Nanosensibilizador magnético modificado por aptâmero para imagens de ressonância magnética in vivo de câncer que expressa HER2

Resumo

O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de um receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) -agente de contraste alvejado para ressonância magnética (MRI) com uma alta sensibilidade magnética. Um nanossensibilizador magnético modificado por aptâmero anti-HER2 (Apt _HER2 -MNS) foi preparado por conjugação com aptâmeros modificados com 5'-tiol e nanocristais magnéticos maleimidilados (MNCs). As características físico-químicas e capacidade de direcionamento do Apt _HER2 -MNS foram confirmados, e a afinidade de ligação ( K _d ) na proteína HER2 do Apt _HER2 -MNS foi de 0,57 ± 0,26 nM. A capacidade de aumento de contraste de ressonância magnética in vivo também foi verificada em modelos de células cancerosas HER2 + (NIH3T6.7) -xenoenxerto ( n =3) no instrumento de ressonância magnética clínica 3T. O experimento de controle foi realizado usando MNCs não marcados. Os resultados indicaram que até 150% de aumento de contraste foi alcançado na região do tumor nas imagens de RM ponderadas em T2 após a injeção do Apt _HER2 -MNS agente em camundongos que receberam as células NIH3T6.7.

Histórico

O receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), que pertence à família do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), desempenha um papel fundamental nas doenças malignas humanas e é superexpresso em aproximadamente 30% dos cânceres de mama humanos [1] e em muitos outros tipos de câncer , incluindo carcinomas de estômago, bexiga, ovário e pulmão [1,2,3,4]. Pacientes com câncer de mama com superexpressão de HER2 tendem a ter taxas de sobrevida substancialmente mais baixas do que pacientes com câncer de mama sem superexpressão de HER2 [5]. Além disso, a superexpressão de HER2 leva ao aumento da metástase do câncer de mama [6,7,8]. Por esse motivo, o HER2 atua como um biomarcador importante no diagnóstico do câncer. No cenário clínico, o HER2 é usado como um marcador biológico típico, junto com o receptor de estrogênio (ER) e o receptor de progesterona (PR), para diagnosticar o câncer de mama. Assim, pacientes com câncer de mama recebem um diagnóstico definitivo após verificação histológica dos níveis de expressão de HER2, ER e PR. No entanto, a verificação histológica é invasiva e realizada apenas em um número limitado de lesões. Por esta razão, várias pesquisas foram conduzidas para visualizar os marcadores diagnósticos de forma não invasiva por meio de exame radiológico antes da verificação histológica com base em tomografia computadorizada [9, 10], tomografia por emissão de pósitrons [11,12,13], tomografia computadorizada por emissão de fóton único [14,15,16], imagem por ressonância magnética (MRI) [17,18,19,20] e ferramentas de imagem multimodal [21,22,23].

Nanopartículas de óxido de ferro (IONPs) são usadas em vários exames radiológicos não invasivos para a observação de biomarcadores clinicamente relevantes [24, 25]. IONPs são compatíveis com imagens moleculares porque têm uma sensibilidade magnética ou biocompatibilidade mais alta do que outros agentes de contraste de IRM baseados em metais pesados, como agentes de contraste à base de gadolínio (GBCAs) ou agentes de contraste contendo níquel ou cobalto. Em particular, embora os agentes de contraste de MRI comercializados e GBCAs estejam associados a problemas relacionados à toxicidade in vivo devido à liberação de Gd ³⁺ íons, os agentes de contraste de IRM baseados em IONP têm maior segurança in vivo do que os GBCAs porque podem ser degradados em ferro, absorvidos ou eliminados [26, 27].

