Entrega Direcionada de Doxorrubicina Usando Lipossomos Funcionalizados com Aptâmero Anti-EpCAM: Eficácia em Modelos de Carcinoma de Cólon C26

Resumo

Neste estudo, funcionalizamos a superfície de doxorrubicina nanoliposomal pegilada (DOX) com aptâmero anti-EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais) via pós-inserção de DSPE-mPEG₂₀₀₀ conjugado ao aptâmero anti-EpCAM no Caelyx® (ED-lip). Determinamos o tamanho, carga, perfil de liberação, citotoxicidade e captação celular da formulação. A caracterização do ED-lip demonstrou leve aumento no tamanho e no índice de polidispersidade (PDI), junto com diminuição do potencial zeta, indicando que a pós-inserção foi eficiente. Os resultados de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência mostraram que o ED-lip aumentou a taxa de captação celular na linhagem C26 em comparação ao Caelyx®. O ED-lip também apresentou efeitos citotóxicos superiores ao Caelyx®, demonstrando a eficácia do aptâmero anti-EpCAM como ligante de direcionamento. A farmacocinética e biodistribuição tecidual das formulações em camundongos portadores de tumores C26 demonstraram que o ED-lip não alterou o perfil de distribuição da DOX em comparação ao Caelyx® no modelo animal. Além disso, o ED-lip melhorou efetivamente a acumulação tumoral da DOX e promoveu a sobrevivência dos animais em relação ao Caelyx®. Estes resultados sugerem que a funcionalização do Caelyx® com aptâmero anti-EpCAM é promissora no tratamento do câncer e merece investigação adicional.

Introdução

Sistemas nano de entrega de fármacos (NDDSs) com tamanho de 100–200 nm acumulam-se passivamente no microambiente tumoral via efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR). Isso ocorre através do revestimento endotelial frouxo e drenagem linfática deficiente. No entanto, dados recentes indicam que menos de 1% do fármaco administrado atinge o sítio tumoral [1]. A incapacidade de penetrar na matriz extracelular (MEC) densa do tumor, o retorno do fármaco liberado à circulação e a heterogeneidade dos tumores são as razões responsáveis por essa falha [2]. Diferentes estratégias têm sido usadas para melhorar a acumulação tumoral de NDDSs usando estímulos endógenos e exógenos [3]. Esses NDDSs podem responder a estímulos exógenos, como luz, e têm capacidade para uso em imagem tumoral [4]. Existem diversos nanomateriais inorgânicos com capacidade de atuar como agentes anticancerígenos [5, 6]. Contudo, no caso de nanomateriais inorgânicos, deve-se atentar para suas toxicidades e seguranças ambientais [7–11].

A entrega direcionada ativa é uma abordagem importante que ajuda os NDDSs a entregar agentes terapêuticos mais eficientemente aos tumores, minimizando a exposição a tecidos não-alvo [12, 13]. Um agente de direcionamento ideal para entrega direcionada é uma molécula que tenha afinidade a proteínas de superfície celular ou receptores superexpressos por células ou componentes teciduais específicos [14].

A molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) é uma glicoproteína transmembrana considerada candidata a ligante para direcionamento ativo. Descobertas recentes indicam que a EpCAM tem expressão normal baixa em células epiteliais saudáveis, enquanto em células cancerígenas sua expressão torna-se em níveis mais altos (até 1000 vezes) [15–17]. Durante o desenvolvimento do câncer, o padrão de expressão da EpCAM muda da membrana basal e basolateral no epitélio normal para a superfície apical em células epiteliais tumorais [18]. Essa expressão diferencial torna a EpCAM um ligante muito interessante para entrega de fármacos, o que poderia melhorar o índice terapêutico do fármaco [19].

