A entrega de nanopartículas magnéticas de Fe3O4 modificada de CpG inibe o crescimento do tumor e as metástases pulmonares espontâneas para aumentar a imunoterapia

Resumo

Como um novo agonista do receptor toll-like 9 (TLR9), oligodesoxinucleotídeos sintéticos não metilados de citosina-fosfato-guanina (CpG) podem estimular uma resposta imune Th1 e, potencialmente, ser usados ​​como agentes terapêuticos ou adjuvantes de vacinas para o tratamento do câncer. No entanto, algumas desvantagens do CpG limitam suas aplicações, como a eliminação rápida por degradação mediada por nuclease e baixa absorção celular. Portanto, a administração repetida de medicamentos em altas doses é necessária para o tratamento. Neste trabalho, um sistema de entrega de CpG baseado em 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) -fe modificado ₃ O ₄ nanopartículas (FeNPs) foram projetadas e estudadas pela primeira vez para alcançar uma melhor bioatividade de CpG. Em nossos resultados, projetamos partículas CpG entregues por FeNP (FeNP / CpG) com um tamanho médio pequeno de aproximadamente 50 nm carregando CpG em FeNPs. O sistema de entrega de partículas FeNP / CpG, com captação celular aumentada de CpG em células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) in vitro e por meio de injeção intratumoral, mostrou capacidade antitumoral significativa ao estimular melhores respostas imunes humorais e celulares no câncer de cólon C26 e mama 4T1 modelos de xenoenxerto de câncer in vivo sobre aqueles de CpG livre. Além disso, os camundongos tratados com partículas de FeNP / CpG apresentaram crescimento tardio do tumor com uma taxa inibitória de até 94,4%. Além disso, aproximadamente 50% dos tumores no modelo C26 pareceram regredir completamente. Da mesma forma, houve metástases pulmonares mais baixas e uma taxa de inibição do tumor de 69% no modelo de tumor de câncer de mama 4T1 do que nos controles não tratados. Além de sua eficácia, a fácil preparação, segurança e alta estabilidade das partículas de FeNP / CpG também as tornam uma imunoterapia antitumoral atraente.

Histórico

Os tumores malignos são uma das principais doenças que ameaçam a saúde e a vida humana, e a incidência de tumores está aumentando continuamente [1, 2]. Infelizmente, os resultados dos tratamentos tradicionais, como radioterapia, quimioterapia e cirurgia para tumores malignos, não foram muito eficazes. Em contraste com a quimioterapia e a radioterapia, que têm como alvo as células em proliferação rápida para a morte, as imunoterapias são projetadas para melhorar o sistema de defesa imunológico do próprio hospedeiro para direcionar e eliminar as células tumorais.

É digno de nota que os CpG imunoterapêuticos foram estudados extensivamente quanto à sua eficácia na prevenção e regressão tumoral [3]. Apesar dos dados clínicos encorajadores, o uso de CpG livre ainda tem várias desvantagens. Em primeiro lugar, os CpG são suscetíveis à degradação mediada por nuclease em condições biológicas. Em segundo lugar, eles não têm especificidade para células-alvo após a administração sistêmica e têm baixa absorção celular. Portanto, é provável que sejam necessárias melhorias. Como os TLR9s se localizam nos endossomos, formulamos a hipótese de que a baixa captação de CpG pelas células inflamatórias associadas ao tumor causa uma resposta clínica fraca. Assim, métodos que aumentam a internalização de CpG podem potencializar sua resposta imunoestimuladora.

Exceto pelas desvantagens do CpG livre, a via de administração do CpG afeta a capacidade antitumoral e a toxicidade. O CpG livre e outros oligonucleotídeos fosforotioato estáveis ​​administrados por injeção intravenosa são eliminados rapidamente e têm uma ampla distribuição nos tecidos [4, 5]. Além disso, o CpG livre administrado sistemicamente pode induzir uma ativação imune inespecífica, levando a efeitos colaterais graves, incluindo exaustão de células imunes, destruição de folículos linfoides, dano hepático e exacerbação de doenças autoimunes [6,7,8]. Essas propriedades podem ser responsáveis ​​pela falha do CpG livre administrado sistemicamente em pacientes humanos [9]. Estudos anteriores demonstraram que a injeção intratumoral de CpG teve um grande efeito antitumoral por “focar” a estimulação imunológica nos locais do tumor [10]. Como controlar o tempo de retenção do CpG injetado no tumor é um problema.

Ao usar o receptor 9 semelhante a toll, células dendríticas, macrófagos e células NK podem reconhecer CpG, que são comuns no DNA bacteriano [11]. O CpG induz as células imunes a produzirem quimiocinas e citocinas, e as moléculas de superfície celular coestimulatórias reguladas positivamente das células T [12,13,14,15]. Assim, CpG emergiu como potentes adjuvantes de polarização do tipo 1 [16, 17]. Além disso, a injeção de CpG diretamente em tumores é uma forma de imunização que usa o tumor in situ como uma fonte de antígeno e introduz CpG como um adjuvante para ativar uma resposta imune dentro do tumor. Portanto, formulamos a hipótese de que a injeção intratumoral de CpG aboliria o privilégio imunológico de tumores por meio do recrutamento e ativação de células dendríticas locais, dependendo da via de resposta de células T antitumorais tipo 1.