Para aplicar IONPs para imagens moleculares, as porções de direcionamento são extremamente importantes e podem ser produtos químicos, carboidratos, proteínas, anticorpos ou aptâmeros [25, 28, 29]. Entre essas moléculas, os aptâmeros têm uma estrutura tridimensional estável de um ácido nucleico de fita simples, que tem alta afinidade de ligação e especificidade em moléculas específicas. A alta afinidade de ligação dos aptâmeros é causada por sua técnica de desenvolvimento e evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) [30]. SELEX está usando bibliotecas muito grandes de oligonucleotídeos de sequência aleatória (~ 10 ¹⁵ ) pode ser fornecido por síntese química e rastreado em paralelo para encontrar aptâmeros que têm alta afinidade de ligação na molécula alvo. Como resultado do SELEX, aptâmeros podem ser desenvolvidos com alta afinidade de ligação do nível de concentração picomolar, geralmente, enquanto o de outras biomoléculas varia de micromole a subnanomole [31, 32]. No caso dos aptâmeros de terceira geração recentemente desenvolvidos, eles também têm estabilidade in vitro e in vivo devido à sua resistência melhorada contra DNase ou RNase usando ácidos nucléicos modificados [33, 34]. Por essas razões, aptâmeros estão emergindo como as metades preferidas na pesquisa de imagem molecular [35].

O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de um agente de contraste T2 modificado por aptâmero baseado em nanocristais magnéticos (MNCs) com uma alta especificidade para células cancerosas que superexpressam HER2. Para atingir este objetivo, as MNCs, que possuem alta sensibilidade magnética, foram preparadas por um método de decomposição térmica e um aptâmero específico de HER2 ( K _d =0,42 nM). Os agentes de contraste sintetizados foram caracterizados pela análise da morfologia, propriedade de magnetização e relaxividade magnética. Além disso, realizamos ensaios de direcionamento in vitro e in vivo contra proteínas HER2 em um modelo animal de xenoenxerto de tumor implantado com uma linha de células cancerosas que expressam HER2, respectivamente.

Métodos

Materiais

TWEEN® 80 (T80), 4- (dimetilamino) piridina, N , N ′-Diciclohexilcarbodiimida, trietilamina, diclorometano anidro, acetilacetonato de ferro (III), 1,2-hexadecanodiol, ácido dodecanóico, dodecilamina e éter benzílico foram adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA), e o ácido 3-maleimidopropiônico (MPA) foi adquirido TCI América (EUA). Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640), meio de Eagle modificado por Dulbecco, soro bovino fetal e solução antibiótico-antimicótica Gibco® foram adquiridos da Life Technologies (EUA). O NIH3T6.7 foi adquirido na American Tissue Type Culture (EUA). Água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) foi adquirida na Biosesang Inc. (Coréia). O aptâmero anti-HER2 tiolado [Apt _HER2 , sequência:5′-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3 ′ (6:NapdU), modificação 5′-SH, 40-mer] foi adquirido da Aptamer Science Inc. (Coréia).

Síntese de MNCs

As nanopartículas de óxido de ferro magnético monodispersas foram sintetizadas usando o método de decomposição térmica de Sun [36]. Essas nanopartículas magnéticas são chamadas de MNCs devido aos seus precursores de acetilacetonato de ferro (III) e ácido oleico. Resumidamente, uma mistura de acetilacetonato de ferro (III) (2 mmol), ácido oleico (6 mmol), 1-octadeceno (6 mmol), 1,2-hexadecanodiol (10 mmol) e éter benzílico (20 mL) foi carregada em um frasco de fundo redondo de três gargalos e agitado mecanicamente. Para remover moléculas de oxigênio residuais e água, a mistura foi pré-aquecida a 100 ° C por 30 min. A mistura pré-aquecida foi então aquecida a 200 ° C durante 2 h e refluxada a 300 ° C durante 30 min sob um fluxo de nitrogênio. Após os reagentes serem resfriados à temperatura ambiente removendo a fonte de calor, os reagentes foram purificados com excesso de álcool etílico. A centrifugação foi realizada em triplicado para separar o produto de qualquer resíduo não disperso. The Fe ₃ O ₄ os produtos das nanopartículas foram então redispersos em 5 mL de hexano. O produto final foi sintetizado repetindo o procedimento descrito acima com 100 mg Fe ₃ O ₄ e seus precursores. As morfologias MNC foram avaliadas usando um microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Japão). A saturação da magnetização foi avaliada em um magnetômetro de amostra vibratória (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, EUA) em temperatura ambiente. A quantidade de MNCs no produto foi analisada medindo o peso usando um analisador termogravimétrico (SDT-Q600, TA Instrument), e os MNCs foram lavados até o conteúdo de Fe ₃ O ₄ atingiu aproximadamente 80%.