A EpCAM é demonstrada como marcador de célula-tronco cancerígena (CSC) ou célula iniciadora de tumor (TIC), cuja expressão no câncer está relacionada a prognóstico ruim [20]. CSCs ou TICs são células que têm autorrenovação, a capacidade de produzir mais células do mesmo tipo, desempenhando papéis-chave no desenvolvimento tumoral e metástase [21]. A superexpressão da EpCAM foi relatada em CSCs de vários tumores sólidos [22]. Recentemente, aptâmeros atraíram muita atenção em ampla gama de investigações e emergem como moléculas potencialmente poderosas que podem ser usadas em NDDSs como ligantes de direcionamento [23, 24]. Aptâmeros são sequências de oligonucleotídeos baseados em DNA ou RNA que possuem estruturas secundárias e terciárias com afinidade a seus alvos, como receptores de superfície celular [23, 24]. Aptâmeros também têm várias vantagens sobre anticorpos: são não imunogênicos, têm baixo peso molecular (8–25 kDa) com estabilidade química e térmica. Além disso, sua síntese e modificações químicas são de baixo custo e escaláveis [25]. O direcionamento seletivo de NDDSs através de aptâmero anti-EpCAM específico poderia ser considerado uma opção de direcionamento eficaz para entregar agentes quimioterapêuticos ao microambiente tumoral [19, 26]. A esse respeito, diferentes estudos mostraram que nanocarregadores funcionalizados com aptâmero anti-EpCAM poderiam melhorar efetivamente a entrega de fármacos anticancerígenos a células tumorais [15, 27, 28].

O objetivo deste estudo é desenvolver um aptâmero de DNA anti-EpCAM (SYL3C)-nanolipossomos pegilados carregados com doxorrubicina (DOX) (ED-lip) como modelo de NDDS. Tal funcionalização foi realizada por química de acoplamento EDC/NHS entre o grupo amina do aptâmero e o grupo carboxila do DSPE-mPEG₂₀₀₀, que é pós-inserido no lipossomo, como mostrado na Fig. 1. O ED-lip foi caracterizado quanto a tamanho, potencial zeta, porcentagem de encapsulação de doxorrubicina, perfil de liberação e citotoxicidade. Em seguida, avaliamos se esses ED-lips poderiam melhorar a captação celular in vitro e entregar DOX ao tumor via direcionamento em camundongos portadores de tumores de carcinoma de cólon C26.

Entrega Direcionada de Doxorrubicina Usando Lipossomos Funcionalizados com Aptâmero Anti-EpCAM: Eficácia em Modelos de Carcinoma de Cólon C26 — Preparação de Caelyx® funcionalizado com anti-EpCAM (ED-lip). a Ligação do aptâmero anti-EpCAM ao DSPE-mPEG₂₀₀₀ através de ligação covalente das aminas primárias (-NH2) do aptâmero anti-EpCAM ao grupo carboxila (-COOH) do DSPE-mPEG₂₀₀₀. b Método de pós-inserção para preparação de Caelyx® funcionalizado com anti-EpCAM (ED-lip).

Resultados e Discussão

Conjugação do DSPE-mPEG₂₀₀₀ ao Aptâmero

No presente estudo, usamos química de acoplamento EDC/NHS para conjugação de aptâmeros anti-EpCAM funcionalizados com amina ao grupo carboxila ativo do DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH. A vantagem dessa reação de acoplamento usando química EDC/NHS e formação de ligação amida é sua estabilidade e redução de interações inespecíficas entre aptâmeros [30]. Aptâmeros podem ser modificados com grupo amina primária ou tiol e conjugados covalentemente a grupos carboxila ativados ou grupo pirrol de maleimida, respectivamente [31]. Aptâmeros modificados com grupo tiol foram conjugados ao grupo funcional maleimida do DSPE-PEG₂₀₀₀. Então, DSPE-PEG₂₀₀₀-aptâmero foi pós-inserido na estrutura do lipossomo para decorar a superfície externa dos lipossomos [32]. Uma limitação importante com a química maleimida-tiol é que durante o armazenamento o grupo tiol dos aptâmeros pode ser afetado por oxidação, levando à formação de ligação dissulfeto (S-S) entre dois aptâmeros modificados com tiol. Esses aptâmeros diméricos não conseguem participar da reação de conjugação com o grupo funcional maleimida do DSPE-PEG₂₀₀₀ [30]. Portanto, o uso de reações EDC/NHS aumenta o rendimento do produto e melhora o método de pós-inserção.

