Imunoensaio Ultra-Sensível, Livre de Marcadores, Usando Biossensores Plasmonicos Híbridos de Nanopartículas de Ouro-Óxido de Grafeno

Resumo

Este trabalho apresenta novo nanocompósito AuNP-GO que combina alta biocompatibilidade do óxido de grafeno com ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) de nanopartículas de ouro. A plataforma híbrida permite detecção livre de marcadores de interações proteicas com sensibilidade sem precedentes. Usando sensor AuNP-GO, anti-BSA foi detectado em concentrações tão baixas quanto 145 fM na presença de 10 ng ml⁻¹ interferência de hCG. A faixa dinâmica abrangeu cinco ordens de magnitude (1,45 nM a 145 fM). Esses resultados demonstram potencial de biossensores plasmonicos AuNP-GO para diagnósticos rápidos de ponto de cuidado e triagem de biomarcadores.

Introdução

Nanomateriais baseados em carbono — grafeno, nanotubos de carbono e óxido de grafeno (GO) — tornaram-se pilares em biossensoriamento devido às suas propriedades elétricas, ópticas e de química de superfície excepcionais. A estrutura bidimensional do GO e grupos funcionais ricos em oxigênio (epóxidos, hidroxilas, carboxilas) conferem alta afinidade proteica e permitem acoplamento covalente, tornando-o substrato atraente para sensores eletroquímicos, de fluorescência, SPR e LSPR. Nanopartículas de ouro (AuNPs) trazem absorção plasmonica ajustável, biocompatibilidade e química de superfície facilitada, permitindo-lhes atuar como amplificadores de sinal ou marcadores ópticos. Quando AuNPs são decorados em GO, o híbrido herda ligação rápida do GO e LSPR intenso de AuNPs, levando a sensibilidade aprimorada em imunoensaios, detecção de DNA e ensaios enzimáticos. Apesar de extensos estudos eletroquímicos e SERS, nenhum imunoensaio colorimétrico ou livre de marcadores rápido baseado em híbridos AuNP-GO "naked-eye" foi relatado até hoje. Este estudo preenche essa lacuna desenvolvendo imunoensaio baseado em quimissorção, com LSPR aprimorado, que opera em buffer aquoso e tolera interferentes comuns.

Métodos/Experimental

Materiais

Grafite (Graphene Supermarket), GO (método Hummer modificado, flocos 0,1-1 µm, 1,1 nm espessura), cistamina dicloridrato (Cys, 96%), HAuCl₄·3H₂O (99,99%), citrato de sódio, BSA, anti-BSA (IgG coelho), NHS e EDC foram obtidos da Sigma-Aldrich ou Alfa Aesar. Todos os reagentes foram usados sem purificação adicional.

Síntese de AuNPs

AuNPs foram sintetizadas por redução com citrato: 15 mL de 1 mM HAuCl₄ foi refluxado a 550 °C, 1100 rpm; 1,8 mL de 38,8 mM citrato de sódio foi adicionado. Após 5 min, mistura foi fervida a 400 °C, 900 rpm por 30 min e resfriada à temperatura ambiente. Este procedimento rende AuNPs esféricas ~15 nm; usando 0,8 mL citrato produz partículas ~60 nm. A reação: HAuCl₄ + C₆H₅O₇Na₃ → Au(s) + CO₂ + HCOOH.

Preparação do Alvo Antigênico GO-BSA

Folhas de GO (0,1 g L⁻¹) foram ativadas com EDC (400 µM) e NHS (100 µM) (razão de volume 1:1). BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) foi acoplada covalentemente via formação de ligação amida e purificada por centrifugação repetida. Figura 1 ilustra fluxo de trabalho de conjugação GO-BSA.

Preparação da Sonda AuNP-antiBSA

AuNPs foram funcionalizadas com Cys (10 mM, 2 h, TA) para introduzir grupos –NH₂ expostos. Anti-BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) foi então acoplada via ligações amida sem ativação adicional, seguida por centrifugação para remover anticorpo não ligado. Diluições seriadas de 100 µg mL⁻¹ a 1 pg mL⁻¹ produziram gama de sondas AuNP-antiBSA (Fig. 2a). Compósitos AuNP-GO-antiBSA foram montados por ativação EDC/NHS de carboxilas de GO e anexação covalente de AuNPs modificadas com Cys, então acoplamento de anticorpo (Fig. 2b).

