Nanopartículas Multifuncionais Aprimoradas por Ultrassom: Nova Plataforma para Imagem e Terapia Sinérgica do Câncer de Mama Metastático

Resumo

A metástase do câncer de mama tem efeito negativo no prognóstico. Beneficiando-se das notáveis características de penetração profunda e não invasivas, a terapia sonodinâmica (SDT) demonstra uma série de potenciais para o tratamento do câncer. Para superar a limitação da monoterapia, uma nanoplataforma multifuncional foi explorada para realizar eficiência de tratamento sinérgico. Neste trabalho, estabelecemos um novo nanosistema multifuncional que encapsula clorina e6 (Ce6, para SDT), perfluoropentano (PFP, para imagem por ultrassom) e docetaxel (DTX, para quimioterapia) em uma estrutura núcleo-casca de PLGA bem projetada. As nanopartículas sinérgicas Ce6/PFP/DTX/PLGA (NPs CPDP), com excelente biocompatibilidade e estabilidade, permitem sua aplicação futura. Sob irradiação de ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU), a imagem por ultrassom aprimorada pôde ser revelada tanto in vitro quanto in vivo. Mais importante, combinado com LIFU, as nanopartículas exibem capacidade antitumor intrigante através de espécies reativas de oxigênio (ROS) citotóxicas induzidas por Ce6, bem como liberação de DTX para gerar eficiência terapêutica conjunta. Além disso, esta estratégia de tratamento ativa uma forte capacidade anti-metástase, pela qual nódulos metastáticos pulmonares foram significativamente reduzidos. Os resultados indicam que a nanoplataforma orientada para SDT combinada com quimioterapia pode ser fornecida como uma abordagem promissora para elevar a terapia sinérgica eficaz e suprimir a metástase pulmonar do câncer de mama.

Introdução

O câncer de mama assombra mulheres há anos como um dos tumores malignos mais ameaçadores. Devido à alta heterogeneidade e alta capacidade metastática, relata-se que a metástase à distância do câncer de mama responde por mais de 90% de sua mortalidade, enquanto a taxa de sobrevivência de 5 anos de pacientes avançados ou metastáticos é de apenas 26%, resultando em um desfecho clínico ruim [1-3]. A caracterização negativa do câncer de mama torna difícil sua cura completa, impulsionando a estratégia de tratamento a ser mais desafiadora na eliminação do tumor primário e da metástase à distância.

Abordagens terapêuticas tradicionais como cirurgia e quimioterapia ainda são consideradas eficazes no tratamento do câncer de mama [4]. Entre todos os fármacos quimioterápicos, o docetaxel (DTX) desempenha papel significativo no tratamento do câncer de mama metastático (MBC) e câncer de mama avançado (ABC) [5]. Como primeiro fármaco antitumor sintetizado a partir de substâncias químicas da teixo, o efeito antitumoral do DTX é alcançado principalmente pela destruição da mitose e proliferação celular [6]. Devido à sua ampla eficiência antitumoral, o DTX torna-se um dos agentes quimioterápicos mais eficazes no tratamento do câncer de mama [7]. No entanto, agentes quimioterápicos geralmente induzem efeitos indesejáveis e toxicidade sistêmica, que restringem grandemente a eficiência terapêutica [8]. Além disso, diferentes estágios clínicos e várias condições pessoais revelam que uma única abordagem terapêutica pode não ser eficiente o suficiente para atender a todas as expectativas no tratamento do câncer de mama. Portanto, há necessidade urgente de conter o efeito colateral tóxico e aumentar a eficácia do tratamento do DTX em futuras aplicações.