Aptâmeros têm algumas vantagens sobre anticorpos, incluindo facilidade de síntese e escala, baixa toxicidade sistêmica e falta de imunogenicidade [33]. Aqui, após a conjugação do aptâmero ao lipídeo, o método de pós-inserção foi empregado para fazer Caelyx® decorado com aptâmero anti-EpCAM (ED-lip). Geralmente, a técnica de pós-inserção é um método simples e eficaz para fixação de aptâmeros à superfície de lipossomos e proporciona uma taxa mais alta de incorporação de aptâmeros nos lipossomos [34].

Usamos ensaio de deslocamento de mobilidade em eletroforese em gel para avaliação da pós-inserção do aptâmero anti-EpCAM no lipossomo. Conforme mostrado na Fig. 2, os aptâmeros carregados negativamente migraram no gel e suas bandas foram observadas, enquanto não há banda correspondente para a formulação ED-lip, porque o ED-lip ficou retido na linha do poço e não pôde mover-se através do gel. Esses resultados indicaram que as micelas conjugadas a aptâmeros foram pós-inseridas com sucesso na superfície dos lipossomos.

Caracterização Físico-Química do ED-lip

A caracterização físico-química do Caelyx® e ED-lip foi demonstrada na Tabela 1. O tamanho e a carga das formulações preparadas revelaram que a modificação do Caelyx® com aptâmero anti-EpCAM não teve efeito significativo no tamanho das partículas (p > 0,05). O tamanho lipossomal antes da inserção do aptâmero (Caelyx®) era de cerca de 96 nm com PDI de 0,11; após a pós-inserção (ED-lip), o tamanho dos lipossomos aumentou parcialmente para 117 nm com PDI de 0,14, tamanho desejável para entrega ao tumor. Resultados de estudos anteriores também indicaram que a incorporação de ligantes de direcionamento leva a aumento no tamanho e PDI dos lipossomos [35, 36]. Além disso, o potencial zeta do ED-lip (−19,25) tornou-se mais negativo que o do Caelyx® (−12). Mostrou-se que a conjugação de aptâmero de RNA no lipossomo resultou na diminuição do potencial zeta do lipossomo [37]. O aumento no tamanho e no potencial zeta negativo do ED-lip poderia ser evidência de pós-inserção bem-sucedida de aptâmeros conjugados na superfície do lipossomo [38]. Esses resultados são consistentes com nosso estudo anterior que indicou que a fixação do aptâmero à superfície do Caelyx® leva a leve aumento no tamanho das partículas e potencial zeta mais negativo no Caelyx® funcionalizado com aptâmero [38, 39]. No entanto, a eficácia da pós-inserção deve ser testada em termos de tempo e temperatura de incubação para alcançar lipossomo pós-inserido mais eficiente com melhor tamanho e PDI. A eficiência de encapsulação do Caelyx® e ED-lip foi de 100% (ver Tabela 1).

O número de aptâmeros pós-inseridos na superfície do lipossomo foi determinado conforme descrito [6]. O conteúdo total de fosfolipídeos da formulação lipossomal determinado por ensaio de fosfato foi de 14 mM. Como o número médio de moléculas de lipídeo em lipossomo com tamanho médio de 100 nm é 8×10⁴, o número de lipossomos em cada mililitro é de quase 10¹⁴ [38]. O peso molecular do aptâmero foi g/mol. O número de DSPE-mPEG₂₀₀₀-aptâmero foi determinado baseado em métodos de ensaio de fosfato nos quais mols de moléculas de fosfato correspondem a mols de moléculas conjugadas. Baseado nesses dados, o número de moléculas de aptâmero por cada aliquota de 1 ml de solução é 10¹⁵.

Perfil de Liberação de DOX

A inserção de micelas conjugadas a aptâmero na superfície externa do Caelyx® pode ter afetado o perfil de liberação da DOX. Portanto, avaliamos a liberação de DOX do ED-lip em comparação ao Caelyx® em dextrose 5% com 50% de soro fetal bovino (SFB). Esse meio poderia mimetizar o comportamento de liberação das formulações no plasma [40]. A Figura 3 mostrou que não há diferença significativa na liberação de DOX do Caelyx® e formulações ED-lip durante 24 h de estudo e apenas quantidades desprezíveis de DOX foram liberadas. Isso é consistente com nossos estudos anteriores que indicaram que a inserção de aptâmero na superfície do lipossomo não afetou a estabilidade da membrana e o perfil de liberação da DOX [38, 39]. Isso se deve principalmente à estabilidade da formulação Caelyx® que foi formulada usando método de carregamento remoto impulsionado por gradiente de pH [41].