Técnicas de Caracterização

Caracterização estrutural e óptica empregou FE-TEM, HR-TEM, SEM (JEOL JSM-7800F), espectroscopia UV-vis (U-2900, Hitachi), microscopia Raman (MRI, Protrustech), FTIR (Bruker Vertex 80v ATR) e XPS (National Synchrotron Radiation Research Center). Tamanho, distribuição e química de superfície de AuNPs foram confirmados em todas as amostras.

Resultados e Discussão

Morfologia e Composição

SEM e TEM revelaram AuNPs uniformes de 60 nm distribuídas uniformemente em folhas de GO enrugadas (Fig. 3). XPS confirmou presença de grupos funcionais C-C (sp²), C-C (sp³), C-O, C=O e O-C=O em GO, enquanto picos Au 4f verificaram integração de AuNPs.

Caracterização Espectroscópica do GO

Espectros de XPS C 1s de alta resolução, Raman e FTIR-ATR confirmam grupos funcionais oxigenados característicos do GO (C sp², epóxidos, hidroxilas, carbonilas, carboxilas). Picos Raman a 1355 cm⁻¹ (D), 1614 cm⁻¹ (G) e 2714 cm⁻¹ (2D) corroboram estrutura em camadas (Fig. 4).

Interação Proteica e Resposta LSPR

Espectros UV-vis de AuNPs (15 nm e 60 nm) mostram picos LSPR a 520 nm e 540 nm, respectivamente. GO sozinho exibe absorção π-π* a 230 nm e n-π* a 300 nm. Após funcionalização, conjugados AuNP-Cys-antiBSA exibem picos duais a 540 nm (AuNP) e 755 nm (AuNP-Cys-antiBSA) com deslocamento dependente de concentração (Fig. 5). Curvas de calibração (y = 2,43 + 0,25x, R² = 0,91 para 540 nm; y = 2,56 + 0,31x, R² = 0,96 para 760 nm) confirmam linearidade em 1,45 nM a 145 fM anti-BSA.

Híbridos AuNP-GO-antiBSA amplificam ainda mais sinal LSPR. Adição de alvos GO-BSA faz pico de 540 nm deslocar linearmente com concentração de anti-BSA (1,45 nM-145 fM), resultando em LOD de 145 fM (Fig. 6). Calibração para sonda AuNP-GO (f(x) = 0,918 + 0,124x, R² = 0,94) e para GO sozinho (f(x) = 0,791 + 0,057x, R² = 0,954) demonstram sensibilidade superior do sistema híbrido.

Estudos de interferência com 10 ng ml⁻¹ hCG mostraram reatividade cruzada mínima (R² = 0,89 para AuNP-GO; 0,73 para GO sozinho), confirmando robustez do ensaio. Sensor manteve desempenho após quatro ciclos de regeneração, indicando alta estabilidade de superfície.

Conclusões

Projetamos híbrido biocompatível AuNP-GO que aproveita LSPR para alcançar detecção livre de marcadores de anti-BSA a 145 fM. Nanocompósito exibe alta bioafinidade, resposta rápida e resiliência a interferentes comuns, tornando-o plataforma atraente para imunoensaios de ponto de cuidado. Trabalhos futuros explorarão detecção multiplexada, integração em dispositivos microfluídicos e adaptação a biomarcadores clinicamente relevantes.

Abreviações

Ag:

Prata

AntiBSA:

Anticorpo albumina sérica bovina

Au:

Ouro

AuNP:

Nanopartícula de ouro

BSA:

Albumina sérica bovina

Cys:

Cistamina

EDC:

1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

FEG-TEM:

Microscópio eletrônico de transmissão com canhão de emissão de campo

FTIR:

Espectrômetro infravermelho de transformada de Fourier

GO:

Folha de óxido de grafeno

HR-TEM:

Microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução

LOD:

Limite de detecção

LSPR:

Ressonância de plasmon de superfície localizada

MOA:

Ácido 8-mercaptooctanoico

NHS:

N-Hidroxissuccinimida

Pd:

Paládio

POCT:

Teste de ponto de cuidado

Pt:

Platina

RGO:

Óxido de grafeno reduzido

SAMs:

Monocamadas auto-organizadas

SERS:

Espalhamento Raman realçado de superfície

UV-vis:

Ultravioleta-visível

XPS:

Espectroscopia de fotoelétrons de raios X

ZnO:

Óxido de zinco