O ultrassom foi explorado inicialmente no diagnóstico clínico devido às suas vantagens extraordinárias, como livre de radiação, não invasividade e custo-efetividade [9, 10]. Apesar das características únicas mencionadas, também ganhou muita atenção nas perspectivas terapêuticas baseadas em materiais nanoestruturados [11]. A terapia sonodinâmica foi inicialmente realizada pela cavitação e "efeito sonoporção" desencadeados pelo ultrassom. A geração de ROS durante este processo induz citotoxicidade em células cancerígenas efetivamente, levando a danos rápidos no DNA e apoptose de células tumorais [9]. Diferente do emprego superficial da terapia fotodinâmica (PDT), a SDT obtém resultado terapêutico mais agradável no tratamento de tumores profundos por ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU), que possui méritos para prevenir lesão térmica indesejada durante o tratamento [12, 13]. Como um dos essenciais na SDT, sonossensibilizadores têm sido explorados em várias terapias tumorais [14]. Clorina e6 (Ce6) foi originalmente empregada como fotossensibilizador comum, mas sua capacidade terapêutica desejável e excelente afinidade ao tecido tumoral a tornaram capaz de atuar também como sonossensibilizador [15]. Como segunda geração da família de clorinas, Ce6 despertou extensa atenção no tratamento de tumores por sua geração desejável de ROS [16]. No entanto, a aplicação única de Ce6 constantemente despertou instabilidade e toxicidade cutânea indesejável, que limitaram a exploração extensiva da SDT.

Nos últimos anos, o desenvolvimento da nanotecnologia desempenhou papel muito importante em muitos campos, incluindo biossensoriamento, poluição ambiental e degradação de contaminantes [17-23]. Nanopartículas baseadas em nanotecnologia têm muitas vantagens, como diâmetro menor, maior área de superfície externa e menor resistência de difusão interna [24]. Anteriormente, nanopartículas foram envolvidas na aplicação de vários materiais como MOF [25], dióxido de titânio [26] e grafeno [21]. A tendência de rápido crescimento da nanotecnologia combinada com tratamento do câncer também foi amplamente explorada, pavimentando um caminho viável na promoção de estratégia terapêutica combinada [27]. Para realizar aplicações terapêuticas tumorais eficazes, nanopartículas delicadamente desenhadas são primariamente definidas para melhorar a eficiência de transporte do agente quimioterápico tóxico via efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR), permitindo maior acúmulo no sítio tumoral [28, 29]. Adicionalmente, o efeito colateral indesejado também poderia ser diminuído através da encapsulação da quimioterapia. Relata-se que o perfluoropentano (PFP) possui capacidade excepcional de transformar da fase líquida para gasosa sob irradiação, podendo ser aplicado como nova sonda molecular ultrassônica, especialmente em imagem e tratamento ultrassônico [30]. Mais importante, a fase líquida inicial permite que PFP seja prontamente encapsulado em vários materiais [31]. Além disso, a encapsulação de PFP pode melhorar grandemente a capacidade de imagem ultrassônica no sítio tumoral de acordo com o efeito EPR mencionado e evitar limitação de tamanho provocada por microbolhas de micrômetros maiores. Exceto para imagem tumoral, a combinação de múltiplas abordagens terapêuticas é de enorme valor no tratamento do câncer orientado por nanosistema. Especificamente, práticas incluindo a integração de terapia sonodinâmica e quimioterapia deram ênfase para revolucionar as eficiências terapêuticas tradicionais. Xu et al. [32] demonstraram que, devido à SDT, um resultado terapêutico aprimorado poderia ser revelado com fármacos quimioterápicos, levando à ativação de apoptose de células tumorais direcionada a mitocôndrias. Este padrão revela o tratamento sinérgico, que é altamente preocupante na utilização futura.