Para superar os problemas mencionados acima, desenvolvemos uma plataforma de partículas magnéticas modificada baseada em Fe ₃ O ₄ partículas para dirigir e controlar a liberação de CpG por meio de injeção intratumoral nos locais do tumor. Devido a algumas características únicas de Fe ₃ O ₄ partículas magnéticas, especialmente sua boa histocompatibilidade [18], superparamagnetismo [19, 20], baixa toxicidade [21] e fácil preparação e distribuição direcionada de drogas com um campo magnético externo [22, 23], seu movimento e concentração podem ser controlados em o corpo com um campo magnético externo, permitindo o Fe ₃ O ₄ partículas para serem usadas como transportadores de medicamentos genéticos com maior eficiência de transfecção de genes [24]. Além disso, revestindo APTES em Fe ₃ O ₄ partículas por ligação covalente evita a formação de agregados e oferece mais locais de modificação (grupos amino) [25, 26] para ajuda adicional na ligação de CpG. Neste estudo, Fe ₃ O ₄ Partículas magnéticas foram preparadas por um método de co-precipitação [27] e modificadas com APTES. CpG foram firmemente ligados à superfície do Fe ₃ modificado O ₄ partículas por interação eletrostática para formar partículas FeNP / CpG com um diâmetro de aproximadamente 50 nm. Outros estudos mostraram que os sistemas de entrega de partículas FeNP têm uma eficiência de captação aumentada de CpG em comparação com a de CpG livre em células dendríticas, e a injeção intratumoral de partículas de FeNP / CpG estimula uma resposta imune antitumoral eficaz do tipo Th1 não apenas para conter o tumor em crescimento situ, mas também para inibir a metástase tumoral em modelos de câncer de cólon C26 e câncer de mama 4T1 in vivo. Portanto, a terapia de nanopreparação pode ser uma estratégia potencial de imunoterapia do tumor.

Materiais e métodos

Materiais e animais

3-Aminopropiltrietoxissilano (APTES) foi obtido da Aladdin Company, Inc. Cloreto férrico hexa-hidratado (FeCl ₃ ∙ 6H ₂ O) e tetra-hidrato de cloreto ferroso (FeCl ₂ ∙ 4H ₂ O) foram adquiridos do Tianjin Guangfu Fine Chemical Industry Research Institute. O seguinte CpG foi sintetizado por Invitrogen Co .:5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3 ′. O isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi adquirido à Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA).

Uma linha de células de rim embrionário humano (293T), linha de células de tumor de mama murino (4T1) e linha de células de câncer de cólon (C26) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC), e células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) foram obtidas de camundongos BALB / c. Camundongos BALB / c fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram adquiridos da Beijing HuaFuKang Laboratory Animal Co. Ltd. Os camundongos foram criados e mantidos em condições livres de patógenos. Todos os protocolos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health.

Preparação de FeNP

O método de co-precipitação foi usado para a síntese de Fe ₃ O ₄ partículas [29]. No procedimento experimental, 11,68 g FeCl ₃ ∙ 6H ₂ O e 4,30 g FeCl ₂ ∙ 4H ₂ O foram adicionados a um frasco de três gargalos contendo 200 mL de água desionizada a 80 ° C, seguido pela adição de 15 mL de NH 25% ₃ · H ₂ O. Durante o processo de reação de 1 h, a mistura foi purgada com N ₂ e mexido. Trinta miligramas de Fe ₃ preparado O ₄ foi disperso em uma mistura de 60 ml de água desionizada e etanol absoluto por vibração ultrassônica por 30 min. 0,3 g de Fe ₃ preparado O ₄ foi disperso em uma mistura de 4 mL de água desionizada e 600 mL de etanol absoluto por vibração ultrassônica por 30 min. Em seguida, 1,2 mL de APTES foram adicionados à mistura sob agitação mecânica constante durante 7 h. O Fe ₃ modificado por APTES funcionalizado resultante O ₄ (FeNP) nanopartículas foram magneticamente separadas do sobrenadante por um ímã, então lavadas com etanol e secas a 40 ° C sob vácuo por 24 h. Finalmente, o precipitado do FeNP foi preparado para uso posterior.

Caracterização de partículas FeNP / CpG

Os espectros de distribuição de tamanho de partícula de Fe ₃ O ₄ , FeNP e partículas de FeNP / CpG foram determinadas usando um analisador de tamanho de partícula a laser Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) a 25 ° C. Cada teste foi realizado três vezes, e o valor médio foi calculado. Um microscópio eletrônico de transmissão (H-6009IV; Hitachi Ltd., Tóquio, Japão) e um microscópio eletrônico de varredura (MEV) foram usados ​​para observar a morfologia das partículas preparadas.