Síntese de Maleimidyl-TWEEN ^® 80

Para a preparação de maleimidil T80 (Tm80), 15,3 mmol MPA e 22,9 mmol N , N ′ -Diciclohexilcarbodiimida foram dissolvidos em 10 mL de diclorometano, respectivamente, e subsequentemente misturados. A mistura foi então adicionada a 20 mL de diclorometano contendo 7,6 mmol de T80, seguido pela adição de 3,2 mL de trietilamina à mistura. Finalmente, 22,9 mmol de 4- (dimetilamino) piridina foi dissolvido em 10 mL de diclorometano, e todos os reagentes foram misturados em um frasco de 70 mL. A mistura final foi agitada usando um ímã por 48 h. A cor da mistura mudou de damasco para vinho tinto. Depois de reagir durante 48 h, a ureia cristalizada foi removida por filtração. Para a eliminação do diclorometano, a reação foi filtrada por evaporação em evaporador rotativo (N-1100, EYELA, Japão). O produto resultante foi suspenso em água desionizada e os reagentes não conjugados foram removidos por diálise (Spectra / Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., EUA). O produto final foi preparado por liofilização. O Tm80 sintetizado foi confirmado por comparação com MPA e T80 usando um espectrômetro UV-vis (UV-1800, Shimadzu, Japão), espectrômetro infravermelho de transformada de Fourier (FT-IR) (PerkinElmer, espectro dois) e ¹ Espectrômetro de ressonância magnética nuclear H (NMR) (Bruker Biospin, Advance II, consulte o arquivo adicional 1:Figura S1).

Preparação de MNCs Maleimidyl

MNCs maleimidil dispersáveis em água (mWMNCs) foram preparados usando o método de nanoemulsão [37]. Resumidamente, 100 mg de Tm80 foi totalmente dissolvido em 20 mL de água desionizada e 4 mL de n-hexano contendo 20 mg de MNCs foi rapidamente injetado em água dissolvida de Tm80 com ultrassonicação (190 W) e agitação (1200 rpm). O processo de emulsão continuou por 10 min com banho resfriado em gelo. O solvente orgânico remanescente foi evaporado por 12 h em temperatura ambiente, e os produtos foram purificados por diálise (Spectra / Por®, 3,5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., EUA) para remover o excesso de surfactante por 3 dias. Os mWMNCs foram então concentrados usando um filtro centrífugo (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Alemanha) para 1,25 mg _Fe / mL em água tratada com DEPC. As MNCs com envelope T80 (WMNCs) também foram preparadas usando o mesmo método.

