostrado na Fig. 5d. A sensibilidade foi determinada traçando o comprimento de onda LSPR da banda de 500-760 nm como uma função do índice de refração medido. Em seguida, usamos diferentes concentrações de diluição de proteína antiBSA de 1,45 nM a 145 fM e as misturamos em um volume de 200 μl. As mudanças na absorção de 540 e 760 nm foram causadas pelas diferentes concentrações de antiBSA e AuNP. As medições espectrais foram feitas 5 minutos depois, que mostraram diferentes concentrações de absorção de intensidade de luz, e um pico de absorção de 60 nm para os AuNPs foi observado em 540 e 755 nm. Estes resultados foram consistentes com as curvas de calibração de absorção AuNP-antiBSA. As curvas de calibração foram ajustadas por y =2,43 + 0,25 × (coeficiente de correlação, R ² =0,91) para o pico de absorção de 540 nm, e y =2,56 + 0,31 × (coeficiente de correlação, R ² =0,96) para o pico de absorção de 760 nm, onde x é a concentração de antiBSA e y é a absorbância óptica.

Análise de espectros de absorção de UV-vis para AuNP com resposta de interação antiBSA. a Espectros de absorção de SP de AuNPs, b BSA com destino a GO, c Sonda AuNP-anti-BSA e d Curvas de calibração para AuNP com resposta de interação antiBSA em diferentes concentrações de diluição de proteína antiBSA de 1,45 nM ~ 145 fM

Análise de AuNP-antiBSA e AuNP-GO-antiBSA com base em interações de imunoensaio

A fim de compreender o mecanismo de detecção imunológica dos nanocompósitos GO e AuNP-GO, a análise espectral para as reações de ligação foi realizada como mostrado na Fig. 6. A Figura 6a mostra os espectros de absorção UV-vis dos nanocompósitos AuNP-GO e GO-BSA. Para a solução de folha GO (0,1 g / l), houve um pico em cerca de 230 nm [70] e um ombro em cerca de 300 nm, e os conjugados GO-BSA mostraram um pico de absorção em cerca de 270 nm e um pico em cerca de 230 nm [9, 20, 70] . Na combinação de nanocompósitos AuNP-GO, três picos de absorção foram observados em 230, 300 e 540 nm, respectivamente. O empilhamento π – π ou as interações de ligação covalente entre AuNPs e a superfície da folha GO foram a principal força motriz que ancorou os AuNPs nos materiais GO altamente biocompatíveis. As folhas GO foram feitas para se reunir nos AuNPs, resultando em uma forte banda de absorção de 200–300 nm. Portanto, a absorção das folhas GO foi muito maior do que a absorção de AuNPs na faixa de luz visível. A Figura 6b mostra que os espectros de UV-vis do pico de absorção de AuNP estavam em 540 nm [50, 68, 69]. Os picos de absorção foram de 540 e 660 nm para os conjugados AuNP + Cys; 230, 300, 540 e 660 nm para conjugados AuNP + Cys + GO; e 230, 270, 540 e 660 nm para conjugados de AuNP + Cys + GO + antiBSA. As folhas GO tiveram dois picos de absorção em 230 nm (π – π * pico do plasmon) e 300 nm (n – π * pico do plasmon). Uma mudança no comprimento de onda de absorção foi observada e esta mudança de absorvância foi considerada para indicar a confirmação da absorção de antiBSA (0 fM ~ 1,45 nM) na superfície AuNP + Cys + GO. A Figura 6c mostra a síntese da solução da sonda AuNP + Cys + GO + antiBSA (amostra B2) como na Fig. 2b. O aumento na concentração de antiBSA foi relativamente alto em 540 nm. A Figura 6c mostra diferentes concentrações de absorção de intensidade de luz, e um pico de absorção de 60 nm para AuNPs foi observado em 540 nm. O aumento na concentração de antiBSA foi relativamente alto em 540 nm. Este resultado mostrou que AuNP-GO pode aumentar as características de absorção de plasmon em 540 nm quando a concentração de antiBSA foi aumentada. Além disso, no experimento de imunoensaio, misturamos o alvo GO-BSA (1,52 μM) (amostra A) e a sonda AuNP + Cys + GO + antiBSA como mostrado na Fig. 6d. Além das características hidrofóbicas e de interação π – π das folhas GO, as ligações covalentes entre proteínas e grupos carboxila nas folhas GO também suportaram a adesão superficial. Este resultado foi provavelmente devido à estrutura híbrida AuNP + GO-antiBSA para formar uma resposta imune estável com outras proteínas em GO-BSA. Os comprimentos de onda tiveram um pico de absorção óbvio em 260 nm. Além das características de interação hidrofóbica e π – π (π – π * pico do plasmon) das folhas GO, as ligações covalentes entre proteínas e grupos carboxila nas folhas GO também apoiaram a adesão superficial. Antes e depois da ligação de BSA e antiBSA, os valores de pico π – π * do plasmon de GO (230 e 270 nm) foram significativamente alterados, o que provou que BSA e antiBSA estavam ligados positivamente.