Um ensaio de retardamento de agarose foi realizado para avaliar a capacidade de ligação de CpG das partículas de FeNP. Resumidamente, o Fe ₃ modificado por APTES funcionalizado O ₄ partículas (FeNP) foram misturadas com 1 μg CpG em diferentes proporções (FeNP:CpG, w / w ) em água destilada. Após a co-incubação por 30 min em temperatura ambiente, as misturas foram submetidas a eletroforese em 1% ( w / v ) gel de agarose a 120 V durante 30 min. O gel foi então corado com Golden View ™ (0,5 mg / mL) e fotografado por um iluminador UV (Bio-Rad ChemiDox XRS, EUA).

Ensaio MTT

A citotoxicidade das partículas FeNP para as linhas celulares C26, 4T1 e 293T foi avaliada com um ensaio de MTT. Células C26, 4T1 e 293T foram semeadas a uma densidade de 5 × 10 ³ células por poço em 100 μL de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS em placas de 96 poços e cultivadas por 24 h ou 72 h. As células preparadas foram expostas a uma série de partículas de FeNP em diferentes concentrações:1,25, 0,625, 0,3, 0,15, 0,07, 0,03, 0,01 e 0 mg / ml em sextuplicado. Depois de cultivar por tempos pontuais, 100 μl de meio completo e 10 μl de MTT foram pipetados em cada poço e incubados a 37 ° C por 4 h. Adicionou-se DMSO ao soluto durante 30 min e formou-se o formazan. Em seguida, a absorbância foi medida a 570 nm com um Spectramax M5 Microtiter Plate Luminometer (Molecular Devices, EUA). A viabilidade celular das células não tratadas foi considerada 100%.

Transfecção In Vitro

Os BMDCs foram preparados a partir de camundongos BALB / c. Resumidamente, as células da medula óssea do fêmur e da tíbia foram lavadas com FBS livre contendo meio de cultura 1640 usando uma seringa. As células foram centrifugadas a 1500 rpm por 3 min, tratadas com tampão de lise ACK (Lonza Inc.) para remover os glóbulos vermelhos e ressuspensas em meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina ( 100 U / mL) a 37 ° C em 5% de CO2 com 20 ng / mL de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF). As células foram então semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 10 ⁶ células por poço, e o meio de crescimento foi trocado a cada 2 dias. As células dendríticas foram colhidas no dia 7.

No dia 7, um equivalente particulado de 0,2 μg livre de CpG conjugado com FITC (CpG-FITC) ou FeNP entregando CpG-FITC com uma razão de massa de 10:1 foi adicionado aos poços pré-projetados. Uma ou 3 horas após a transfecção, os meios de crescimento foram removidos, as células foram coradas com DAPI durante 10 minutos e as células foram lavadas com solução salina fisiológica três vezes. As fotos de cada poço foram tiradas com um microscópio confocal de varredura a laser (LSCM), e a eficiência de transfecção foi medida por citometria de fluxo (NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences, EUA).

Ensaio de inibição de tumor in vivo

Cem mil células C26 ou 4T1 foram injetadas por via subcutânea nas costas de cada camundongo BALB / c (6–8 semanas de idade). Os volumes dos tumores foram subsequentemente medidos usando um paquímetro digital e calculados pela seguinte fórmula:volume do tumor =0,5 × comprimento (mm) × [largura (mm)] ² . Assim que os tumores atingirem aproximadamente 50 mm ³ em tamanho, os tratamentos foram aplicados. Os ratos ( n =10) receberam injeções intratumorais de CpG / FeNP (em uma proporção de 10:1) particulado equivalente a 20 μg de CpG ou CpG sozinho a cada 3 dias por quatro tratamentos. Os camundongos que receberam um equivalente de solução salina normal (NS) ou partículas de FeNP foram considerados grupos de controle. O tamanho do tumor e o peso corporal do animal foram monitorados a cada 3 dias. No dia 31, todos os camundongos foram sacrificados por deslocamento da vértebra cervical. O tecido tumoral e outros órgãos importantes foram fixados com formalina neutra a 4% seguida de secção de parafina para coloração HE para avaliar a diferença morfológica e para imunofluorescência para testar microambientes tumorais. No modelo 4T1, medimos o peso do tumor e contamos o número de nódulos de metástase pulmonar.

O experimento de novo desafio do tumor foi processado no modelo C26. Resumidamente, camundongos curados com o tratamento FeNP / CpG foram desafiados novamente com 5 × 10 ⁵ Células C26 ou 4T1 s.c. em dois locais separados no lado oposto do flanco sem tratamento adicional. Os camundongos foram sacrificados quando o volume do tumor 4T1 cresceu para 200-300 mm ³ ou 20 dias.