Preparação do Apt _HER2 -MNS

Antes da conjugação entre mWMNCs e aptâmeros anti-HER2, a etapa de redução de aptâmeros modificados com tiol foi realizada. Resumidamente, aptâmero de 1 nmol foi dissolvido em 0,3 mL de água desionizada e acetato de trietilamina e solução de 1,4-ditiltretol foram adicionados em que a concentração final foi de 50 e 25 mM, respectivamente. Esta mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 h, e foi purificada e dessalinizada por precipitação com etanol. Para preparar o Apt _HER2 -MNS, sonda de MRI específica de HER2, o peso molecular de MNCs foi calculado teoricamente (consulte o arquivo adicional 1:Figura S2) e a proporção de mistura de mWMNCs e aptâmero foi designada como 1:7. Portanto, 100 μg (Fe) mWMNCs (como Fe ₃ O ₄ , 45 pmol) foi dissolvido em PBS (1 mL) e 5 μg (0,35 nmol) de aptâmero foram adicionados. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5 min e incubada a 4 ° C durante 2 h. A distribuição do diâmetro hidrodinâmico do Apt _HER2 -MNS foi então analisado usando um analisador de espalhamento de laser dinâmico (ELS-Z, Otsuka Electronics, Japão). Para confirmar a capacidade do Apt _HER2 -MNS como um agente de contraste de IRM, a análise de relaxividade T2 (R2) foi realizada com um instrumento de IRM clínico de 1,5 T com uma bobina de superfície micro-47 (Intera, Philips Medical System, Holanda) usando vários fantomas concentrados de Apt _HER2 -MNS. O R2 do Apt _HER2 -MNS foi medido usando a sequência Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) à temperatura ambiente:TR =10 s, 32 ecos com espaço de eco par de 12 ms, número de aquisições =1, resolução de ponto =156 μm × 156 μm, e espessura da seção =0,6 mm. O R2 foi definido como 1 / T2 com s ⁻¹ unidades.

Apt _HER2 - Ensaio de afinidade de ligação MNS

Para a validação da especificidade de HER2 do Apt _HER2 -MNS, o método de ligação de filtro de nitrocelulose foi usado [38]. O Apt nu _HER2 e Apt _HER2 -MNS foram desfosforilados usando fosfatase alcalina (New England Biolabs, MA, EUA). A extremidade 5 ′ ou 3 ′ dos aptâmeros foi marcada por T4 polinucleotídeo quinase e [³² P] -ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, EUA) [39]. Os ensaios de ligação foram conduzidos incubando o ³² Aptâmeros marcados com P a uma concentração de 10 pM com a proteína HER2 em concentrações que variam de 100 a 10 pM em tampão de seleção (Tris · HCl 20 mM, pH 7,5 a 4 ° C, NaCl 6 mM, 2-mercaptoetanol 5 mM, 1 mM Na ₃ EDTA, 10% v / v glicerol) a 37 ° C durante 30 min. A mistura de ³² Aptâmeros marcados com P e a proteína HER2 foram filtrados por coluna G-50 (GE Heathcare Life Science, UK) para remover radioisótopos livres. As misturas filtradas foram desenvolvidas no filme reutilizável e as frações dos aptâmeros ligados à proteína HER2 foram quantificadas usando um phosphorimager (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Tóquio, Japão). Para eliminar o efeito da ligação de fundo inespecífica do aptâmero radiomarcado ao filtro de nitrocelulose, os dados brutos de ligação foram corrigidos conduzindo o experimento usando ³² Aptâmeros marcados com P apenas.

Ressonância magnética in vivo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos sob a aprovação da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. As varreduras de ressonância magnética in vivo foram conduzidas usando um modelo de tumor singênico de camundongo, que foi gerado pela implantação de células NIH3T6.7 (1,0 × 10 ⁷ células) nas coxas de camundongos nus BALB / c fêmeas com 5 semanas de idade. Após 2 semanas, o tamanho do tumor foi avaliado por ressonância magnética. Quando o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 500 mm ³ , 100 μg (5 mg / kg) Apt _HER2 -MNS foi injetado na veia da cauda. Os experimentos de ressonância magnética in vivo foram realizados usando um instrumento clínico de ressonância magnética de 3,0 T e uma bobina de pulso humano de 8 canais. Para a ressonância magnética ponderada em T2 em 3,0 T, os seguintes parâmetros foram adotados:TR / TE =1054/70 ms, número de aquisições =2, resolução do ponto =400 × 319 mm e espessura do corte =1 mm Fator TSE =8. O experimentos de controle foram realizados usando WMNCs com o mesmo método. Todas as intensidades de sinal T2 foram calculadas calculando a média de aproximadamente cinco regiões de interesse (ROIs) desenhadas nas imagens de ressonância magnética ponderadas em T2 de cada modelo de camundongo ( n =3), e o valor de R2 (ou R2 *), valor inverso de T2, foi usado na análise da intensidade do sinal. As mudanças ao longo do tempo da intensidade do sinal relativo foram normalizadas pela intensidade do sinal inicial (pré-injeção). A análise do histograma também foi realizada na intensidade do sinal R2 do voxel em ROI.