Análise de espectros de absorção de UV-vis para resposta imune. a GO vinculado a AuNP e BSA vinculado a GO, b AuNPs e anti-BSA ligado a GO, c Sonda AuNP-GO-antiBSA e d Sonda AuNP-GO-antiBSA e alvo GO-BSA para resposta imunológica

A Figura 7 mostra que esses resultados estão de acordo com as curvas de calibração. A análise detalhada dos resultados experimentais acima (Fig. 6c, d) mostrou que as respostas de detecção para as imprecisões médias correspondentes de absorbância foram 1,3487, 1,1776, 1,0698, 0,8755 e 0,8588 (Fig. 7a) e 0,9226, 0,8535, 0,7649, 0,7243 e 0,695 (Fig. 7b), correspondendo a concentrações de proteínas de 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM e 145 fM, respectivamente. A Figura 7a mostra que a regressão linear das curvas de calibração foi f (x) =0,918 + 0,124 × (coeficiente de correlação, R ² =0,94) para a sonda AuNP-GO com interações antiBSA, onde x é a concentração de proteína e y é a absorbância óptica. Além disso, a Fig. 7b mostra que a equação de regressão linear da curva ajustada foi f (x) =0,791 + 0,057 × (coeficiente de correlação, R ² =0,954) para GO e AuNP-GO com base no imunoensaio.

Comparação das curvas de calibração de respostas de detecção obtidas em diferentes concentrações de proteína. a Curvas de calibração para sonda AuNP-GO com interações antiBSA. b Curvas de calibração para GO e GO-AuNPs com base em um imunoensaio

Durante o experimento de quantificação, adicionamos uma concentração fixa de 10 ng / ml de proteína gonadotrofina coriônica humana (hCG) para atuar como um interferente. Os resultados mostraram que a proteína hCG do interferente fixo nas curvas de calibração do imunoensaio foram ajustadas por f (x) =0,843 + 0,113 × (coeficiente de correlação, R ² =0,89) para a sonda AuNP-GO com interações antiBSA (Fig. 7a), e f (x) =0,722 + 0,051 × (coeficiente de correlação, R ² =0,73) para o GO e AuNP-GO com base no imunoensaio (Fig. 7b).

Além disso, nossos resultados experimentais mostraram que a estratégia de detecção permitiu a regeneração da superfície sem perda de especificidade (quatro regenerações) e que também poderia ser usada para detectar a proteína antiBSA com respostas dinâmicas variando de 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM , 145 fM e 0 fM. Os resultados demonstraram que com a diminuição da concentração de antiBSA (de 1,45 nM para 145 fM) e mesmo sem a presença de antiBSA (0 fM), a intensidade de absorção espectral não alterou o nível mínimo de quantificação. The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.

Conclusões

We successfully demonstrated a GO-bound AuNP biocompatible nanocomposite in a biosensing mechanism in a rapid and label-free immunoassay for biomolecule interactions. The results showed that the AuNP-GO nanocomposite was biocompatible and exhibited LSPR extinction to biomolecules, which could promote the absorption spectra characteristic peaks, accelerate the reaction of molecules, and enhance the stability of chemical covalent bonds during immobilization. For the detection of antiBSA protein, the limit of detection of the GO and AuNP-GO based on the immunoassay was as low as 145 fM. Among the AuNP-GO biosensors, GO immobilized in the AuNP-GO nanocomposite showed the highest bioaffinity, with good sensitivity, low detection limit, and fast response toward the protein immunoassay. The results of our experiments showed that a fixed concentration 10 ng/ml of hCG protein as an interferer did not affect the test response. Given the growing trend of applying biosensors in POCT, LSPR for AuNP-GO nanocomposite technology is a highly promising and versatile tool for use in immunoassays. Combining the properties of AuNPs and GO sheets to develop new nanocomposites for the synthesis of smart materials shows promise for the development of user-friendly diagnosis applications. In the future, AuNP-GO nanocomposites may be used in innovative immunoassays, rapid detection reagents, and miniaturization, which may in turn make LSPR technology an irreplaceable tool for routine clinical analysis and POCT diagnostics.

Abreviações

Ag:

Prata

AntiBSA:

Bovine serum albumin antibody

Au:

Ouro

AuNP:

Gold nanoparticle

BSA:

Bovine serum albumin

Cys:

Cystamine

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

FEG-TEM:

Field-emission gun transmission electron microscope

FTIR:

Fourier-transform infrared spectrometer

GO:

Graphene oxide sheet

HR-TEM:

Microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução

LOD:

Limit of detection

LSPR:

Ressonância de plasmon de superfície localizada

MOA:

8-Mercaptooctanoic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

Pd:

Paládio

POCT:

Point-of-care testing

Pt:

Platina

RGO:

Reduction graphene oxide

SAMs:

Monocamadas auto-montadas

SERS:

Surface-enhanced Raman scattering

UV-vis:

Ultraviolet-visible

XPS:

espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

ZnO:

Zinc oxide

Otimização da absorção de banda larga e multibanda de grafeno monocamada em frequências ópticas de ressonâncias de dipolo magnético múltiplo em metamateriais Modulação da Morfologia e Propriedade Ótica de PdAuAg Multi-Metálico e Nanoestruturas de Liga PdAg