Ensaio de linfócitos T citotóxicos

O ensaio CTL foi realizado de acordo com métodos publicados. Em detalhes, os linfócitos do baço como células efetoras foram colhidos e esgotados de glóbulos vermelhos com cloreto de amônio e passados ​​através de lã de náilon no final dos experimentos de tratamento. 4T1 ou C26 como células alvo foram marcadas com 300 mci de Na ₂ ⁵¹ CrO ₄ por 2 h e depois lavado com PBS e dispensado em placas de 96 poços. As células efetoras preparadas foram co-incubadas com as células alvo em diferentes razões E:T. Os sobrenadantes contendo radioatividade das células alvo foram medidos com um contador de cintilação. A lise específica foi determinada como se segue:% de lise específica =100 [(libertação na presença de libertação espontânea de CTL) / (libertação máxima libertação espontânea)]. Em todos os experimentos, a liberação espontânea foi inferior a 30% da liberação máxima.

Ensaio ELISpot

Os esplenócitos foram colhidos de camundongos controle ou tratados com CpG no final do experimento, e os ensaios de ELISpot foram realizados usando o kit IFN-γ / IL-4 Dual-Color ELISpot de camundongo de acordo com as instruções do fabricante. Os esplenócitos colhidos foram co-incubados com seus respectivos tratamentos por 96 h, a suspensão foi descartada e as células foram lavadas com tampão de lavagem três vezes antes de adicionar o anticorpo misto de IFN-γ e IL-4. Após ser processado por agentes cromogênicos, o número de células formadoras de manchas (SFCs) foi contado ao microscópio.

Ensaio ELISA

Um ELISA foi realizado para determinar os níveis de títulos de anticorpos séricos específicos para Ct de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, microplacas revestidas com proteína Ct total purificada (BestBio Biotechnology Co. Shanghai, China) foram enxaguadas com solução de PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e então bloqueadas com 100 μl de tampão de bloqueio (5% de leite desnatado em PBST) a 37 ° C durante 1 h. Depois de serem enxaguadas cinco vezes com PBST, as placas foram incubadas com soro imune (diluído a 1:1000 em tampão de bloqueio, 100 μl / poço) ou lavagens vaginais (diluído a 1:10 em tampão de bloqueio, 100 μl / poço) a 37 ° C por 2 h. Depois de serem enxaguadas cinco vezes com PBST, as placas foram incubadas com anticorpo IgG de cabra anti-camundongo conjugado com HRP (diluído a 1:1000 em tampão de bloqueio, 100 μl / poço) ou anticorpo IgA de cabra anti-camundongo conjugado com HRP (diluído em 1:2000 em tampão de bloqueio, 100 μl / poço) a 37 ° C por 1 h.

Análise Histológica

O tecido tumoral e os principais órgãos colhidos em estudos de inibição in vivo foram fixados e incluídos em parafina. Após a desparafinação e reidratação, as seções de tecido embebidas em cera foram coradas com HE de Mayer. Para analisar linfócitos infiltrantes (TILs) dentro dos tecidos tumorais de cada grupo, as seções foram submetidas a reparo de antígeno de alta pressão, coradas com FITC-CD4 anti-camundongo, PE-CD8 e PE-CD49b (como fabricante de NK) (BD, EUA) por 1 h a 4 ° C e, em seguida, corado com DAPI por 10 min antes da lavagem com PBS para obtenção de imagens. Uma imagem de cada grupo foi obtida por meio de um microscópio de fluorescência positiva (Olympus, Japão).

Análise estatística

Os dados foram expressos como valor médio ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada com uma análise de variância unilateral (ANOVA) usando o software Prism 5.0c (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA) software SPSS 17. Uma comparação intergrupos foi realizada usando o teste de Tukey para a análise de variância de fator único (ANOVA). P valores <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Preparação e caracterização de partículas FeNP / CpG

Para desenvolver uma partícula magnética para entrega CpG com baixa citotoxicidade, Fe ₃ O ₄ as partículas foram sintetizadas usando o método de co-precipitação, conforme mostrado na Fig. 1a. Enxerto de grupos aminopropilsilano (–O) 3Si – CH2 – CH2 – CH2 – NH2 de APTES na superfície de Fe ₃ O ₄ para formar partículas de FeNP (Fig. 1b). O CpG carregado negativamente (CpG) se liga a grupos funcionais eficazes fornecidos pelo APTES para formar partículas FeNP / CpG por meio de interações eletrostáticas, conforme esquematicamente representado na Fig. 1c. Com base na medição de espalhamento de luz dinâmica, o tamanho do Fe ₃ preparado O ₄ as partículas eram de 10,7 ± 4,1 nm (Fig. 2a). Conforme observado por meio de TEM (Fig. 2b) e SEM (Fig. 2c), Fe ₃ O ₄ desenvolvido neste trabalho apresentou uma forma uniforme e quase esférica. O diâmetro dinâmico do Fe modificado por APTES ₃ O ₄ partículas era de 34,5 ± 5,0 nm (Fig. 2d), o que estava de acordo com os resultados de TEM (Fig. 2e).