Análise histológica

A coloração com azul da Prússia, pode ser usada para detectar íons Fe em tecidos tumorais, foi realizada para confirmar o Apt _HER2 -MNS direcionamento de câncer que expressa HER2 após a colheita de tecido tumoral de cada modelo de tumor após a ressonância magnética in vivo. Os tecidos tumorais colhidos foram fixados em solução de formalina a 10% por 24 he incluídos em parafina após desidratação em concentrações crescentes de etanol e clarificação em Histo-Clear® (National Diagnotics, EUA). A coloração com azul da Prússia foi conduzida pela montagem das fatias de tecido (espessura =5 μm) em lâminas de vidro, seguido de desparafinação e hidratação com Histo-Clear® e etanóis concentrados, respectivamente. Em seguida, as lâminas foram colocadas na solução de trabalho de azul da Prússia (ferrocianeto de potássio 10% e solução de ácido clorídrico 20% =1:1) por 1 h. Os núcleos foram corados pela coloração Nuclear Fast Red (Sigma Aldrich, EUA). Depois de lavar as amostras de tecido três vezes por 30 min, adicionamos 2–3 gotas da solução de montagem às lâminas e cobrimos as lâminas com lamínulas. As seções de tecido coradas foram observadas usando um software Olympus BX51 e Olyvia (Olympus, Japão).

Resultados e discussão

Apt _HER2 -MNS foi projetado como um agente de direcionamento de molécula única com base em IONPs para a imagem molecular de tumores que expressam HER2 usando MRI. Portanto, Apt _HER2 -MNS precisava ter uma alta especificidade para a molécula alvo e uma grande suscetibilidade magnética. Para obter uma alta sensibilidade magnética em primeiro lugar, os MNCs monodispersam Fe ₃ O ₄ nanopartículas, foram sintetizadas usando o método de decomposição térmica e crescimento de sementes [36]. Procedimento experimental de preparação e aplicação in vivo do Apt _HER2 -MNS foi descrito na Fig. 1. Em primeiro lugar, o tamanho e a forma das MNCs foram confirmados por HR-TEM (Fig. 2a, b). Na Fig. 2c, o tamanho médio das MNCs foi medido pela seleção aleatória de 130 MNCs da imagem TEM, e uma distribuição de tamanho muito estreita (10,49 ± 1,74 nm) e forma esférica foram observadas. A propriedade superparamagnética dos MNCs também foi avaliada por VSM, que rendeu um valor de magnetização de saturação de MNC de 98,8 emu / g _Fe (Fig. 2d). O agente de contraste T2, que estava atualmente disponível por injeção intravenosa, era baseado em óxidos de ferro superparamagnéticos (SPIO) ou óxidos de ferro superparamagnéticos ultra-pequenos (USPIO) [40]. SPIO ou USPIO também têm propriedades superparamagnéticas, mas têm um valor de magnetização de saturação inferior a 70 emu / g _Fe [40,41,42,43]. A propriedade superparamagnética é necessária para usar IONPs como um agente de contraste intravenoso porque faz com que os IONPs tenham uma propriedade magnética apenas quando eles estavam no campo magnético e impede que os IONPs se agregem. Além disso, o valor de magnetização de saturação mais alto de MNCs pode ser útil para reduzir a dose de injeção do que os agentes de contraste baseados em SPIO ou USPIO.

