Micelas de pontos quânticos de Si conjugados com anticorpo CKAP4 para imagens direcionadas de câncer de pulmão

Resumo

Atualmente, vários nanomateriais fluorescentes foram projetados e sintetizados como agentes de contraste óptico para navegação cirúrgica. No entanto, não houve relatórios sobre a preparação de agentes de contraste fluorescentes para navegação de cirurgia de câncer de pulmão usando pontos quânticos de silício (Si QDs). Este estudo melhorou e modificou as micelas de Si QD dispersíveis em água relatadas por Pi et al. para preparar micelas de Si QD-CKAP4. Os dados mostraram que as micelas de Si QD-CKAP4 eram partículas esféricas com um hidrodiâmetro médio de aproximadamente 78,8 nm. A absorção de UV-visível das micelas de Si QD-CKAP4 variou de 200 a 500 nm. Com um comprimento de onda de excitação de 330 nm, forte fluorescência em 640 nm foi observada no espectro de emissão de fluorescência. A microscopia confocal a laser e o ensaio de microscopia de fluorescência mostraram que as micelas de Si QD-CKAP4 exibiram boa capacidade de direcionamento para células de câncer de pulmão e tecidos de câncer de pulmão in vitro. O ensaio de imagem de fluorescência in vivo mostrou que as micelas de Si QD-CKAP4 foram metabolizadas pelo fígado e excretadas pelo rim. Além disso, as micelas de Si QD-CKAP4 visavam especificamente o tecido de câncer de pulmão in vivo em comparação com o tecido de pulmão saudável. Ensaios de citotoxicidade e coloração com hematoxilina e eosina mostraram que as micelas de Si QD-CKAP4 exibiram alta biossegurança in vitro e in vivo. Micelas-CKAP4 de Si QD é um agente de imagem especificamente direcionado para câncer de pulmão e espera-se que seja um agente de contraste fluorescente para navegação cirúrgica de câncer de pulmão no futuro.

Introdução

O câncer é uma das principais doenças que ameaçam a saúde humana em todo o mundo [1]. Entre eles, a incidência e mortalidade do câncer de pulmão são as mais altas entre todos os tumores malignos e apresentam tendência de aumento a cada ano [2]. A ressecção cirúrgica é o tratamento primário para tumores sólidos. No entanto, os métodos de diferenciação de tecido maligno de tecido saudável são limitados principalmente a pistas táteis e visuais e a experiência do cirurgião [3].

Nos últimos anos, a cirurgia guiada por fluorescência se tornou popular no campo de pesquisa em orientação intraoperatória em tempo real para ressecção de tumor [4]. Com a ajuda de um agente de contraste de fluorescência e sistema de imagem de fluorescência, os cirurgiões podem usar a orientação de imagem em tempo real para ressecar os tumores primários e identificar tumores residuais na cavidade cirúrgica. Comparado com os métodos tradicionais de imagem biomédica, o sistema de imagem por fluorescência oferece várias vantagens, como a ausência de radiação ionizante e alta resolução espacial [3, 5, 6].

No momento, os pesquisadores relataram vários nanomateriais fluorescentes para imagens biológicas [7, 8]. Entre eles, os pontos quânticos de silício (Si QDs) tornaram-se populares no campo da imagem biológica [9,10,11]. No entanto, não há relatos sobre a preparação de agentes de contraste fluorescentes para navegação de cirurgia de câncer de pulmão usando Si QDs.

Em 2014, Pi et al. relataram um método de síntese para novas micelas de Si QD dispersíveis em água [12]. Os dados do estudo mostraram que as micelas de Si QD exibiram vantagens, incluindo tamanho controlável, alta eficiência quântica de fluorescência e excelente estabilidade de luz [12]. Este estudo visa melhorar e modificar as micelas solúveis em água de Si QD relatadas por Pi et al. para preparar um novo agente de contraste fluorescente, que deverá ser usado como um agente de contraste fluorescente para navegação em cirurgia de câncer de pulmão no futuro.

Em 2018, Yanagita et al. relataram que o CKAP4 é altamente expresso no soro e nos tecidos cancerígenos de pacientes com câncer de pulmão e poderia ser usado como um novo biomarcador para o diagnóstico precoce do câncer de pulmão [13]. Portanto, as micelas de Si QD conjugadas com anticorpo CKAP4 podem ser um novo agente de contraste fluorescente, que pode ser usado como um agente de contraste fluorescente para navegação em cirurgia de câncer de pulmão.

Neste estudo, DSPE-PEG-COOH foi usado para preparar micelas de Si QD com grupos carboxila em suas superfícies. Em seguida, conjugamos o anticorpo CKAP4 com micelas de Si QD usando EDC. Os resultados mostraram que as micelas de Si QD-CKAP4 se dispersaram bem em solução aquosa. As micelas de Si QD-CKAP4 exibiram forte fluorescência vermelha sob irradiação de luz ultravioleta a 365 nm. Devido à conjugação do anticorpo, as micelas de Si QD-CKAP4 mostraram boa capacidade de direcionamento para células e tecidos de câncer de pulmão, tanto in vitro quanto in vivo. Além disso, as micelas de Si QD-CKAP4 exibiram alta biossegurança tanto in vitro quanto in vivo. Neste estudo, preparamos um potencial agente de contraste fluorescente para navegação em cirurgia de câncer de pulmão.