Preparação de partículas FeNP / CpG. a Equação de síntese de Fe ₃ O ₄ partículas magnéticas usando o método de co-precipitação. b Reações de hidrólise e condensação com produção de polímero de silano e reação de silanização de APTES na superfície de magnetita para formar partículas de FeNP. c Diagrama esquemático das partículas FeNP / CpG. CpG são ligados à superfície dos FeNPs por meio de interações eletrostáticas para formar partículas de FeNP / CpG

Caracterização de partículas FeNP / CpG. a Espectro de distribuição de tamanho de Fe ₃ O ₄ partículas. b Imagem microscópica eletrônica de transmissão (TEM) de Fe ₃ O ₄ . c Imagem de microscopia eletrônica de varredura de Fe ₃ O ₄ partículas. d Distribuição de tamanho de Fe revestido com APTES ₃ O ₄ (FeNP) partículas. e A imagem TEM de partículas FeNP. f A capacidade de ligação de CpG de FeNPs determinada por ensaio de retardamento em gel. Todos os dados representam três experimentos independentes

Para ilustrar a capacidade de ligação das partículas de FeNP ao CpG, foi realizado um ensaio de retardamento de gel (Fig. 2f). Quando a razão molar de FeNP com CpG foi de 10:1, nenhuma banda CpG brilhante foi observada, mostrando que o CpG carregado negativamente pode ser completamente adsorvido por partículas de FeNP por meio de interações eletrostáticas após a eletroforese. Portanto, escolhemos essa proporção de prescrição para aplicação posterior em nosso estudo. Juntos, esses resultados demonstraram que o CpG pode se combinar com sucesso na superfície de FeNPs por meio de interações eletrostáticas, apresentando estabilidade e pequena dimensão.

Viabilidade celular e transfecção de partículas FeNP / CpG in vitro

Para melhor descrever a caracterização biofísica in vitro, detectamos a citotoxicidade de FeNPs em células 293T, 4T1 e C26 no ponto de 24 h ou 72 h (Fig. 3a). Não houve relação óbvia dependente da dose entre a viabilidade celular e as partículas FeNP nas células 293T, C26 e 4T1. A taxa de sobrevivência celular foi de mais de 80% em 24 he 60% em 72 h em três tipos de células, mesmo em uma concentração de FeNP de 1,25 mg / ml. Esses resultados comprovaram a biocompatibilidade das partículas de FeNP tanto para células normais (293T) quanto para células tumorais (C26, 4T1).

Citotoxicidade e atividade de absorção de partículas FeNP / CpG in vitro. a Ensaio de MTT. Detectamos a viabilidade de células 293T, 4T1 e C26 após o tratamento com várias concentrações de partículas de FeNP por 24 h ou 72 h. Não houve diferença significativa na viabilidade celular em qualquer dose de FeNPs. b , c A detecção de captação de FeNP / CpG em BMDCs. BMDCs preparados após GM - CSF tratamento durante 7 dias foram transfectados com CpG-FITC ou CpG-FITC entregue com FeNP durante 1 ou 3 h antes de serem intensamente lavados, fixados e marcados com DAPI. As imagens foram capturadas por microscopia confocal de varredura a laser (LSCM). Em comparação com o CpG livre marcado com FITC, o FeNP / CpG com intensidade de fluorescência aumentada ( b ) e a eficiência de transfecção foram estatisticamente significativas ( c ) Esses dados foram representativos de três experimentos independentes, a média ± erro padrão; * P < 0,05, * P < 0,01 e *** P < 0,001 vs o grupo não tratado

As células dendríticas como células receptoras principais para CpG desempenham um papel importante em uma resposta imune antitumoral mediada por TLR9. O CpG como um potente adjuvante de polarização do tipo 1 induz DCs para ativar uma resposta imune dentro do tumor, secretando quimiocinas e citocinas. Portanto, a entrega eficiente de CPG em células DC é crucial para atingir uma resposta antitumoral. Em nosso estudo, CpG conjugado com FITC foram usados ​​para investigar a capacidade de entrega de partículas FeNP para DCs in vitro. Após 1 ou 3 h pós-transfecção, via microscopia confocal de varredura a laser (LSCM), a intensidade de fluorescência celular nos grupos tratados com partículas FeNP revestidas com CpG conjugado com FITC (FeNP / CpG-FITC) foi maior do que para os quantidade equivalente de grupos CpG livres (Fig. 3b). As partículas FeNP / CpG-FITC foram capazes de transfectar até 18,3% das DCs após 1 h. Então, 3 horas após a transfecção, a proporção de células positivas aumentou para 39,2% (Fig. 3c). Enquanto isso, em relação às células tratadas com CpG conjugado com FITC livre, fluorescência mínima pode ser observada mesmo 3 horas após a transfecção, com menos de 10% de transfecção. Assim, sugere-se que a entrega de CpG por partículas de FeNP aumentou a captação celular de CpG.