Ilustração esquemática que mostra o procedimento experimental para a preparação de nanossensibilizador magnético modificado por aptâmero (Apt _HER2 -MNS) e sua avaliação de capacidade de imagem in vivo

O resultado da caracterização morfológica e magnética de MNCs. a Imagem TEM. b Imagem TEM ampliada. c Medição da distribuição do tamanho da imagem TEM (contagem total 100). d Gráfico de magnetização

A fim de usar MNCs para experimentos in vivo, WMNCs e mWMNCs foram preparados por um método de nanoemulsão usando T80 ou Tm80, respectivamente. As características físico-químicas do Tm80 preparado e seus precursores, MPA e T80, foram confirmadas por absorvância, FT-IR, ¹ Análise espectral de H-NMR (ver arquivo adicional 1:Figura S1). Conforme publicado anteriormente [44], os mWMNCs preparados pelo método de nanoemulsão usando Tm80 são dispersos de forma estável em água. Além disso, os grupos maleimidil de mWMNCs podem ser facilmente conjugados com uma molécula que tem grupos tiol de pH neutro e esta conjugação não gera quaisquer produtos colaterais. Além disso, o aptâmero modificado com NapdU foi usado para aumentar a meia-vida in vivo, e sua meia-vida foi de 151 h em soro humano (ver arquivo adicional 1:Figura S3). Apt _HER2 -MNS foi preparado por conjugação entre mWMNCs e Apt _HER2 -SH, e as propriedades hidrodinâmicas do Apt _HER2 -MNS foram avaliados usando espalhamento de laser dinâmico e análise de relaxividade MR (Fig. 3). Os diâmetros de WMNCs e Apt _HER2 -MNS foram 28,8 ± 7,2 e 34,1 ± 8,2 nm, respectivamente (Fig. 3a). Porque o Apt _HER2 consistia em oligonucleotídeos de 40-meros e tinha aproximadamente 5-10 nm de comprimento, a presença de Apt _HER2 pode causar a diferença do diâmetro hidrodinâmico. A relaxividade de WMNCs e Apt _HER2 -MNS era 265,7 e 257,2 mM ⁻¹ _Fe s ⁻¹ , respectivamente (Fig. 3b), que foi avaliada para confirmar sua sensibilidade magnética como um agente de contraste de ressonância magnética. No caso dos contrastes T2 baseados em SPIO ou USPIO, aprovados pela FDA, foram quase sintetizados pelo método de co-precipitação. Por esta razão, sua cristalinidade foi diminuída, o que causou uma baixa relaxividade (abaixo de 190 mM ⁻¹ _Fe s ⁻¹ ) sob o campo magnético [40]. Ao usar MNCs neste estudo, Apt _HER2 -MNS tinha relaxividade magnética aumentada de 35 ~ 500% do que agentes de contraste T2 baseados em SPIO ou USPIO.

A caracterização de WMNCs e Apt _HER2 -MNS para uso como agente de contraste de IRM in vivo. a diâmetro hidrodinâmico ( n =5, WMNCs 28,8 ± 7,2 nm, Apt _HER2 -MNS 34,1 ± 8,2 nm). b Gráfico de análise de relaxividade ( n =3, WMNCs R ² =265,7 mM ⁻¹ s ⁻¹ , R ² =0,99 e Apt _HER2 -MNS R ² =257,2 mM ⁻¹ s ⁻¹ , R ² =0,99)

A afinidade de ligação do Apt _HER2 -MNS para a proteína HER2 foi avaliada usando um ensaio de ligação de filtro (Fig. 4a), e o K resultante _d valores de Apt _HER2 -SH e Apt _HER2 -MNS foram medidos como 26,88 ± 8,24 e 0,57 ± 0,26 nM, respectivamente (Fig. 4b, c). Apt _HER2 -OH tem uma especificidade muito alta para proteínas HER2 com um K _d valor de 0,42 ± 0,05 nM, e esta afinidade de ligação é aproximadamente 10 vezes maior do que 5 nM de Herceptin® [45]. No entanto, a afinidade de ligação do Apt _HER2 nu pode ser alterado por conjugação com os produtos químicos, moléculas ou nanopartículas. Portanto, a afinidade de ligação do Apt _HER2 para proteínas HER2 deve ser avaliada após a conjugação com mWMNCs. A afinidade de ligação do Apt _HER2 -SH para HER2 foi reduzido pela presença de um grupo tiol em vez do Apt _HER2 nu porque o grupo tiol pode ser ligado a outro resíduo de tiol em proteínas ou outros aptâmeros modificados com tiol. No entanto, a afinidade de ligação do Apt _HER2 -MNS foi medido como semelhante ao do Apt _HER2 , este resultado significa que também não há Apt _HER2 não ligado o suficiente -SH, que pode interromper a interação entre o aptâmero e a proteína HER2, nem os mWMNCs têm nenhuma ou muito poucas influências na afinidade de ligação dos aptâmeros.