Métodos

Reagentes

A albumina de soro bovino (BSA) foi adquirida da Sigma (ensaio ≥ 98%; Missouri, EUA); tetra-hidrofurano (THF) de Adamas-beta (pureza:99,9%; Basel, Suíça); DSPE-PEG-COOH de Aladdin (Shanghai, China); Anticorpo CKAP4 da Abcam (0,55 mg / mL; Cambridge, UK); Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) e solução salina tampão de fosfato (PBS) da Hyclone (Utah, EUA); soro fetal bovino (FBS) e tirisina da Gibco (New York, EUA); paraformaldeído (4%), tampão de permeabilização de imunocoloração com Triton X-100 e tampão de bloqueio para imunocoloração de Beyotime (Xangai, China); glicerina de Solarbio (pureza ≥ 99%; Pequim, China); e tripsina de Kingmorn (0,25%; Xangai, China).

Instrumentação

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram obtidas usando microscopia eletrônica JEM-2100F (JEOL, Tóquio, Japão). O hidrodiâmetro foi determinado usando JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Os espectros de absorção de UV-Vis foram obtidos usando o espectrofotômetro Cary 50 (Varian, Palo Alto, CA, EUA). O espectro de emissão de fluorescência foi obtido usando o espectrofotômetro F-182 4500 (Hitachi Ltd., Tóquio, Japão). A espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) foi realizada usando o sistema PHI-5000C ESCA atualizado com RBD (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). Os rendimentos quânticos de fotoluminescência (PL) (QYs) foram estimados usando espectrômetro fluorescente (FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, Inglaterra). A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi realizada usando Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA). A difração de raios X (XRD) foi testada por SmartLab (Rigaku Corporation, Tóquio, Japão).

Células

As linhas de células T A549 e 293 foram adquiridas no Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, China).

Preparação de Si QD Micelles

Primeiro, dodecly-Si QDs foram preparados por uma reação de hidrossililação e dissolvidos em THF para preparar uma solução de dodecly-Si QDs (15 mg / mL) de acordo com um método previamente relatado [12]. Em seguida, 20 mg de DSPE-PEG-COOH foram dissolvidos e misturados em 10 mL de água desionizada para preparar a solução de DSPE-PEG-COOH (2 mg / mL, 10 mL). Subsequentemente, uma solução de dodecly-Si QDs (15 mg / mL, 66 µL) foi lentamente adicionada a uma solução de 10 mL de DSPE-PEG-COOH gota a gota. Após agitação ultrassônica por 3 min, uma solução límpida e transparente foi obtida. A solução foi então colocada em uma capela e agitada por 12 h no escuro. Posteriormente, a solução foi dialisada por 24 he então liofilizada por 3 dias para obtenção das micelas de Si QD.

Preparação de Si QD Micelles-CKAP4

Neste estudo, o anticorpo CKAP4 foi conjugado com micelas de Si QD pela ativação do grupo carboxila por EDC [14]. O método foi o seguinte:4 mg de micelas de Si QD foram dispersos em 900 µL de PBS para preparar a solução de micelas de Si QD. EDC (10 mg) foi adicionado a 100 µL de PBS para preparar a solução de EDC. Em seguida, 100 µL de solução de EDC foram adicionados lentamente a 900 µL de micelas de Si QD, com agitação ultrassônica por 5 min. Além disso, 20 µL de anticorpo CKAP4 foram adicionados lentamente e a mistura de solução foi agitada por 2 h em temperatura ambiente no escuro. O produto foi então ultrafiltrado a 4000 rpm durante 15 min. Após lavagem com PBS três vezes, o produto foi referido como micelas de Si QD-CKAP4.

Teste de citotoxicidade

Neste estudo, o azul de tripano foi usado para testar a biossegurança dos nanomateriais [15]. As células T A549 e 293 foram incubadas em placas de 24 poços (1 × 10 ⁶ / poço) a 37 ° C durante 12 h. Depois de descartar o meio, uma série de concentrações de micelas de Si QD ou micelas de Si QD-CKAP4 (concentração de Si:0–152 µg / mL) foram adicionadas a uma placa de 24 poços e incubadas a 37 ° C por 2 h. Após descartar o meio, as células foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS. O azul de tripano foi misturado com a suspensão de células na proporção de 1:1. O número de células vivas e mortas foi detectado e registrado usando Countstar. Viabilidade celular (%) =número de células vivas / (número de células vivas + número de células mortas) × 100. Foram utilizadas três réplicas biológicas. O software Prism (versão 7.01; GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) foi usado para a análise estatística. Os dados foram analisados ​​usando ANOVA de duas vias com o pós-teste de Dunnett. A significância estatística foi estabelecida em P <0,05. * P <0,05; ** P <0,01; e *** P <0,001.

