Síntese mediada por sementes de nanobastões de ouro de razão de aspecto ajustável para imagens fotoacústicas no infravermelho próximo

Resumo

Nanobastões de ouro com razão de aspecto ajustável foram sintetizados por um método de síntese mediado por sementes modificado. O ácido ascórbico foi empregado como um controlador de forma para induzir o crescimento anisotrópico, o que fez a proporção dos nanobastões de ouro sintetizados variar de 8,5 a 15,6. Esses nanobastões possuem banda de absorção de ressonância de plasmon de superfície longitudinal ajustável, cobrindo uma ampla faixa de infravermelho próximo (NIR), de ~ 680 a 1100 nm. Quando modificados com tiol-polietilenoglicol (SH-PEG), os nanobastões de Au sintetizados apresentaram excelente biocompatibilidade e estabilidade, o que prenunciou o grande potencial de sua aplicação NIR como agente de contraste fotoacústico. Devido à sua absorbância ajustável no NIR, os nanobastões de Au sintetizados podem oferecer contraste mais forte (3,1 vezes para o grupo de controle sem agente de contraste usado) e valores de razão sinal-ruído mais altos (SNR; 5,6 vezes para o grupo de controle) em imagens fotoacústicas, experimentos in vitro e in vivo. Nosso trabalho apresentado aqui não só adicionou alguns novos agentes de contraste fotoacústicos à base de Au, mas também descreveu uma possibilidade de preparação de agente de contraste cobrindo toda a janela NIR biológica.

Histórico

Nanoestruturas unidimensionais (1D), como nanofios, nanobastões, nanotubos e nanobelts, são especialmente interessantes porque não são apenas novos blocos de construção básicos para nanodispositivos, mas também possuem alta proporção geométrica produzindo características anisotrópicas para aplicações especiais [1, 2,3,4,5,6]. Entre essas nanoestruturas 1D, os novos nanobastões de metal (NRs) têm atraído interesses crescentes por causa de sua banda de ressonância plasmônica de superfície dependente da forma (SPR) [7, 8], síntese fácil [9,10,11], biocompatibilidade favorável e fácil modificação [12,13,14]. Por exemplo, Yeh et al. relataram uma estrutura in-shell de nanobastões de Au (AuNR) menor que 100 nm, que exibe forte absorvância longitudinal em 600–900 nm e boa aplicabilidade para as terapias fotoinduzidas [8]. Wang et al. construiu com sucesso superestruturas helicoidais AuNR anisotrópicas com quiralidade adaptada, posicionando o AuNR funcionalizado com DNA no origami do padrão “X” projetado do arranjo de fitas de captura de DNA [12].

Além disso, melhorias na síntese e purificação de AuNRs permitiram o ajuste fácil da banda SPR longitudinal, ajustando o comprimento e, portanto, a proporção de aspecto [15,16,17], para aplicações específicas, como imagem fotoacústica (PAI) e foto-induzida terapias [18,19,20,21,22,23], que precisam do SPR longitudinal de Au NRs para cair na janela ótica transparente do tecido biológico (primeiro em 700–950 nm e segundo em 1000–1350 nm) [8 , 18]. Por exemplo, Huang e colegas de trabalho sintetizaram NRs de ouro com proporção de 2,4 a 5,6, que exibiu diagnósticos de células cancerígenas eficientes e terapia fototérmica seletiva [19]. Jokerst et al. desenvolveram NRs de ouro e NRs de ouro revestidos de sílica com proporção de cerca de 3,5, que mostraram alto sinal de PAI para detecção de câncer de ovário e imagem de células-tronco mesenquimais [20, 21]. Yang e colegas de trabalho relataram nanobastões de ouro magnético / PNIPAAmMA para PAI de ressonância magnética dupla e terapia fototérmica direcionada [23]. Embora muitos agentes de contraste baseados em Au NR tenham sido desenvolvidos, uma síntese fácil e escalonável de AuNRs de razão de aspecto grande e ajustável e seu desempenho de PAI dependente do comportamento de absorção ainda permanecem desafios.