Interação Celular e Captação Celular por Microscopia de Fluorescência

A interação celular e captação celular das formulações lipossomais foram avaliadas a 4 °C e 37 °C e mostradas na Fig. 4. A avaliação da eficácia de direcionamento do ED-lip indicou que não houve diferenças entre as intensidades fluorescentes médias (MFIs) de células CHO-K1 tratadas com Caelyx® e ED-lip a 4 °C e 37 °C (Fig. 4a, c). No entanto, os dados demonstraram que o ED-lip direcionado teve captação consideravelmente maior por células C26 em comparação ao Caelyx® a 4 °C e 37 °C (Fig. 4b, d), o que foi estatisticamente significativo a 37 °C (p < 0,0001). O ED-lip teve captação significativa em comparação com o Caelyx® (p < 0,001). Esses resultados indicaram que o ED-lip aumentou a especificidade de direcionamento devido ao aptâmero anti-EpCAM ter maior afinidade à linhagem celular C26 em comparação às células CHO-K1. DOX livre passa livremente pela bicamada lipídica e entra na célula, tendo a maior captação celular entre as formulações e, portanto, a maior citotoxicidade. No caso do Caelyx®, a pegilação limita a taxa de endocitose e resulta em citotoxicidade diminuída. No entanto, a presença de aptâmero anti-EpCAM na superfície do lipossomo (ED-lip) aumenta a taxa de internalização da formulação nas células e aumenta sua citotoxicidade comparado ao Caelyx® [38]. Os dados de microscopia de fluorescência demonstraram que a diferença entre a captação celular do ED-lip e DOX livre na linhagem C26 a 37 °C não foi significativa (Fig. 5). No entanto, a escala baseada na intensidade de DOX internalizada representada na Tabela 2 mostra que tanto ED-lip quanto DOX apresentaram diferenças estatisticamente significativas com Caelyx® na captação celular de C26 (p < 0,001). Embora as células C26 expressem baixo nível de EpCAM em sua superfície [42], os dados deste estudo sugeriram que a presença de aptâmero anti-EpCAM poderia aumentar a taxa de internalização dos lipossomos [43].

Estudo de Citotoxicidade

Os efeitos citotóxicos de DOX livre, Caelyx® e formulações ED-lip são indicados na Fig. 6. Diferentes concentrações de formulações foram usadas para tratar células por 1, 3 e 6 h e permitidas incubar por mais 72 h. Os dados demonstraram que todas as formulações têm efeitos nas células de maneira dependente de tempo e dose. A viabilidade de células C26 tratadas com formulação ED-lip diminuiu em comparação com células tratadas com Caelyx®. Como células CHO-K1, como células EpCAM negativas, mostram menor resposta ao ED-lip comparado a células C26, parece que o aptâmero anti-EpCAM aumentou a entrega específica do Caelyx® às células-alvo. Esses resultados poderiam confirmar a captação celular específica do ED-lip por células C26. Esses resultados enfatizaram a importância do uso de entrega de fármacos direcionada com agentes de direcionamento específicos para entrega seletiva do fármaco às células-alvo, reduzindo os efeitos colaterais do fármaco evitando alvos não-específicos [44]. Conforme relatado anteriormente, o direcionamento ativo do Caelyx® com ligantes de direcionamento específicos, como aptâmero e anticorpo, levando a aumento do direcionamento tumoral ativo e entrega específica do fármaco às células-alvo, que por sua vez aumentou a eficácia terapêutica da DOX [35, 39].