Nanomateriais direcionados para células de câncer de pulmão in vitro

A capacidade de direcionamento de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4 para células de câncer de pulmão in vitro foi detectada da seguinte forma:primeiro, as células A549 foram incubadas em placas confocais a laser (3 × 10 ⁵ células / placa) a 37 ° C durante 12 h. Após descartar o meio, as células foram lavadas três vezes com PBS. Posteriormente, 1 mL de paraformaldeído (4%) foi adicionado às células e incubado a 25 ° C por 10 min. Após o descarte do paraformaldeído, as células foram lavadas com PBS três vezes. Em seguida, 1 mL de tampão de permeabilização de imunocoloração com Triton X-100 foi adicionado às células e incubado a 25 ° C por 10 min. Após descartar o tampão de permeabilização de imunocoloração com Triton X-100, as células foram lavadas três vezes com PBS. Posteriormente, 1 mL de tampão de bloqueio para imunocoloração foi adicionado às células e incubado a 25 ° C por 10 min. Após descartar o tampão de bloqueio para imunocoloração, as células foram lavadas três vezes com PBS. Em seguida, 200 µL de micelas de Si QD ou micelas de Si QD-CKAP4 (concentração de Si de 150 μg / mL) foram adicionados às células e incubados a 37 ° C por 2 h. Após o descarte dos nanomateriais, as células foram lavadas três vezes com PBS. As fotografias foram tiradas usando um microscópio confocal a laser (Leica, Wetzlar, Alemanha). A luz de excitação foi fixada em 405 nm, e o comprimento de onda de emissão foi ajustado em 630 nm.

A capacidade de direcionamento de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4 para células normais in vitro foi detectada da seguinte forma:primeiro, células T 293 foram coletadas em tubos Eppendorf de 1,5 mL a uma densidade de 1 × 10 ⁶ células / tubo. Após centrifugação a 1000 rpm por 5 min, o sobrenadante foi descartado. Em seguida, 1 mL de paraformaldeído (4%) foi adicionado às células e incubado em temperatura ambiente por 10 min. Após centrifugação a 1000 rpm por 5 min, o sobrenadante foi descartado. As células foram então lavadas três vezes com PBS. Em seguida, 1 mL de tampão de permeabilização de imunocoloração com Triton X-100 foi adicionado às células e incubado a 25 ° C por 10 min. As células foram então centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. Após o descarte do sobrenadante, as células foram lavadas três vezes com PBS. Em seguida, 1 mL de tampão de bloqueio para imunocoloração foi adicionado às células e incubado a 25 ° C por 10 min. As células foram então centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. Após o descarte do sobrenadante, as células foram lavadas três vezes com PBS. Posteriormente, 200 µL de micelas de Si QD ou micelas de Si QD-CKAP4 (concentração de Si de 150 μg / mL) foram adicionados às células e incubados a 37 ° C por 2 h. Após centrifugação a 1000 rpm por 5 min, o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado três vezes com PBS. As células foram colhidas e lâminas de microscópio foram preparadas. A microscopia foi realizada usando um microscópio confocal a laser. A luz de excitação foi fixada em 405 nm, e o comprimento de onda de emissão foi ajustado em 630 nm.

Três experimentos independentes foram conduzidos. A análise quantitativa da intensidade média de fluorescência foi realizada usando o software ImageJ (Bethesda, MD, EUA). O software Prism (versão 7.01) foi usado para a análise estatística. Os dados foram analisados ​​usando ANOVA de uma via com o pós-teste de Dunnett. A significância estatística foi estabelecida em P <0,05. *** P <0,001.

Modelo de camundongos com tumor

Dez camundongos nus machos (5–6 semanas de idade) foram adquiridos no Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos os camundongos foram alojados em condições livres de patógenos específicos (SPF) no Experimental Animal Center da Universidade de Tongji (Shanghai, China). Para estabelecer o modelo de camundongo portador de tumor, os camundongos foram injetados por via subcutânea com 1 × 10 ⁶ Células A549. Ratinhos com tumor foram usados ​​na experiência quando o diâmetro do tumor atingiu 6 mm. Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais da Universidade de Tongji.

Si QD Micelles-CKAP4 direcionado para tecidos de câncer de pulmão in vitro

Os ratos com tumor foram sacrificados sob anestesia. O tumor e o tecido pulmonar normal foram coletados para preparar seções de parafina. Após desidratação, recuperação de antígeno e bloqueio de soro, micelas de Si QD ou micelas de Si QD-CKAP4 (concentração de Si 150 µg / mL) foram adicionadas aos tecidos e incubadas a 37 ° C por 2 h. Após o descarte dos nanomateriais, os tecidos foram lavados três vezes com PBS. Os tecidos foram corados com 4 ', 6-diamidino-2-fenilin-dole (DAPI) durante 10 min. Após lavagem três vezes com PBS, um meio antifade foi adicionado aos tecidos e incubado a 25 ° C por 5 min. Após descartar o meio antifade, os tecidos foram lavados três vezes com PBS. As fotografias foram tiradas usando um microscópio de fluorescência (Nikon, Tóquio, Japão) com um comprimento de onda de excitação de 405 nm e um comprimento de onda de emissão de 630 nm. Três experimentos independentes foram conduzidos. Uma análise quantitativa da intensidade média da fluorescência vermelha foi realizada usando o software ImageJ. O software Prism (versão 7.01) foi usado para a análise estatística. Os dados foram analisados ​​usando ANOVA de uma via com o pós-teste de Dunnett. A significância estatística foi estabelecida em P <0,05. *** P <0,001.