Aqui, AuNRs com razão de aspecto de 8,5 a 15,6 foram sintetizados usando o método de crescimento mediado por semente modificado com a ajuda de ácido ascórbico. Os AuNRs demonstraram possuir alta biocompatibilidade e reduziram ainda mais sua citotoxicidade com a modificação de SH-PEG. Beneficiando-se de sua absorvância grande e ajustável na região NIR, os AuNRs sintetizados podem oferecer um contraste mais forte e valores de relação sinal-ruído (SNR) mais elevados no PAI, tanto em experimentos in vitro quanto in vivo. Este método fácil para construir NRs de ouro com razão de aspecto ajustável pode ser utilizado para fabricar agente de contraste sob qualquer comprimento de onda na primeira janela NIR.

Experimental

Síntese de nanobastões de ouro

AuNRs de razão de aspecto ajustável foram sintetizados por um método de síntese mediado por sementes modificado [16, 17]. Em um procedimento típico, um volume de 10,3 mL de 0,025 M HAuCl ₄ (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., ≥ 99,9%) e 3,644 g de surfactante de brometo de cetil trimetilamônio (CTAB) (Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, ≥ 99,0%) foram primeiro adicionados a um copo. Em seguida, água desionizada (18 MΩ) foi adicionada para trazer a concentração de HAuCl ₄ ser 2,5 × 10 ⁻³ M e CTAB de 0,1 M. 10 mL, 4,5 mL, 4,5 mL e 45 mL da solução mencionada acima foram transferidos separadamente para quatro frascos marcados como A, B, C e D. Em seguida, um volume de 350 μL , 0,01 M de NaBH gelado ₄ (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., ≥ 98,0%) foi adicionado ao frasco A e agitado durante 3 min. 0,4 mL de solução do frasco A e 25 μL 0,1 M L (+) - ácido ascórbico (AA) (Tianjin Shentai Chemical Industry Co., Ltd., ≥ 99,7%) foi transferido para o frasco B, agitado por mais 3 min. E então, 0,4 mL de solução do frasco B e 25 μL de 0,1 M AA foram adicionados ao frasco C, agitados por 3 min novamente. Finalmente, 4 mL de solução do frasco C e 250 μL de AA 0,1 M foram adicionados ao frasco D, agitados por 5 s e, em seguida, deixados em banho-maria a 28 ° C por 12 h. A solução de topo foi removida cuidadosamente e o precipitado foi centrifugado e lavado várias vezes com água destilada para garantir que o excesso de CTAB foi totalmente removido. Assim, os produtos finais foram assinados como nanobastões Au típicos (AuTR).

Repita o processo acima e apenas altere a dosagem de AA, e então Au NRs com relação de aspecto de 8,5 a 15,6 podem ser desenvolvidos. Os detalhes são os seguintes:a dosagem de AA é (35 μL, 35 μL, 350 μL) para Au rod1, (30 μL, 30 μL, 300 μL) para Au rod2, (20 μL, 20 μL, 200 μL) para Au rod3 e (15 μL, 15 μL, 150 μL) para Au rod4.

Modificação de superfície de AuNRs

Em primeiro lugar, 10 mg de SH-PEG (Nanjing Pengsheng Biological Technology Co. Ltd) foi dissolvido em 1 mL de água desionizada e sonicado durante 10 min. Em seguida, a solução foi tratada com 50 mL de NaBH 0,1 M ₄ solução sob sonicação por mais 15 min para reduzir o possível SH-PEG dimerizado (PEG-S-S-PEG). Em segundo lugar, os Au NRs limpos foram dispersos em 10 mL de água desionizada e misturados à solução SH-PEG acima (10 mL), agitados por 5 min e, em seguida, colocados sem perturbações por 5 h. Por fim, a amostra foi centrifugada e lavada com água desionizada para posterior aplicação.

Métodos de caracterização

A morfologia e a estrutura dos AuNRs sintetizados foram identificados por microscopia eletrônica de varredura (SEM; JEOL JSM-7001F) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM; JEOL 2100F, 200 kV). As absorvâncias de UV-vis dos vários AuNRs foram medidas por espectrofotômetro (Shimadzu, 3100 UV-vis-NIR). Os sinais fotoacústicos foram registrados pelo sistema de detecção fotoacústica de varredura por rotação da unidade, que contém dispositivo a laser (Surelite I-20, Continuum), oscilador óptico paramétrico (OPO) (Surelite OPO Plus), transdutor ultrassônico não focado (PMUT) (V310- SU, Olympus, 5 Hz), mesa rotativa de etapa do motor e sua caixa de controle do motor (MC) (M600, Beijing Zolix Instrument Co., Ltd.), pré-amplificador (5077PR, Olympus), placa de aquisição de dados PCI4732 (DAQ) e assim sobre.