Biodistribuição e Farmacocinética

Para avaliar como o aptâmero anti-EpCAM afeta a biodistribuição da DOX, injetamos dose de 10 mg/kg de ED-lip e Caelyx® em camundongos portadores de tumores subcutâneos de câncer de cólon C26. A concentração de DOX no plasma a 3, 12, 24, 48 e 72 h após injeção com Caelyx® e ED-lip é mostrada na Fig. 7. Os resultados mostram que o comportamento das concentrações plasmáticas de DOX em ambos os grupos foi semelhante e não houve diferença significativa entre ambas as formulações. Conforme mostrado na Tabela 3, a conjugação do aptâmero anti-EpCAM à superfície lipossomal diminuiu ligeiramente o tempo de meia-vida de circulação de 39,3 h para 34,2 h e o MRT de 47,6 para 42,9 h (ver Tabela 3). Os parâmetros farmacocinéticos indicaram que a conjugação do aptâmero anti-EpCAM no lipossomo diminuiu ligeiramente t_½ e MRT, o que foi consistente com relatos anteriores demonstrando que a conjugação de aptâmero na superfície lipossomal acelera a depuração dos lipossomos [38]. Adsorção de proteínas e consequente remoção pelo sistema fagocítico mononuclear (SFM) poderia ser a razão da aceleração na depuração sanguínea de nanopartículas conjugadas a ligantes [45].

Conforme mostrado na Fig. 8, as concentrações de DOX nos principais órgãos colhidos em grupos recebendo Caelyx® e ED-lip foram comparadas. O efeito colateral mais importante da DOX livre é a cardiotoxicidade, que o Caelyx® diminui significativamente o risco desse efeito adverso [46]. A biodistribuição do ED-lip no fígado, pulmão e baço é significativamente maior que a do Caelyx® no tempo de 3 h. A presença de vasos sanguíneos permeáveis e aumento no tamanho e PDI do ED-lip após pós-inserção podem ser as razões para maior acumulação do ED-lip nesses tecidos em tempos mais precoces. Mostrou-se que o aumento no tamanho de nanopartículas para 150 nm aumenta a acumulação de nanopartículas no fígado, pulmão e baço [47]. Enquanto isso, os resultados do estudo de biodistribuição mostram claramente o mecanismo EPR na acumulação de nanopartículas no tumor. A Figura 8 mostra claramente que tanto ED-lip quanto Caelyx® acumulam-se gradualmente no sítio tumoral e atingem máximo por volta de 12 h, permanecem em platô até 24 h e então diminuem a 48 e 72 h, gradualmente. É interessante que em todos os pontos de tempo de 3, 12, 24, 48 e 72 h; a acumulação do ED-lip no tumor é significativamente maior que a do Caelyx®, o que poderia ser devido à eficácia do direcionamento ativo com aptâmero anti-EpCAM. Esses resultados indicaram que a fixação de aptâmero na superfície do lipossomo não afetou a distribuição de DOX no rim. Portanto, parece que aptâmeros anti-EpCAM promovem efetivamente a penetração tumoral específica de lipossomos, o que também poderia ser devido à superexpressão de moléculas de EpCAM em células endoteliais vasculares tumorais [48]. Anteriormente, foi indicado que aptâmeros anti-EpCAM poderiam aumentar a penetração tumoral em tumores xenogênicos [49]. CSCs ou TICs também são alvos da terapia anti-EpCAM. A administração de aptâmeros anti-EpCAM como ligante de direcionamento para direcionar EpCAM mostrou efeitos promissores no direcionamento de CSCs [22, 50]. Aqui, poderia ser sugerido que parte do efeito antitumoral eficiente do ED-lip poderia ser devido ao direcionamento bem-sucedido de CSCs.

Atividade Antitumor In Vivo

A eficácia terapêutica do ED-lip foi avaliada em modelo de tumor de carcinoma de cólon C26. Tamanho do tumor, peso corporal e sobrevivência foram monitorados durante quase 2 meses e os resultados são resumidos na Fig. 9 e Tabela 4. Os dados indicam que o ED-lip não tem influência óbvia no peso corporal dos camundongos, assim como o Caelyx® (ver Fig. 9a). Conforme mostrado na Fig. 9b, após injeção intravenosa de Caelyx® e ED-lip, a taxa de crescimento do tumor é eficientemente inibida até o dia 30 pós-injeção, e não há diferença significativa entre os grupos de lipossomos. Após 30 dias pós-injeção, a taxa de crescimento do tumor acelerou, porém a taxa de crescimento nos grupos recebendo fármacos ainda foi mais lenta que o grupo recebendo PBS. A diferença entre o grupo Caelyx® e ED-lip não foi significativa durante 30 dias de pós-injeção. Os resultados de sobrevivência são representados em um gráfico de Kaplan-Meier. A Figura 9c mostra que o ED-lip melhora a curva de sobrevivência comparado com PBS ou Caelyx®. Os principais indicadores do estudo de sobrevivência foram resumidos na Tabela 4. Os tumores em três camundongos do grupo ED-lip foram completamente curados, então o MST para este grupo é indefinido. O tratamento com ED-lip aumentou TTE de 41,1 para 49,7 dias e resultou em atividade antitumoral eficaz com 90,27% de TGD com MST indefinido devido à remoção completa do tumor em três camundongos (ver Tabela 4).