Imagem de fluorescência In Vivo

No experimento, nove camundongos com tumor foram divididos em três grupos (grupo de injeção de micelas de Si QD-CKAP4, grupo de injeção de micelas de Si QD e grupo de injeção de solução salina). Os camundongos no grupo de injeção de micelas de Si QD-CKAP4 foram injetados por via intravenosa com 200 µL de micelas de Si QD-CKAP4 (Si:4 mg / kg). Os camundongos no grupo de injeção de micelas de Si QD foram injetados por via intravenosa com 200 µL de micelas de Si QD (Si:4 mg / kg). Os camundongos no grupo de injeção de solução salina foram injetados por via intravenosa com 200 µL de solução salina. Imagens de fluorescência foram adquiridas em pontos de tempo diferentes (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 e 4 h). Os camundongos no grupo de injeção de micelas de Si QD-CKAP4 foram anestesiados e sacrificados em 4 h para detectar o sinal de fluorescência em seu coração, fígado, baço, pulmão, rim e tumor. Neste estudo, a imagem de fluorescência foi realizada usando um VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Coreia) com um conjunto de filtros PE ( λ _excitação 450–500 nm, λ _emissão 600–650 nm). O software Prism (versão 7.01) foi usado para a análise estatística. Os dados foram analisados ​​usando uma ANOVA de uma via com o pós-teste de Dunnett. A significância estatística foi estabelecida em P <0,05. * P <0,05; ** P <0,01.

Coloração por Hematoxilina e Eosina (H&E)

Neste estudo, 12 camundongos com tumor foram injetados com solução salina (200 µL), micelas de Si QD (Si:4 mg / kg, 200 µL) ou micelas de Si QD-CKAP4 (Si:4 mg / kg, 200 µL) pela veia da cauda. Após 24 h, os camundongos foram sacrificados. A coloração H&E foi realizada em seus corações, fígados, baços, pulmões e rins. Alterações patológicas foram observadas por microscopia óptica [14, 16].

Resultados

Preparação e caracterização de micelas de Si QD

Primeiro, dodecil-Si QDs foram preparados por hidrossililação de acordo com um relatório publicado anteriormente (Esquema 1, Etapa 1) [12]. Semelhante aos dados relatados, os dodecil-Si QDs sintetizados por nosso grupo se dispersaram bem em metilbenzeno [12]. TEM mostrou que os QDs de dodecil-Si eram esféricos com tamanhos relativamente uniformes. Os tamanhos dos QDs de dodecil-Si nas imagens TEM foram medidos usando o software ImageJ. Os dados mostraram que o diâmetro dos QDs de dodecil-Si variou de 4,1 a 5,3 nm, com um diâmetro médio de cerca de 4,7 nm (Fig. 1a). Nas imagens ampliadas do dodecil-Si QDs, franjas de rede evidentes podem ser observadas (Fig. 1a). Neste estudo, a distância plana da rede foi medida usando o software ImageJ. Os dados mostraram que a distância média entre as franjas da rede é de aproximadamente 0,35 nm, que é quase a mesma dos QDs de dodecil-Si relatados anteriormente (0,34 nm). Portanto, os dodecil-Si QDs sintetizados neste estudo mostraram boa cristalinidade [12]. O espalhamento de luz dinâmico (DLS) mostrou os diâmetros hidrodinâmicos de dodecil-Si QDs variando de 4,8 a 13,5 nm com uma média de 6,5 nm (Fig. 1b).

Esquema da preparação de micelas-CKAP4 de Si QD e imagem biológica direcionada em tecidos de câncer de pulmão

a Imagens TEM de dodecil-Si QDs; b distribuição do hidrodiômetro de dodecil-Si QDs; c Imagens TEM de micelas de Si QD; d distribuição de hidrodiâmetro de micelas de Si QD; e Imagens TEM de micelas de Si QD-CKAP4; f distribuição do hidrodiômetro de micelas de Si QD-CKAP4; g Espectroscopia de fotoelétrons de raios-X C1s (XPS) de micelas de Si QD; h Espectros C1s XPS de micelas de Si QD-CKAP4