Experimentos de viabilidade celular

Todos os procedimentos bioexperimentais foram aprovados pelo comitê do IACUC da Universidade de Tecnologia de Taiyuan. E os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.

As células Hela foram cultivadas em meio de células padrão recomendado pela American type culture collection (ATCC), a 37 ° C sob 5% de CO ₂ atmosfera. As células semeadas em placas de 96 poços foram incubadas com diferentes concentrações de AuNR e AuNR-PEG por 24 h. As viabilidades celulares relativas foram determinadas pelo ensaio padrão de metil tiazolil tetrazólio (MTT) e imagens em microscópio óptico.

PAI In Vitro e In Vivo

Dois gramas de agar em pó (Gene Company Ltd.) foram dissolvidos em 100 mL de água desionizada e bem misturados por barra de vidro em um copo. O líquido turvo foi aquecido até à ebulição em um forno de micro-ondas (Midea Group Limited por Share Ltd.). Em seguida, o líquido foi retirado e agitado em banho-maria por 20 min a 60 ° C, até o líquido ficar espesso. Em seguida, os materiais viscosos foram despejados em um molde cilíndrico de 4,5 cm de diâmetro, resfriados e solidificados. Por fim, o ágar coagulado foi utilizado como fantoma de tecido biológico, devido à sua absorbância aproximada aos lasers NIR.

Um capilar de vidro de 0,9 mm de diâmetro foi implantado na superfície do fantasma para simular o vaso sanguíneo, que seria preenchido com sangue fresco de boi, ou sangue misturado com várias concentrações de AuNR-PEG em experimento específico. O fantoma foi colocado sob a água e irradiado por laser de 680 nm ou 800 nm, com densidade de potência de 11 mJ / cm ² .

Narcotize o camundongo com isoflurano transitoriamente, então 0,04 mL / 10 g de hidrato de cloral a 10% em peso foi injetado por via intraperitoneal para fazer a anestesia do camundongo completamente. O cabelo da cabeça do rato foi raspado suavemente e um agente de acoplamento ultrassônico suavemente espalhado (Boline Healthcare Ltd.). O comprimento de onda do laser foi ajustado para 800 nm, e o mouse foi colocado sob a água. Em seguida, os vasos sanguíneos cerebrais do camundongo foram fotografados, antes e depois, e os agentes de contraste (1 nM, 0,1 mL / 10 g) foram injetados por via intravenosa (I.V) no camundongo. O laser foi alterado para 680 nm, e repita o experimento acima. Observação:quando o agente de contraste foi trocado, a injeção I.V deve levar pelo menos 24 horas mais tarde para permitir que o resíduo seja completamente metabolizado.

Resultados e discussões

A morfologia e a estrutura típicas do AuTR foram discutidas sistemicamente por TEM (Fig. 1). Conforme mostrado na Fig. 1a, os AuTR sintetizados (dosagem de AA foi de 25 μL) são homogêneos em forma, com diâmetro de 22 ± 1,5 nm, comprimento de 290 ± 13 nm e relação de aspecto de cerca de 13,2. A Figura 1b mostra uma imagem TEM de alta ampliação de algum AuTR representativo. Uma imagem TEM de alta resolução (HRTEM) da região final de um único nanorod ("1" área retangular na Fig. 1b) é mostrada na Fig. 1c. O resultado mostra que as franjas da rede perpendiculares ao eixo longo do nanorod podem ser discernidas com espaçamentos d de 1,44 Å, correspondendo ao plano da rede (110). O nanorod cresce ao longo da direção [110], conforme determinado pela estrutura cúbica de Au, a partir da análise do padrão de difração de elétrons de área selecionada (SAED) e da imagem HRTEM [16, 17]. Os espectros de absorção de UV-vis de AuTR na Fig. 1d demonstram dois picos de absorção, o pico característico em cerca de 520 nm e o pico longitudinal em cerca de 900 nm. Quando funcionalizada com HS-PEG (a linha vermelha), a banda de absorção mostra um ligeiro declínio (cerca de 5%) na força do pico, mas nenhuma mudança óbvia na posição do pico.