Dados de afinidade de ligação do aptâmero anti-HER2 (Apt _HER2 -OH) aptâmero anti-HER2 tiolado (Apt _HER2 -SH) e Apt _HER2 -MNS em proteínas HER2 medindo o ensaio de ligação ao filtro. a A ilustração esquemática que mostra o processo de ensaio de ligação de filtro de aptâmeros. b O gráfico de aptâmero ligado à fração em relação à concentração de HER2. c O K _d gráfico de valor do Apt _HER2 -OH (0,42 ± 0,05 nM, R ² =0,99, p <0,0001), Apt _HER2 -SH (26,88 ± 8,24 nM, R ² =0,98, p <0,0001), e Apt _HER2 -MNS (0,57 ± 0,26 nM, R ² =0,91, p =0,001) calculado a partir de b . Barras de erro foram representadas por y positivo -eixo apenas

Os experimentos de ressonância magnética in vivo foram realizados usando os modelos de tumor singênico de camundongo para avaliar a capacidade do Apt _HER2 -MNS para direcionar tumores com superexpressão de HER2. Usando um modelo de tumor que foi gerado pela implantação de células NIH3T6.7 na coxa, um experimento de MRI foi conduzido desde a pré-injeção até 120 min após a injeção de WMNCs ou Apt _HER2 -MNS (Fig. 5, ver também Arquivo Adicional 1:Figura S4). O efeito de aumento de contraste T2 por agentes de contraste à base de IONP é observado como imagem escura porque eles induzem o efeito de encurtamento T2 em torno dos prótons. Portanto, nas análises de intensidade de sinal, os valores de T2 ou T2 * foram representados por R2 ou R2 *. R2, um valor inverso de T2, é usado para comparar a intensidade do sinal com o valor positivo. No caso de WMNCs, a maior intensidade de sinal R2 foi observada 30 minutos após a injeção de WMNCs, após o que diminuiu gradualmente (Fig. 5a, b). Aos 120 min após a injeção de WMNCs, a intensidade do sinal T2 se assemelhava ao estado de pré-injeção. A taxa de mudança no valor médio da intensidade do sinal R2 foi inferior a 10%; portanto, era difícil reconhecer na RM ponderada em T2 a olho nu. No estudo anterior, foi demonstrado que as nanopartículas de óxido de ferro com envelope T80 se acumularam em torno dos tecidos tumorais, apesar da ausência de quaisquer frações de direcionamento [46]. No entanto, nesse estudo, uma dose de agente de contraste de 1,4 mg _Fe por camundongo foi usado na ressonância magnética ponderada em T2, que foi 14 vezes maior do que a dose usada neste estudo. Isso significa que as WMNCs não puderam mostrar eficácia de aumento de contraste eficaz no experimento com uma dose de 0,1 mg de _Fe por rato (5 mg _Fe /kg). A mudança da série temporal da intensidade do sinal de R2 * também foi inferior a 10% e não houve significância estatística. Em contraste, 120 min após a injeção, Apt _HER2 -MNS causou um aumento de intensidade de sinal 130% maior do que antes da injeção de Apt _HER2 -MNS apesar de usar a mesma dose de injeção como WMNCs (Fig. 5c, d). Esta dose de injeção foi 2 a 30 vezes menor do que a de outros estudos sobre agente de contraste baseado em nanopartículas magnéticas modificadas por aptâmero [44, 47, 48]. Este resultado indicou que Apt _HER2 -MNS tem uma capacidade de direcionamento mais alta do que WMNCs ou outro agente de contraste modificado por aptâmero, e também sugeriu que o efeito de aumento de alto contraste do Apt _HER2 -MNS pode ser esperado, apesar de uma dose mais baixa do que WMNCs. O realce pelo contraste apareceu principalmente nos vasos periféricos e no centro do tecido tumoral. Embora os vasos periféricos tenham escurecido logo após a injeção de Apt _HER2 -MNS, o realce pelo contraste no centro da lesão tumoral apareceu pela primeira vez aos 60 min e tendeu a aumentar até 120 min.