Para preparar micelas de Si QD dispersíveis em água, dodecil-Si QDs foram modificados por automontagem de DSPE-PEG-COOH (Esquema 1, Etapa 2) [12]. Aqui, DSPE-PEG-COOH foi usado em vez de F127 para preparar micelas de Si QD com grupos carboxila na superfície. Os resultados mostraram que as micelas de Si QD se dispersaram bem em água. Imagens TEM mostraram que as micelas de Si QD eram partículas esféricas com Si QDs inseridos. O diâmetro das micelas de Si QD foi de 22,7 a 54,6 nm, com um diâmetro médio de aproximadamente 34,3 nm (Fig. 1c). DLS mostrou que os diâmetros hidrodinâmicos de micelas de Si QD variaram de 43,8 a 615,9 nm, com uma média de 58,7 nm (Fig. 1d). O potencial zeta médio das micelas de Si QD foi de aproximadamente - 20,7 mV. Neste estudo, o FTIR foi realizado para investigar a composição das micelas de Si QD (Arquivo adicional 1:Figura S1A). Os dados mostraram que os picos de absorção de vibração de alongamento de N – H, C – H, O – H e C =O estavam em 3430, 2920, 2850 e 1640 cm ⁻¹ , respectivamente; os picos de absorção de vibração de flexão de C – H e O – H estavam em 1460 e 1400 cm ⁻¹ , respectivamente; os picos de absorção de vibração de alongamento de Si – C, C – O e P – O – C estavam em 1250, 1100 e 951 cm ⁻¹ , respectivamente; os picos de absorção de vibração de flexão de Si – H e O =C – N estavam em 850 e 526 cm ⁻¹ , respectivamente. Esses dados mostram que os grupos característicos de DSPE-PEG-COOH (como N – H, O – H, C =O, C – O, P – O – C e O =C – N) e os grupos característicos de Dodecil-Si QDs (como Si – C e Si – H) podem ser encontrados no espectro FTIR de micelas de Si QD, indicando que dodecil-Si QDs foram encapsulados com sucesso em micelas auto-montadas por DSPE-PEG-COOH. Além disso, as micelas de Si QD foram caracterizadas por XRD (Arquivo adicional 1:Figura S1B). O pico de difração das micelas de Si QD foi nítido, indicando que a cristalinidade das micelas de Si QD era boa. No padrão de XRD, picos em 2 θ de 27.073, 28.451, 56.598 e 73.145 correspondem aos (100), (002), (112) e (203) planos de cristal de silício (PDF # 80-0005), indicando que os Si QDs foram encapsulados com sucesso no Micelas de Si QD. Os picos em 2 θ de 31,692, 45,431, 66,200, 75,260 e 83,955 correspondem aos (200), (220), (400), (420) e (422) planos cristalinos de NaCl (PDF # 77-2064). Uma explicação racional para a presença de NaCl nas micelas de Si QD pode ser a seguinte:Após a preparação da micela de Si QD, dissolvemos as micelas de Si QD em PBS, levando à presença de NaCl nas micelas de Si QD.

O espectro de absorção de UV-visível mostrou que a absorção de micelas de Si QD variou de 200 a 500 nm (Fig. 2a). Com um comprimento de onda de excitação de 330 nm, uma forte fluorescência a 650 nm foi observada nos espectros de emissão de fluorescência das micelas de Si QD (Fig. 2b). A solução aquosa de micelas de Si QD (concentração de Si:80 µg / mL) era transparente e límpida à luz natural; no entanto, emitiu fluorescência vermelha forte sob luz UV 365 nm (Fig. 2c). Neste estudo, os PL QYs absolutos foram testados usando um espectrômetro fluorescente (FLS1000). O comprimento de onda de excitação foi de 365 nm. Os dados mostraram que o PL QY absoluto das micelas de Si QD foi de aproximadamente 14,49%.

a Espectro de absorção UV-visível de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4; b espectro de emissão fluorescente de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4; c imagens de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4 expostas em luz natural (esquerda) e luz UV de 365 nm (direita)

Preparação e caracterização de Si QD Micelles-CKAP4

Conjugamos o anticorpo CKAP4 com micelas de Si QD usando EDC (Esquema 1, Etapa 3) [14]. Imagens TEM mostraram que as micelas de Si QD-CKAP4 eram partículas esféricas com Si QDs inseridos. O diâmetro das micelas de Si QD-CKAP4 variou de 24,4 a 67,7 nm, com um diâmetro médio de aproximadamente 35,5 nm (Fig. 1e). DLS mostrou que os diâmetros hidrodinâmicos das micelas de Si QD-CKAP4 variaram de 58,7 a 824,9 nm com uma média de 78,8 nm, que foi ligeiramente maior do que a das micelas de Si QD (Fig. 1f). Este aumento pode ser devido à conjugação do anticorpo CKAP4. Os espectros C1s XPS mostraram seis tipos de átomos de carbono na região C1s:C (O) O (288,81 eV), C =O (286,5 eV), C – O (285,76 eV), C – N (285,25 eV), C –C (284,88 eV) e C – H (284,34 eV) (Fig. 1g). No entanto, o pico de C (O) O quase desapareceu no espectro XPS das micelas Si QD-CKAP4, indicando que a conjugação entre os grupos carboxila e aminas primárias foi bem-sucedida; portanto, o anticorpo CKAP4 foi conjugado com sucesso com as micelas Si QD (Fig. 1h). O potencial zeta médio das micelas de Si QD-CKAP4 foi de aproximadamente - 10,7 mV, maior do que o das micelas de Si QD. A explicação para o fenômeno acima pode ser a seguinte:Existem muitos grupos carboxila na superfície das micelas de Si QD; portanto, as micelas de Si QD exibiram forte eletricidade negativa. No entanto, nas micelas de Si QD-CKAP4, o acoplamento do anticorpo CKAP4 levou à diminuição dos grupos carboxila na superfície das micelas de Si QD-CKAP4; portanto, o potencial zeta médio das micelas de Si QD-CKAP4 aumentou.