Morfologia e estrutura típicas de nanobastões de Au sintetizados em 25 μL de AA 0,1 M (AuTR): a Imagem TEM de campo claro. b Imagem de amplificação TEM, de uma única haste. c Imagem HRTEM de uma única haste na área retangular “1” do painel b . d Espectros de absorção de UV-vis de AuTR e AuTR-PEG

É bem conhecido que o controle cinético da concentração do monômero e a taxa de crescimento do cristal são os fatores chave para manipular o tamanho das partículas, bem como a forma do material iniciada a partir do crescimento anisotrópico [24, 25]. Assim, neste trabalho, experimentos dependentes da concentração foram realizados para explorar a influência do AA no crescimento anisotrópico de Au NRs. Quando o uso de AA é de 35 μL (0,1 M), a razão de aspecto dos AuNRs sintetizados é de cerca de 8,5 ± 0,6 (Fig. 2a, cerca de 50 AuNRs individuais foram selecionados aleatoriamente para a estatística matemática da razão de aspecto). Reduzindo a dosagem de AA de 35 para 15 μL, a razão de aspecto dos AuNRs aumenta de 8,5 para 15,6 (Fig. 2a-d). Geralmente, o AA é frequentemente usado como agente redutor para reduzir o Au amarelo claro ³⁺ para Au ⁺ e não pode induzir a formação de Au ⁰ nanopartículas [26, 27]. No entanto, em nosso experimento, a razão de aspecto dos AuNRs sintetizados varia com a concentração de AA. Suspeita-se que o AA não esteja apenas atuando como um agente redutor, mas também desempenhando o papel de agente de cobertura para auxiliar na regulação do crescimento anisotrópico de AuNRs em nosso experimento [28,29,30]. Com a redução da concentração de AA no sistema de reação, Au ⁺ Os íons são obrigados a acelerar sua liberação e induzir o rápido crescimento ao longo do eixo longitudinal do Au nanorod (Fig. 2e). A Figura 2f mostra os espectros de absorção de UV-vis de todas as amostras. Com o aumento da relação de aspecto de 8,5 para 15,6, a forte banda de absorção de SPR longitudinal do vermelho AuNRs muda de ~ 680 para 1100 nm, cobrindo uma ampla faixa de NIR (Fig. 2f), indicando seu grande potencial para aplicações biomédicas [31, 32 ]

Estatísticas de morfologia e proporção de aspecto de AuNRs com diferentes dosagens de AA: a – d SEM e histograma, a Rod1, b Rod2, c Rod3 e d Rod4. e O gráfico de linha da dosagem de AA correspondente à relação de aspecto. f Os espectros de absorção de UV-vis de diferentes AuNRs

As propriedades fotoacústicas in vitro de AuNRs foram apresentadas na Fig. 3. As amplitudes fotoacústicas (PA) de AuNRs funcionalizados com HS-PEG foram determinadas em uma série de concentrações dos componentes ópticos de 0,25 a 1,0 nM (Fig. 3a), que mostrou boas relações lineares. AuTR fornece grande aumento no sinal de PA irradiado por laser de 800 nm e Au rod1 a 680 nm. Quando o comprimento de onda do laser foi ajustado inadequadamente (por exemplo, AuTR a 680 nm e Au rod1 a 800 nm), a intensidade do sinal de PA foi fortemente enfraquecida. A Figura 3b mostra as imagens PA de capilares de vidro preenchidos com sangue de boi fresco ou equilíbrio sanguíneo misturado com AuTR 1 nM e Au rod1. Os resultados indicam que b3 (AuTR a 800 nm) e b7 (Au rod1 a 680 nm) têm melhor efeito de imagem. Aparentemente, o agente de contraste apropriado pode fornecer uma absorção mais forte no PAI, resultando em uma resolução mais alta das imagens de PA. A Figura 3c, d, apresenta as comparações quantitativas de sinais fotoacústicos entre sangue puro e sangue misturado com AuTR e rod1. Os resultados mostram que a amplitude do sinal fotoacústico do sangue misturado com AuTR é 2,3 vezes maior do que o sangue puro de boi fresco a 800 nm, e o grupo Au rod1 é 2,1 vezes maior a 680 nm. As grandes melhorias aparecem nas posições de seus picos de absorção longitudinais. Em outras palavras, o comportamento de absorção dos AuNRs domina seu desempenho PAI.