FeNPs entregam CpG ao xenoenxerto e inibem o crescimento do tumor e metástases pulmonares espontâneas in vivo

A atividade anticâncer das partículas CpG / FeNP foi avaliada pela primeira vez em modelos de tumor de transplante subcutâneo de câncer de cólon C26 e câncer de mama 4T1 in vivo. Quando o volume do tumor era de aproximadamente 50 mm ³ , os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos para iniciar o tratamento ( n =10). Os camundongos foram tratados com uma injeção intratumoral de partículas CpG / FeNP três vezes ao longo de todo o experimento (Fig. 4a). Em nosso estudo, a injeção intratumoral de partículas FeNP / CpG resultou em uma inibição significativa do crescimento do tumor do xenoenxerto em comparação com os grupos de controle, e a taxa de inibição foi de até 69% ( P <0,05 versus NS) (Fig. 4b). Em comparação com o grupo de tratamento com solução salina normal (NS) (0,90 ± 0,08 g) e o grupo FeNP (0,81 ± 0,03 g), os grupos tratados com partículas FeNP / CpG experimentaram uma redução estatisticamente significativa no peso do tumor (0,38 ± 0,03 g, P <0,001). Comparativamente, o grupo CpG livre apresentou capacidade anticâncer mínima (0,68 ± 0,03 g) (Fig. 4c). Além disso, os camundongos do grupo de controle PBS desenvolveram metástases pulmonares extensas, em comparação, aqueles tratados com as partículas FeNP / CpG apresentaram uma diminuição de 64,1% no número de nódulos tumorais no pulmão (Fig. 4d, e), demonstrando o poder das partículas FeNP / CpG no tratamento de tumores metastáticos. Como mostrado na Fig. 4f, a coloração H&E do pulmão mostrou carga pulmonar reduzida com metástases pulmonares claramente após o tratamento com FeNP / CpG do que em outros grupos. Estes resultados indicam que a entrega de FeNP CpG em células 4T1 não apenas inibiu significativamente o crescimento do tumor 4T1 ( P <0,001 versus NS), mas também suprimiu a metástase do câncer de mama para os pulmões.

Capacidade antitumoral de partículas FeNP / CpG in vivo. a Esquema de tratamento de antitumorais por partículas FeNP / CpG em modelos de xenoenxerto de câncer de cólon C26 e câncer de mama 4T1 por meio de injeção intratumoral in vivo. b - d O tratamento com partículas FeNP / CpG inibiu o crescimento de tumores 4T1. b Curvas de crescimento de tumor representativas do modelo de tumor 4T1. c Peso médio do tumor. d Nódulo tumoral pulmonar médio em cada grupo mostrando claramente metástases pulmonares após injeção intratumoral de FeNP / CpG. e , f Imagem de campo claro e coloração H&E dos pulmões: e O número de metástases pulmonares visíveis, as setas indicam metástases pulmonares. f Coloração H&E da metástase pulmonar. Barras de escala, 100 μm para coloração H&E. g , h Partículas de FeNP / CpG inibiram significativamente o crescimento de tumores de xenoenxerto C26: e curvas de crescimento do tumor de cada grupo durante o experimento e f peso médio do tumor. Havia 10 ratos em cada grupo. g Experiência de novo desafio de tumor. eu No modelo C26, camundongos que foram curados com tratamento com FeNP / CpG foram desafiados novamente com 5 × 10 ⁵ C26 (flanco direito) ou células 4T1 (flanco esquerdo) s.c. em dois locais separados no lado oposto do flanco sem tratamento adicional. As imagens mostradas são camundongos representativos 20 dias após o reinício do tumor. Todos os dados foram representativos de três experiências independentes, a média ± SEM; * P < 0,05, * P < 0,01 e *** P < 0,001

Da mesma forma, um efeito antitumoral intensificado significativo com grupos de tratamento FeNP / CpG foi observado no modelo subcutâneo de camundongos incubados com C26. Como mostrado na Fig. 4g, o tumor cresceu rapidamente nos camundongos de controle, grupo de veículo e grupo CpG, com volumes médios de tumor de aproximadamente 2300 ± 239,4 mm ³ , 2116,7 ± 360,9 mm ³ e 1353,3 ± 158,9 mm ³ , respectivamente, no dia 31. Em contraste, no grupo FeNP / CpG, o crescimento do tumor foi extremamente inibido, com um volume médio do tumor de aproximadamente 153,7 ± 62,7 mm ³ ( P <0,01 versus NS) e uma taxa inibitória de 94,4%. Os tumores pareceram crescer lentamente após o tratamento inicial, e uma parte dos tumores começou a desaparecer gradualmente após o final dos três tratamentos. Ainda mais importante, nos grupos de tratamento com partículas FeNP / CpG, os tumores em quase metade dos camundongos haviam desaparecido completamente até o final do experimento. Como mostrado na Fig. 4h, o grupo de tratamento FeNP / CpG teve um peso médio do tumor muito menor do que os outros grupos ( P <0,001):grupo de tratamento FeNP / CpG (0,14 ± 0,08 g), grupo NS (2,41 ± 0,26 g), grupo FeNP (2,50 ± 0,4 g) e grupo CpG (1,44 ± 0,32 g). Para determinar se as partículas FeNP / CpG foram suficientes para mediar a resposta antitumoral específica, um experimento de novo desafio do tumor foi processado no modelo C26 (Fig. 4i). Os camundongos cujos tumores eram completamente regressivos após o tratamento com partículas FeNP / CpG no modelo de câncer de cólon C26 foram inoculados com tumores 4T1 e C26 em diferentes posições nos camundongos BALB / c por via subcutânea, e nenhum tratamento adicional foi dado. Todos os tumores 4T1 cresceram rapidamente e seus volumes ultrapassaram 1000 mm3 no dia 20 após o desafio. Em contraste, havia tumores sólidos que eram invisíveis a olho nu no modelo C26, sugerindo que os grupos de partículas FeNP / CpG estimularam uma resposta antitumoral específica. Esses resultados sugeriram que a injeção intratumoral de partículas FeNP / CpG inibiu de forma eficiente o crescimento de um xenoenxerto subcutâneo.