O espectro de absorção de UV-visível mostrou que a absorção das micelas de Si QD-CKAP4 variou de 200 a 500 nm, semelhante ao resultado das micelas de Si QD (Fig. 2a). Com um comprimento de onda de excitação de 330 nm, uma forte fluorescência em 640 nm foi observada a partir de micelas de Si QD-CKAP4 no espectro de emissão de fluorescência (Fig. 2b). Estes resultados indicaram que a conjugação do anticorpo não exerceu influência significativa nas propriedades de fluorescência das micelas Si QD-CKAP4. A solução aquosa de micelas de Si QD-CKAP4 (concentração de Si:80 µg / mL) era transparente e límpida à luz natural. Sob luz UV 365 nm, ele pode emitir fluorescência vermelha forte, consistente com os resultados das micelas de Si QD (Fig. 2c). Os testes de PL QY mostraram que o PL QY absoluto das micelas de Si QD-CKAP4 foi de aproximadamente 16,96%.

Teste de Citotoxicidade de Si QD Micelas-CKAP4 In Vitro

A linha de células de câncer de pulmão humano A549 e a linha de células epiteliais renais humanas 293 T foram usadas como células alvo para investigar a biossegurança de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4. Neste estudo, diferentes concentrações de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4 (concentração de Si 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 e 152 µg / mL) foram primeiro incubadas com células T A549 ou 293 a 37 ° C por 2 h. A viabilidade celular foi detectada usando azul de tripano (Fig. 3) [15]. O ID50 de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4 foi obtido usando o software GraphPad. Os dados mostraram que o ID50 de micelas de Si QD era maior do que 152 µg / mL em células T A549 e 293. A ID50 de micelas de Si QD-CKAP4 foi de 25,94 µg / mL em células A549 e 72,69 µg / mL em células T 293. Estes resultados indicaram que a citotoxicidade de micelas de Si QD-CKAP4 foi significativamente maior do que a de micelas de Si QD e a citotoxicidade de micelas de Si QD-CKAP4 em células A549 foi significativamente maior do que a de células T 293. Este fenômeno pode ser devido à citotoxicidade dependente do complemento [17]. Além disso, esses resultados também indicaram que as micelas de Si QD-CKAP4 apresentaram maior segurança biológica em células normais do que em células de câncer de pulmão, o que estabeleceu uma base para sua aplicação in vivo.

Viabilidade celular de A549 a e 293 T b incubado com diferentes concentrações de micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4 (concentração de Si:0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 e 152 µg / mL) por 2 h ( n =3; média ± DP; ANOVA de duas vias com pós-teste de Dunnett; * P <0,05; ** P <0,01; e *** P <0,001)

Si QD Micelles-CKAP4 direcionado para células de câncer de pulmão in vitro

Para investigar mais a função de direcionamento de micelas de Si QD-CKAP4 em células de câncer de pulmão in vitro, células T A549 e 293 foram usadas como células alvo. Micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4 foram primeiro incubadas com células T A549 e 293 a 37 ° C por 2 h. O efeito de direcionamento foi detectado usando microscopia confocal a laser (Fig. 4). Os resultados mostraram que a fluorescência vermelha nas micelas Si QD-CKAP4 incubadas A549 foi significativamente maior do que a do grupo de co-incubação Si QD-CKAP4 e 293 T, micelas de Si QD e grupo de co-incubação A549 e micelas de Si QD e grupo de co-incubação 293 T. Estes resultados indicaram que as micelas de Si QD-CKAP4 poderiam ter como alvo específico as células A549 in vitro.

Detecção da capacidade de micelas de Si QD-CKAP4 direcionadas a células A549 in vitro. a A549 e 293 T foram incubados com micelas de Si QD-CKAP4 e micelas de Si QD (a concentração de Si 150 µg / ml) a 37 ℃ por 2 h. Após descartar o sobrenadante e lavar duas vezes, as células foram fotografadas por microscópio confocal de varredura a laser (Bar, 25 µm). b Uma análise quantitativa da intensidade média de fluorescência foi medida por ImageJ ( n =3; média ± DP; ANOVA unilateral com o pós-teste de Dunnett; *** P <0,001)