Os dados de tamanho do tumor demonstraram que o ED-lip poderia inibir dramaticamente o crescimento do tumor. Os resultados da análise de sobrevivência mostraram que o tratamento com ED-lip aumentou MST e TTE. O grupo recebendo ED-lip teve maior TGD% e foi mais eficaz comparado com Caelyx®. Nossos achados são consistentes com o alto nível de concentração de DOX no tecido tumoral do grupo tratado com ED-lip. Portanto, lipossomos de DOX conjugados a aptâmero melhoram sua penetração e consequentemente aumentam a acumulação do fármaco no sítio tumoral, o que por sua vez leva a aumento na eficácia do Caelyx® e maior TGD% nos dados de sobrevivência. Em conjunto, esses achados indicam que aptâmeros anti-EpCAM poderiam servir como agentes de direcionamento importantes para entrega de fármacos.

Conclusão

Aqui, funcionalizamos a superfície do Caelyx® com aptâmero anti-EpCAM (SYLC3) via pós-inserção (ED-lip). A citometria de fluxo e microscopia de fluorescência mostraram alto nível de captação de DOX em células C26, indicando que o aptâmero poderia aumentar a taxa de internalização do ED-lip. Os dados farmacocinéticos indicaram que a pós-inserção de DSPE-mPEG-EpCAM não alterou a farmacocinética da DOX comparada ao Caelyx®. No entanto, a biodistribuição tecidual mostrou maior acumulação tumoral do ED-lip em comparação com Caelyx® mesmo após 72 h pós-injeção. Demonstramos que o ED-lip teve efeitos terapêuticos melhorados em camundongos portadores de tumores C26. Os parâmetros de sobrevivência melhorados em camundongos tratados com ED-lip sugerem que o lipossomo de DOX direcionado à EpCAM é um carreador de entrega de fármacos promissor para o tratamento de cânceres e merece investigação adicional.

Materiais e Métodos

Materiais

O aptâmero de DNA anti-EpCAM 5′-Amina (sequência 5′ -CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′) (SYL3C) foi comprado da BIONEER (empresa de biotecnologia, Daejeon, Coreia do Sul). DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH foi comprado da Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Dowex®, 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-Hidroxissuccinimida (NHS), penicilina estreptomicina e Fluoroshield™ com DAPI foram comprados da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Caelyx® comercialmente disponível foi comprado da Behestan Darou Company (Teerã, Irã).

Conjugação do DSPE-mPEG₂₀₀₀ ao Aptâmero

O aptâmero anti-EpCAM foi ligado ao DSPE-mPEG₂₀₀₀ através de ligação covalente das aminas primárias (-NH2) do aptâmero anti-EpCAM ao grupo carboxila (–COOH) do DSPE-mPEG₂₀₀₀ (Fig. 1). A conjugação foi realizada via química de acoplamento EDC/NHS [51]. Brevemente, DSPE-mPEG₂₀₀₀ foi disperso em tampão 2-(N-morfolino)etano-sulfônico (MES) (pH 6,5) e EDC/NHS 400 mM EDC e 100 mM NHS foram adicionados à dispersão. A dispersão foi deixada em agitação por 15 min para ativar os grupos carboxila do lipídeo. Então, o aptâmero anti-EpCAM foi adicionado à dispersão e agitado por mais 2 h em temperatura ambiente no escuro. A razão molar de lipídeo:aptâmero anti-EpCAM foi 1:1 e a razão molar de EDC/NHS foi 10 vezes a do lipídeo.