Imagens de RM in vivo do modelo de camundongo tumor HER2 + usando WMNCs ( n =3) ou Apt _HER2 -MNS ( n =3). a Imagens de RM ponderadas em T2 e T2 * na pré ou pós-injeção de WMNCs. b Gráfico de intensidade do sinal relativo medido de a . c Imagens de RM ponderadas em T2 e T2 * na pré ou pós-injeção de Apt _HER2 -MNS. d Gráfico de intensidade do sinal relativo e e o histograma de intensidade da região do tumor medido de c . f Dados de análise histológica obtidos após imagens de RM. Barras de erro foram representadas por y positivo -eixo apenas. Intensidades relativas do sinal de b , d , e e foram medidos a partir do ROI de linha sólida vermelha de a , c , e Arquivo adicional 1:Figura S4

Para enfatizar a mudança visível nos efeitos de aumento de contraste antes e depois da injeção de Apt _HER2 -MNS, uma análise de histograma da intensidade do sinal de R2 foi conduzida nas ROIs nas imagens de ressonância magnética ponderadas em T2 (Fig. 5e). Como o sinal de T2 é aparente como o realce negativo em imagens de ressonância magnética ponderadas em T2, ele foi representado por R2. Após a injeção de Apt _HER2 -MNS, o centro do histograma foi deslocado para o lado direito. O aumento de aproximadamente 10% do realce pelo contraste foi observado quando a diferença do centro dos histogramas foi calculada.

Para confirmar a presença do Apt _HER2 -MNS no tumor histologicamente, a coloração com azul da Prússia foi conduzida (Fig. 5f). No tecido corado com azul da Prússia, o núcleo e o citoplasma foram corados com uma cor rosa claro ou profundo, e vários pontos de cor azul foram observados ao redor das células tumorais. Assumimos que os tecidos tumorais tingiram-se de azul se o Apt _HER2 -MNS direcionou o tumor. Nos resultados da coloração com azul da Prússia, os pontos azuis foram observados nos tecidos tumorais e nas lâminas de tecido do Apt _HER2 -MNS teve aproximadamente três vezes mais o número de pontos azuis que os de WMNCs. A coloração com azul da Prússia pode detectar o íon Fe nos tecidos; assim, foi usado para confirmar o acúmulo do agente de contraste baseado em IONPs nos tecidos tumorais [44, 49, 50].

Conclusões

Em conclusão, confirmamos que Apt _HER2 -MNS funciona como um agente de contraste de MRI alvo de HER2 in vivo por caracterização físico-química e experimentos de MRI in vivo em modelos de tumor de camundongo que expressam HER2. Apt _HER2 -MNS tem alta relaxividade e especificidade para HER2, e demonstrou efeitos marcantes de realce de contraste apesar de uma dose de administração mais baixa do que outros agentes de contraste T2, devido às nanopartículas de óxido de ferro. Espera-se que este agente de contraste forneça informações sobre a expressão do câncer HER2 em pacientes com câncer e poderia ser utilizado para monitorar pacientes com câncer HER2 + durante a quimioterapia usando drogas alvo HER2. Esperamos que os resultados deste trabalho ofereçam uma estratégia promissora para o diagnóstico de câncer com superexpressão de HER2 e para o tratamento de pacientes.

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