Si QD Micelles-CKAP4 direcionado para tecidos de câncer de pulmão in vitro

Para explorar a possibilidade de micelas de Si QD-CKAP4 visando tecidos de câncer de pulmão, projetamos um experimento in vitro para verificar a propriedade de direcionamento de micelas de Si QD-CKAP4 para tecidos A549. Neste estudo, células A549 foram inoculadas por via subcutânea em camundongos. Após a formação do tumor, tecidos tumorais A549 e tecidos pulmonares normais foram coletados e incubados com micelas de Si QD e micelas de Si QD-CKAP4 a 37 ° C por 2 h. O efeito de direcionamento foi detectado usando microscopia confocal a laser (Fig. 5). Os resultados mostraram que o tecido A549 incubado com micelas de Si QD-CKAP4 poderia emitir fluorescência vermelha forte em um comprimento de onda de excitação de 405 nm. No entanto, apenas uma fluorescência vermelha fraca foi observada em tecidos A549 incubados com micelas de Si QD, tecido de pulmão normal incubado com micelas de Si QD-CKAP4 e tecido de pulmão normal incubado com micelas de Si QD. A fluorescência vermelha no tecido A549 incubado com micelas Si QD-CKAP4 foi significativamente maior do que nos tecidos A549 incubados com micelas Si QD, tecido pulmonar normal incubado com micelas Si QD-CKAP4 e tecido pulmonar normal incubado com micelas Si QD. Estes dados indicam que as micelas de Si QD-CKAP4 podem atingir eficazmente os tecidos do câncer de pulmão in vitro, que é suposto ser um potencial agente de contraste fluorescente para o câncer de pulmão.

Detecção da capacidade de micelas de Si QD-CKAP4 direcionadas a tecido A549 in vitro. a Tecido A549 e tecido pulmonar normal foram cultivados com micelas de Si QD-CKAP4 e micelas de Si QD (a concentração de Si:150 µg / ml) a 37 ℃ por 2 h. Após duas lavagens, os tecidos foram corados com DAPI para visualizar o núcleo. Os tecidos foram fotografados por microscópio confocal de varredura a laser (Bar, 200 µm). b Uma análise quantitativa da intensidade média de fluorescência vermelha foi medida por ImageJ ( n =3; média ± DP; ANOVA unilateral com o pós-teste de Dunnett; *** P <0,001)

Imagem de fluorescência In Vivo

Nove camundongos com tumor foram divididos em três grupos (grupo de injeção de micelas de Si QD-CKAP4, grupo de injeção de micelas de Si QD e grupo de injeção de solução salina). Os camundongos no grupo de injeção de micelas de Si QD-CKAP4 foram injetados por via intravenosa com 200 µL de micelas de Si QD-CKAP4 (Si:4 mg / kg). Os camundongos no grupo de injeção de micelas de Si QD foram injetados por via intravenosa com 200 µL de micelas de Si QD (Si:4 mg / kg). Os camundongos no grupo de injeção de solução salina foram injetados por via intravenosa com 200 µL de solução salina. Imagens de fluorescência foram adquiridas em pontos de tempo diferentes (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 e 4 h). The significant fluorescence signals were not observed in lung cancer tissues among all the mice in the three groups (data not shown). This might be because of the weak fluorescence penetration of the Si QD micelles-CKAP4 and Si QD micelles.

The mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were anesthetized and euthanized at 4 h to detect the fluorescence signal in their heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor. Data showed that a significant fluorescence signal could be observed in the liver, kidney, and tumor tissues. However, there was no significant fluorescence signal in the heart, spleen, or healthy lung tissues (Fig. 6). The significant fluorescence signal in the liver and kidney indicated that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. In addition, the fluorescence signal in A549 tumor tissues was significantly higher than that in healthy lung tissues. This phenomenon contributed to the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer tissues. These results indicate that Si QD micelles-CKAP4 specifically targets lung cancer tissue, which is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

a Bright photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. b Fluorescence photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. c Relative fluorescence intensities of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor tissue (n =3; mean ± SD; one-way ANOVA with Dunnett’s post test; * P <0,05; **P  < 0.01)

Biosafety Evaluation of Si QD Micelles-CKAP4 In Vivo

Finally, we investigated the acute toxicity of the Si QD micelles-CKAP4 in vivo. In this study, tumor-bearing mice (n  = 12) were intravenously injected with saline (200 µL), Si QD micelles (Si:4 mg/kg, 200 µL), or Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) and then euthanized 24 h later. H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys are shown in Fig. 7. Compared with saline-injected mice, there were no evident pathological changes in the major organs of Si QD micelles-injected mice and Si QD micelles-CKAP4-injected mice. The above data indicated that Si QD micelles (Si:4 mg/kg) and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) showed no significant toxicity in vivo.

H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys in tumor-bearing mice injected with saline, Si QD micelles (Si:4 mg/kg), and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) for 24 h (magnification:200×)

Discussão

At present, various fluorescent nanomaterials have been designed and synthesized as optical contrast agents for surgical navigation [3, 4]. In 2020, On et al. prepared fluorophore [indocyanine green (ICG) or cyanine 5.5 (Cy5.5)]-conjugated glycol chitosan nanoparticles (CNPs) as a fluorescent contrast agent in lung cancer surgery navigation [18]. However, there are no reports on the preparation of fluorescent contrast agents for lung cancer surgery navigation using Si QDs.