Modificação do Caelyx® com DSPE-mPEG-Aptâmero Anti-EpCAM

O ED-lip foi sintetizado pelo método de pós-inserção. Para realizar a pós-inserção, micelas de DSPE-mPEG-aptâmero anti-EpCAM foram adicionadas a 1 ml de Caelyx® por 30 min a 60 °C. As quantidades de DSPE-mPEG-aptâmero anti-EpCAM foram determinadas de acordo com ensaio de fosfato de Bartlett [52]. Baseado no número aproximado de lipossomos por mililitro de Caelyx® que é cerca de 10¹⁴, o volume de DSPE-mPEG-aptâmero anti-EpCAM foi ajustado para atingir 10 aptâmeros por cada lipossomo [36]. Eletroforese em gel de agarose foi usada para confirmar a pós-inserção [39].

Caracterização Físico-Química

Tamanho de partícula, índice de polidispersidade (PDI) e carga de superfície foram determinados por instrumento de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) (Nano-ZS; Malvern, UK). Para remover DOX livre, lipossomos foram misturados com resina Dowex® e rotacionados por 60 min e passados por colunas Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories Inc.) para remover a Dowex® [53]. As quantidades de DOX nas formulações lipossomais foram determinadas usando espectrofotômetro de fluorescência LS-45 (Perkin-Elmer, UK), (excitação: emissão 485:590 nm).

Estudo de Liberação

Para avaliar a liberação de DOX, 1 ml de formulação foi adicionado a 9 ml de dextrose (com 50% soro fetal bovino (SFB)) e em intervalos de tempo determinados (0, 1, 2, 4, 6, 12 e 24 h), amostras foram coletadas. Após remover DOX livre com resina Dowex®, as quantidades de fármaco remanescentes nos lipossomos foram determinadas por espectrofotômetro de fluorescência e a porcentagem de liberação foi calculada [39].

Cultura Celular

Linhagens de carcinoma de cólon C26 e ovário de hamster chinês (CHO-K1) foram compradas do Instituto Pasteur do Irã. As linhagens foram cultivadas em meio RPMI1640 suplementado com 10% de SFB obtido da Gibco (Thermos Fisher Scientific, EUA) e 100 UI/ml penicilina, e 100 mg/ml estreptomicina. As células foram incubadas a 37 °C com 5% CO₂ e 95% atmosfera umidificada.

Ensaio de Interação Celular e Captação Celular

Interação celular e captação celular de formulações foram avaliadas a 4 °C e 37 °C, respectivamente. Duas linhagens celulares, CHO-K1 e C26, foram selecionadas neste teste. As células foram semeadas em cada poço de placas de 12 poços (2,5 × 10⁵ por poço). Após incubação noturna a 37 °C, tratamentos foram adicionados às células e placas foram colocadas a 4 °C e 37 °C e incubadas por mais 3 h. Então as células foram lavadas com PBS, e tripsinizadas. A intensidade de fluorescência para DOX foi determinada usando citometria de fluxo (citômetro BD FACSCalibur). Os dados foram analisados com software FlowJo versão 7.0.

Avaliação por Microscopia de Fluorescência

O número de 1 × 10⁶ células por poço de células C26 foram semeadas em placas de 6 poços nas quais lâminas de cobertura microscópicas estéreis já estavam inseridas. Após incubação noturna a 37 °C e 5% umidade, as células foram tratadas com DOX livre, Caelyx® e ED-lip por 24 h para captação celular completa [54]. Então as células foram lavadas com PBS e fixadas com formaldeído 4%. Lâminas de cobertura foram coradas com Fluoroshield™ com DAPI e montadas em lâminas de vidro. Tratamentos foram realizados em triplicata. De cada lâmina, seis zonas foram selecionadas sob campo de ampliação × 200. A fluorescência intrínseca de DOX foi usada para avaliação da captação celular do fármaco. A escala foi realizada baseada nas porcentagens de células que mostraram captação celular de DOX em cada campo microscópico:

1: 0–20%, 2: 20–40%, 3: 40–60%, 4: 60–80%, e 5: 80–100%

Avaliação de Citotoxicidade

Os valores de IC50 de DOX livre, Caelyx® e ED-lip foram determinados por ensaio MTT. Para fazer isso, células CHO-K1 e C26 foram semeadas na densidade de 5 × 10³ células por poço em placas de 96 poços a 37 °C. Após incubação noturna, formulações lipossomais e solução de DOX livre foram diluídas seriamente em meio livre de SFB e adicionadas às culturas celulares e incubadas 1, 3 e 6 h a 37 °C. Então, as células foram lavadas e permitidas incubar 72 h. As densidades ópticas (DOs) foram medidas usando absorbância espectrométrica de 570 nm contra fundo de 630 nm no leitor de microplacas Stat-Fax 2100 (Awareness Technology Inc. EUA). Então os valores de IC50 foram calculados.