Propriedades fotoacústicas in vitro de AuTR e AuNRs: a intensidade do sinal fotoacústico dependente da concentração de AuTR e Au rod1 irradiados por laser de 800 e 680 nm, respectivamente, b PAI de preenchimento de capilar de vidro com equilíbrio sanguíneo misturado com AuTR 1 nM ou Au rod1 irradiado por laser de 800 e 680 nm, c , d a comparação da amplitude do sinal fotoacústico entre sangue puro e equilíbrio sanguíneo misturado com AuTR 1 nM ou Au rod1 irradiado por laser de 800 e 680 nm, e1 - e6 comparação dos espectros de absorção (linha sólida) de cinco tipos de AuNRs sintetizados e sangue de boi fresco obtido da amplitude de sinais fotoacústicos de vários comprimentos de onda (pontos de dados)

Os espectros fotoacústicos e ópticos de cinco tipos de AuNRs e sangue são mostrados na Fig. 3e1-e6. Os espectros de sinais fotoacústicos de múltiplos comprimentos de onda foram obtidos pela coleta de amplitudes de sinais fotoacústicos em diferentes comprimentos de onda (de 680 a 900 nm) de lasers, com solução aquosa de 1 nM preenchida em tubos capilares de vidro. Claramente, os gráficos indicam uma boa concordância entre os espectros do sinal fotoacústico e os espectros ópticos dos AuNRs. Estes resultados indicam claramente a viabilidade da aplicação de AuNRs em PAI sob lasers de comprimento de onda adequados e fornecem quantitativamente o efeito fotoacústico de AuNRs em vários comprimentos de onda de 680 a 900 nm.

Para examinar a biotoxicidade do AuNR no direcionamento ativo, as células Hela foram incubadas com AuTR com concentrações de 0,25-1,0 nM. O ensaio MTT padrão foi realizado para determinar a viabilidade das células (Fig. 4a). Os resultados confirmam que a combinação de AuTR-PEG induz a maior taxa de sobrevivência celular (95,3% a 1 nM), em comparação com outros grupos em 24 h. Isso sugere que AuNR-PEG possui baixa citotoxicidade celular e boa biocompatibilidade [33, 34] e talvez um agente de contraste fotoacústico promissor. Embora o AuTR puro não tivesse toxicidade significativa (a viabilidade celular pode chegar a 71,2% a 1 nM), a morte celular apareceu nas concentrações de 0,75 e 1,0 nM (Fig. 4b), indicando que a baixa concentração de AuTR é mais adequada para fotoacústica imagem, enquanto a alta concentração pode induzir a morte celular [35, 36]. Portanto, para consideração tanto da eficácia fotoacústica melhorada quanto da biotoxicidade de AuNRs, a concentração de 1 nM foi escolhida como a condição adequada para PAI in vivo.

Viabilidades relativas de células Hela após serem incubadas com várias concentrações de AuTR com e sem PEG modificado em 24 h: a histograma de viabilidades celulares relativas e b imagens de microscopia óptica de células Hela

A imagem fotoacústica é uma modalidade de imagem não invasiva que oferece uma maior profundidade de imagem in vivo e resolução espacial em comparação com outros métodos tradicionais de imagem óptica [37,38,39,40]. Descobrimos que AuNR-PEG com alta absorvância NIR pode ser usado como um grande agente de contraste em imagens fotoacústicas (Fig. 5). A Figura 5a mostra a fotografia dos vasos sanguíneos do cérebro de um camundongo que é selecionado como a amostra de PAI in vivo. A Figura 5b1-b6 apresenta as imagens fotoacústicas dos vasos sangüíneos do cérebro de camundongos para a amostra com e sem aditivos AuNR-PEG, em lasers de comprimento de onda de 800 e 680 nm, respectivamente. Os resultados mostram que antes da injeção de AuNR-PEG, existem apenas formas grosseiras do vaso sanguíneo cerebral principal nas imagens de PA do grupo de controle (Fig. 5b1, b4), e alguns vasos ramificados são misturados no fundo e difíceis de distinguir , não importa o comprimento de onda do laser usado. Quando o agente de contraste (AuTR-PEG e Au rod1-PEG) foi injetado, a qualidade das imagens PA melhorou muito, e alguns vasos finos desaparecidos do cérebro (no grupo de controle) emergiram claramente, especialmente as imagens de AuTR-PEG capturado em 800 nm e Au rod1-PEG em 680 nm.