This study successfully synthesized Si QD micelles-CKAP4, which could target the imaging of lung cancer tissues. Si QD micelles-CKAP4 is expected to be used as an optical contrast agent for navigation in lung cancer surgery in the future. The advantages of Si QD micelles-CKAP4 are as follows:(1) We synthesized a fluorescent contrast agent for lung cancer surgery navigation using Si QDs for the first time, which expands the toolbox of the lung cancer surgery navigation tool library. (2) This study optimized water-dispersible Si QD micelles reported by Pi et al. to add targeting ability to Si QD micelles [12]. Thus, it provides a new possibility for applying Si QDs in the biomedical field. (3) The principle of Si QD micelles-CKAP4 targeting lung cancer is based on the high expression of CKAP4 protein in lung cancer tissue. Owing to the conjugation of CKAP4 antibody, Si QD micelles-CKAP4 could actively target lung cancer tissue. Compared with the nanomaterials that passively target tumors via the EPR effect, Si QD micelles-CKAP4 showed stronger specificity to lung cancer tissue. (4) Si QD micelles-CKAP4 showed selective toxicity to tumor cells in a specific range of concentrations. Therefore, Si QD micelles-CKAP4 showed high biological safety in the range of rational drug concentrations, which exhibited its potential clinical application value.

In this study, PL QY tests showed that the absolute PL QY of Si QD micelles was approximately 14.49% and the absolute PL QY of the Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%. A study by Pi et al. showed that the PL QY of dodecyl-Si QDs was approximately 26%, which was very high for Si QDs that emit red light with a PL peak at less than 700 nm [12, 19, 20]. However, the PL QY of the Si QD micelles in this study was approximately 14.49%, which was lower than that of dodecyl-Si QDs. This might be because of the surface defects introduced during the emulsion process, which was nearly consistent with the decrease in PL QY in Si-QD micelles (dodecyl-passivated Si QDs were encapsulated in the micelles self-assembled from F127 in the emulsion) in the study reported by Pi et al. [12, 21]. In this study, the PL QY of Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%, which was slightly higher than that of Si QD micelles (14.49%). This could be because in the Si QD micelles-CKAP4, the coupling of the CKAP4 antibody repaired some surface defects of the Si QD micelles, leading to a slight enhancement of the PL QY.

As we all know, there is a challenge in Si QDs biological imaging applications:Although Si exhibits little cytotoxicity, Si particles may exhibit cytotoxicity as the size decrease to a certain extent. In this study, cytotoxicity tests showed that Si QD micelles-CKAP4 exhibited selective cytotoxicity to lung cancer cells at 9.5–19 µg/mL. Therefore, as a result of CKAP4 antibody conjugation, the cytotoxicity of Si QD micelles-CKAP4 to normal cells was significantly less than that of lung cancer cells, which provides a powerful condition for the biological application of Si QD micelles-CKAP4.

In this study, human lung cancer cell line A549 and human renal epithelial cell line 293 T were used as target cells to investigate the targeting ability of Si QD micelles and Si QD micelles-CKAP4. A549 and 293 T cells were adherent and semi-adherent, respectively. During the experiment, the number of 293 T cells decreased because of repeated centrifugation and washing. Therefore, as shown in Fig. 4, the number of 293 T cells was lower than that of A549 cells.

In addition, it should be noted that A549 cells belong to the p53 wild-type lung cancer cell line. Therefore, only A549 cells cannot fully reflect the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer. Further studies will be conducted to test the targeting ability and imaging effect of Si QD micelles-CKAP4 on p53-negative cell lines (such as H1299) to provide a solid experimental basis for the clinical application of Si QD micelles-CKAP4 [22].

Conclusões

This study improved and modified the Si QD micelles reported by Pi et al. to prepare water-dispersible Si QD micelles-CKAP4. Si QD micelles-CKAP4 were spherical particles with a mean hydrodiameter of approximately 78.8 nm. UV–visible absorption of the Si QD micelles-CKAP4 ranged from 200 to 500 nm. With an excitation wavelength of 330 nm, strong fluorescence at 640 nm was observed in the fluorescence emission spectra. Si QD micelles-CKAP4 exhibited good targeting ability to lung cancer cells and lung cancer tissues both in vitro and in vivo. In addition, the in vivo fluorescence-imaging assay further showed that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. Cytotoxicity and H&E staining assays showed that the Si QD micelles-CKAP4 exhibited high biosafety both in vitro and in vivo. Si QD micelles-CKAP4 is a specifically targeted imaging agent for lung cancer and is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

Disponibilidade de dados e materiais

Os dados e a análise no presente trabalho estão disponíveis com os autores correspondentes mediante solicitação razoável.

Abreviações

Si QD:

Si quantum dot

Si QD micelles-CKAP4:

CKAP4 antibody-conjugated Si quantum dot micelles

Dodecyl-Si QDs:

Dodecyl-passivated Si QDs

BSA:

Albumina sérica bovina

THF:

Tetrahydrofuran

DMEM:

Dulbecco’s modified eagle’s medium

PBS:

Solução salina tampão de fosfato

FBS:

Soro fetal bovino

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

XPS:

espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

XRD:

Difração de raios X

SPF:

Specific pathogen free

DAPI:

4′, 6-Diamidino-2-phenylin-dole

H&E:

Hematoxilina e eosina

Ge N-Channel MOSFETs com ZrO2 Dielectric Alcançando Mobilidade Melhorada Os fotodetectores baseados em heterojunções de monocamada lateral MoS2 / WS2