Estudo Animal

Camundongas fêmeas BALB/c (4–6 semanas, 18–20 g) foram mantidas em gaiolas separadas a 22 ± 2 °C e mantidas em dieta padrão de ração e água ad libitum. Injeção intraperitoneal (i.p) de cetamina e xilazina (100 mg/kg cetamina e 10 mg/kg xilazina) usada para anestesiar os animais [55]. O número de 3 × 10⁵ células C26 por camundongo em 60 μl PBS injetado no flanco direito, subcutaneamente. Duas semanas após inoculação quando os tamanhos dos tumores cresceram cerca de 5 mm³, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos (n = 3 para biodistribuição e n = 5 para estudo antitumoral camundongos por grupo). Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade de Ciências Médicas de Mashhad e foram realizados de acordo com as regras internacionais considerando os direitos dos animais.

Estudos de Biodistribuição e Farmacocinética

Quatorze dias após inoculação do tumor, os camundongos foram tratados com dose de 10 mg/kg de Caelyx® e ED-lip intravenosamente (i.v.) via veia da cauda. Grupo controle recebeu 200 μl solução PBS. Em intervalos de tempo determinados (3, 12, 24, 48 e 72 h) pós-injeção, os camundongos foram eutanasiados e amostras de sangue e amostras de tecido (fígado, baço, rim, pulmão, coração e tumor) foram coletadas. Então, a concentração de doxorrubicina em cada amostra foi medida baseada na intensidade fluorescente de cada amostra usando espectrofotômetro de fluorescência LS-45 (Perkin-Elmer, UK). A concentração de doxorrubicina de cada amostra foi medida e análise não-compartimental dos parâmetros farmacocinéticos foram calculados a partir dos perfis de concentração sanguínea vs. tempo. Então os parâmetros incluindo área sob a curva concentração-tempo (AUC) e área sob a curva do primeiro momento (AUMC), meia-vida (t_1/2), volume de distribuição (V_d), C_max, T_max, tempo médio de residência (MRT) e depuração (Cl) foram calculados.

Atividade Antitumor In Vivo

Para avaliar atividade antitumoral, 10 dias após inoculação do tumor, camundongos com tamanho de tumor palpável receberam dose única i.v. de 10 mg/kg Caelyx® e ED-lip. PBS injetado em camundongos considerados como controle negativo. Os parâmetros incluindo tempo para atingir o ponto final (TTE), porcentagem de atraso no crescimento do tumor (TGD), tempo médio de sobrevivência (MST) e sobrevivência foram determinados. Durante o estudo, os camundongos foram observados para saúde e mudanças de peso corporal. O volume do tumor também foi medido usando paquímetro digital e calculado da seguinte forma:

$$ \mathrm{Volume}\ \mathrm{Tumor}=(\mathrm{Altura}\times \mathrm{Comprimento}\times \mathrm{Largura})\times 0.52 $$

Considerando aspectos éticos, os camundongos foram removidos caso o crescimento do tumor fosse > 1000 mm³, ou > 20% perda de peso ou sinais de fraqueza fossem observados.

Análise Estatística

Dados foram analisados usando GraphPad Prism 6.0 (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, EUA). Dados foram demonstrados como média ± SEM de pelo menos três experimentos independentes. O teste t foi usado para avaliar os resultados do estudo de liberação, citometria de fluxo e biodistribuição das formulações. ANOVA foi empregada para avaliar os resultados de microscopia de fluorescência e volumes tumorais. O método de Kaplan-Meier foi usado para calcular os parâmetros de sobrevivência incluindo TTE, MST e TGD%. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.