Partículas FeNP / CpG estimulam a resposta imunológica antitumoral sistemática aprimorada

Os mecanismos antitumorais in vivo de partículas FeNP / CpG nos dois modelos acima foram ainda estudados. Para estudar o tipo de resposta imune, aplicamos o ensaio ELISpot para analisar os níveis de IFN-γ / IL-4 do baço do camundongo. Se o nível de IFN-γ em linfócitos do baço (mostrando eritema na placa ELISpot) for significativamente maior do que o nível de IL-4 (mostrando manchas azuis na placa ELISpot), o tipo de resposta imune estimulada foi Th1, ou seja, para ativar CD8 ⁺ Linfócitos T e principalmente a resposta CTL do corpo. Caso contrário, o tipo de resposta imune foi Th2, ou seja, para ativar principalmente CD4 ⁺ Linfócitos T, estimulando assim os linfócitos B e produzindo anticorpos específicos para o antígeno. Um ensaio ELISpot de duas cores foi conduzido para medir a expressão de IFN-γ e IL-4 em diferentes tratamentos (Fig. 5a). Em comparação com os outros três grupos, o número de células formadoras de manchas (SFCs) de IL-4 e IFN-γ secretadas de linfócitos do baço de camundongos teve uma tendência ascendente no grupo de tratamento de partículas FeNP / CpG e o número de SFCs a secreção de IFN-γ foi 1,5 vezes maior do que para IL-4 ( P <0,05), o que implica uma resposta imune celular antitumoral aumentada após injeção intratumoral de partícula FeNP / CpG. Além disso, o soro dos camundongos tratados com NS, FeNP, CpG e FeNP / CpG foi analisado usando um ensaio ELISA para a presença de IgG tumor-específico total após três imunizações. No modelo de tumor C26, embora camundongos imunizados com FeNP / CpG tenham desenvolvido títulos significativamente mais elevados de IgG específica de tumor do que aqueles em outros grupos (Fig. 5b), não houve diferença estatística entre camundongos imunizados com FeNP / CpG e camundongos imunizados com CpG .

The mechanism of antitumor immune response. a ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. b In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U testes. c CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. d Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T and NK (CD57 ⁺ ) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. e The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay

To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P  < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P  < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe₃ O ₄ to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.

The FeNP/CpG Increases Infiltrating Lymphocytes in Tumors and Alters Tumor Microenvironments

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4 ⁺ T cells, CD8 ⁺ T cells and CD49B ⁺ NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4 ⁺ T cells, and CD8 ⁺ T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P  < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.

Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. ( a ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. b The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)

Discussion

Synthetic CpG, identified as an effective drug in immunotherapy by simulating the immune activation of natural bacterial DNA [28,29,30], have been characterized in a variety of tumor models. CpG intratumoral injection is one of treatments in clinical trials on CpG. Molenkamp and his colleagues showed that the intratumoral injection of CpG alone or combined with radiotherapy could obviously increase the tumor-specific CD8 ⁺ T cell immune response in lymphoma or melanoma patients, causing systemic tumor regression [31]. So far, CpG combined with other treatments showed both a great antitumor effect and good security, which suggests that CpG are quite effective in tumor immunotherapy. However, the greater challenge of CpG truly coming into clinical application is if they can efficiently be delivered into the cells to combine with receptors such as TLR9 to stimulate an immune response. Nanotechnology can address such concerns by enhancing the delivery of CpG to antigen-presenting cells, and a number of nanocarriers have been explored for this purpose [32,33,34]. The nanoparticle formulations explored include gelatin particles, liposomes [35, 36], and DNA origami structures, but these were only explored in the context of combination treatments.