Fotografia e imagens PA de vasos sanguíneos do cérebro de camundongos: a fotografia de rato cerebrovascular, b Esquema de imagens PA dos vasos sanguíneos cerebrais de camundongo antes e após a injeção intravenosa de AuTR ou Au rod1, irradiado por laser de comprimento de onda de 800 e 680 nm

As imagens fotoacústicas da Fig. 5b1-b6 também foram analisadas quantitativamente (Tabela 1) de aspectos de contraste e relação sinal-ruído (SNR). O contraste médio de toda a imagem correspondente a cada pixel foi calculado a partir de dez pontos, que foram selecionados aleatoriamente na mesma posição dos vasos sangüíneos do cérebro do camundongo. O contraste médio das imagens do grupo de controle é 1,113 na Figura 5b1 e 1,076 na Figura 5b4. Depois de ser injetado com AuNR-PEG, a qualidade de todas as imagens é aprimorada em diferentes graus. No grupo AuTR / 800 nm, a aorta é nítida de se observar (Fig. 5b2), e o contraste médio pode chegar a 3,451, 3,1 vezes para o grupo controle. Em uma comparação paralela com o grupo Au rod1 / 800 nm (Fig. 5b3), o contraste médio é de apenas 1,514, 1,36 vezes para o grupo de controle. Porém, quando o comprimento de onda do laser mudou para 680 nm, o contraste do AuTR é de apenas 1,925, muito menor do que o do Au rod1 (3,692, 3,6 vezes para o grupo controle). O SNR das imagens no grupo AuTR foi otimizado 5,6 vezes a 800 nm para o grupo controle, e o grupo Au rod1 também foi aprimorado 5,7 vezes a 680 nm. Esses resultados são basicamente consistentes com os in vitro, ou seja, as grandes melhorias na qualidade da imagem podem ser atribuídas aos seus respectivos grandes picos de absorção longitudinal.

Conclusões

Com a ajuda do ácido ascórbico, nanobastões de ouro com razão de aspecto ajustável, variando de 8,5 a 15,6, foram sintetizados por um método de síntese mediado por sementes modificado. Esses nanobastões de ouro poderiam fornecer picos de absorção ajustáveis de 680 a 1100 nm, cobrindo a primeira janela NIR biológica. Quando modificados com SH-PEG, os AuNRs sintetizados apresentam excelente biocompatibilidade e estabilidade, o que prenuncia o grande potencial de sua aplicação no infravermelho próximo como agente de contraste fotoacústico. Ambos os experimentos in vitro e in vivo confirmam que os AuNRs sintetizados com razão de aspecto sintonizável podem oferecer contraste mais forte e valores mais altos de SNR no PAI, sob lasers de comprimento de onda adequados. Este trabalho fornece uma maneira possível de sintetizar de forma controlada o agente de contraste em qualquer comprimento de onda na primeira janela NIR e usado para visualizar doenças como hemorragia intracerebral e trombo.

Abreviações

1D:: Unidimensional
AA:: l (+) - ácido ascórbico
AuNR:: Au nanorod
AuTR:: Nanobastões Au típicos
CTAB:: Brometo de cetiltrimetilamónio
DNA:: Ácido desoxirribonucleico
MTT:: Metiltiazolil tetrazólio
NIR:: Próximo ao infravermelho
NRs:: Nanorods
OPO:: Oscilador óptico paramétrico
PA:: Fotoacústica
PAI:: Imagem fotoacústica
SAED:: Difração de elétrons de área selecionada
SEM:: Microscopia eletrônica de varredura
SH-PEG:: Tiol-polietilenoglicol
SNR:: Relação sinal-ruído
SPR:: Ressonância de plasmon de superfície
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão

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