In this study, we first developed a non-viral delivery system, FeNPs, which were easily formed via APTES-modified Fe₃ O ₄ , to deliver CpG into BMDCs. The CpG surrounded the surface of the modified magnetic Fe₃ O ₄ particles via electrostatic interactions to form FeNP/CpG particles with a small size distribution. The FeNP/CpG particles not only showed enhanced transfection efficiency compared to that of free CpG but also had a great antitumor effect in subcutaneous tumor models of C26 colon cancer, with 94.5% tumor inhibition, and 4T1 breast cancer, with a 64.3% inhibitory rate, though intratumoral injection in vivo. Moreover, FeNP/CpG treatments significantly stimulate an effective antitumor immune response and alter the tumor microenvironment by recruiting a number of immune cells to tumor tissues.

We further discuss possible reasons to account for the enhanced transfection and therapeutic efficiency of FeNP/CpG particles over that of free CpG. First, the developed FeNPs take advantage of characteristics such as their good histocompatibility, superparamagnetism, and a strong positive charge (for the Fe₃ O ₄ particles) to assist in delivering the CpG into the intracellular space, resulting in drug-carrier particles focusing on the tumor site to increase the drug concentrations in the area, reduce the drug loss, and improve drug utilization. Simultaneously, APTES was used to modify Fe₃ O ₄ , providing more CpG binding sites to firmly bind the CpG onto the carrier. FeNPs exerted higher cell viability on 293T, C26, and 4T1 cells in vitro, and there was no remarkable pathological change after FeNP/CpG treatment by intratumoral injection that could avoid the side effects due to CpG entering into circulation by systemic administration. Second, the FeNP load CpG into DCs with a higher transfection efficiency than that of free CpG, increasing opportunities for integration with intracellular TLR9, which is widely expressed in macrophages, NK cells, DCs, and so on. The combination of CpG and TLR9 induces the secretion of local cytokines and chemokines, recruiting and activating immune cells of the innate immune response to stimulate the antitumor immune response; additionally, NK cells and CTLs could kill tumor cells directly or use IFN-γ or granzyme B to kill tumor cells [37, 38]. We suspected that FeNP/CpG may be taken up by the recruited immune cells to trigger the secondary cascade amplification of the immune response. Third, some studies have indicated that CpG can react with tumor cells expressing TLR9, aiming to induce tumor cell autophagy [39]. Autophagy may enhance the sensitivity of tumor cells to the immune response, and the ATP dependent on autophagy could be released extracellularly and used to recruit DCs into the tumor tissue, activating the tumor-specific T cell immune response. This therapy is a form of immunization that uses the in situ tumor as a source of antigen and introduces CpG as an adjuvant to activate an immune response within the tumor. In our study, although the FeNP/CpG was injected without any specific tumor antigen, a cell-specific and systematic immune response could be elicited, and the contralateral tumors appear regressive, as shown in the tumor re-challenge experiment and the two-tumor site model. In addition, being coated with the lysate of tumor cells in a 96-well plate, the ELISA assay showed after FeNP/CpG intratumoral injection in mice that the antitumor antibody titer in the serum appeared to significantly increase. The ELISpot assay suggested that FeNP/CpG treatment, to a great degree, increased the spleen lymphocyte secretion of IFN-γ and IL-4, especially that of IFN-γ , which indicated that the humoral immunity responses and cellular immunity responses were both enhanced by treatment with FeNP/CpG in mice. In addition, immunohistochemistry analyses were performed to study TILs in the tumor microenvironment. Compared to that in the other groups, in the FeNP/CpG group, the number of CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T, and NK cells in the tumors showed a significant increase. Taken together, our study suggested that FeNP/CpG particle intratumoral injection may be a potential tumor immunotherapy strategy.

In recent years, treatment strategies based on nucleic acids have become one of the important areas of tumor treatment. The negative charge of the lipid bilayer of cell membranes makes it difficult for nucleic acid drugs with the same charge to pass through the cell membrane into the cell. Thus, APTES-modified Fe₃ O ₄ as a safe and efficient delivery system is expected to be used for other nucleic acid drugs to contribute to the carrier solution.

Conclusion

In summary, magnetic APTES-modified Fe₃ O ₄ particles (FeNP) were used to deliver CpG adjuvants via intratumoral injection to treat C26 colon carcinoma and 4T1 breast cancer, with enhanced antitumor ability over that of free CpG. The prepared FeNPs showed high stability, low toxicity, and high transfection ability for CpG in vitro and in vivo. Our results demonstrated the potential capacity of FeNP particles in non-viral nucleic acid drug delivery and offered an alternative strategy for CpG immunotherapy.

Abreviações

APTES:

3-Aminopropyltriethoxysilane

BMDC:

Bone marrow-derived dendritic cell

CpG:

Cytosine-phosphate-guanine

CpG-FITC:

FITC-conjugated CpG

FeNP:

3-Aminopropyltriethoxysilane-modified Fe₃ O ₄ nanoparticle

FeNP/CpG:

FeNP-delivered CpG particles

FeNP/CpG-FITC:

FeNP-delivered CpG-FITC particles

GM -CSF :

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

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