Aqui, com as inspirações mencionadas, pretendemos exercer as nanopartículas tudo-em-um (NPs CPDP) para estabelecer um sistema diagnóstico e terapêutico, realizado pela terapia sinérgica orientada para SDT combinada com quimioterapia, bem como imagem ultrassônica aprimorada. Devido à excelente segurança e estabilidade metabólica ideal como nanocarregador desejável, PLGA tornou-a favorável na exploração de várias capacidades antitumorais [33, 34]. Portanto, nesta estratégia, usando PLGA como material da camada externa, PFP poderia melhorar significativamente a imagem ultrassônica através de sua capacidade de mudança de fase desencadeada por LIFU, enquanto Ce6, um sonossensibilizador de segunda geração desejável, também poderia ser exposto a LIFU para induzir geração de ROS. Adicionalmente, acompanhado pela liberação de DTX, tanto quimioterapia quanto SDT serão realizadas para alcançar uma terapia sinérgica ultimamente. Importante, a estrutura núcleo-casca das NPs CPDP pode ser administrada de forma estável sem ferir tecidos ou células normais e também permite que nanopartículas tenham eficiência de encapsulação relativamente maior [35]. Além disso, conteúdos poderiam ser bem protegidos nesta estrutura núcleo-casca [36-38], especialmente para PFP, que pode ser efetivamente transformado de líquido para gás devido à existência da estrutura. Usando esta estrutura núcleo-casca, a estratégia sinérgica poderia ser demonstrada simultaneamente de forma mais estável. Primeiro, a estratégia sinérgica ajuda a reduzir significativamente o efeito colateral do DTX por encapsulação eficaz, o que é de grande importância para aliviar o sofrimento no tratamento de tumores malignos e agressivos; segundo, comparado com quimioterapia única, a combinação de SDT e quimioterapia foi verificada como estratégia promissora para fortalecer a eficiência terapêutica. Terceiro, a imagem ultrassônica aprimorada realizada por PFP otimizou a estratégia diagnóstica e também ajudou a verificar a eficácia antitumoral. Por último, mas não menos importante, todo o sistema é seguro e estável com excelente biocompatibilidade. É destacado que, nesta estratégia, metástase pulmonar e crescimento tumoral foram notavelmente inibidos tanto in vitro quanto in vivo. Em conclusão, a estratégia sinérgica demonstrou eficácia de tratamento produtiva contra tumor maligno de mama e sua metástase à distância, e combinada com sua capacidade de imagem ultrassônica, pode se tornar estratégia de tratamento promissora em aplicação clínica futura.

Materiais e Métodos

Materiais

PLGA-COOH (Mw 12.000 Da) foi comprado da Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Jinan, China). Perfluoropentano (PFP) e agarose foram obtidos da Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO). Clorina e6 (Ce6) foi comprada da Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Dalian, China). Kit de ensaio de citotoxicidade Cell Counting Kit-8 (CCK-8) foi obtido da Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japão). 2′,7′-Diclorodihidrofluoresceína diacetato (H2DCFDA) foi comprado da MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, EUA). Iodeto de propídio (PI) foi obtido da Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Pequim, China). Annexin V-FITC/PI foi obtido da BD Biosciences (EUA). Docetaxel (DTX) foi comprado da MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, EUA). Todos os outros reagentes foram produtos analiticamente puros sem purificações adicionais. Meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (DMEM), soro fetal bovino e tripsina foram comprados da Gibco (ThermoFisher Scientific, EUA) e espectrofotômetro UV (UV-Vis, Hitachi, Japão).

Síntese de NPs CPDP

Nanopartículas Ce6-PFP-DTX/PLGA (NPs CPDP) foram preparadas por método de dupla emulsão W/O/W de acordo com relato prévio [39, 40]. Brevemente, 2 mg de Ce6 foram primeiramente dissolvidos em 500 μL de metanol. Em seguida, 50 mg de PLGA-COOH e docetaxel (2 mg) foram dissolvidos em 4 mL de diclorometano, e então a solução anterior foi adicionada simultaneamente. Depois, 200 μL de PFP foram adicionados à solução acima. Consequentemente, a mistura foi submetida a uma sonda ultrassônica (Sonics & Materials Inc., EUA) para obter uma primeira emulsão (5 s ligado e 5 s desligado, 3 min). Para adquirir a segunda emulsão, 8 mL de uma solução de poli(álcool vinílico) (PVA) (p/v = 4%) foram adicionados à emulsão acima, usando a mesma sonda ultrassônica por 2 min. Após adicionar 10 mL de álcool isopropílico 2% na emulsão final, a solução foi misturada sob temperatura ambiente mecanicamente por pelo menos 4 h para fazer o diclorometano volatilizar totalmente. Finalmente, NPs CPDP foram centrifugadas três vezes (12.000 rpm, 5 min) e então coletadas e armazenadas a 4 °C para uso posterior. NPs PDP foram preparadas da mesma forma, exceto pelo Ce6. Todos os processos experimentais foram operados sobre gelo e conduzidos estritamente no escuro.

Caracterização de NPs CPDP

O tamanho de partícula e potencial zeta de NPs CPDP e NPs PDP foram realizados por instrumento Malvern Zetasizer Nano (Malvern, Reino Unido). A morfologia foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e microscopia óptica. Para avaliar a estabilidade, NPs CPDP foram dissolvidas em solução tampão fosfato (PBS) e medidos os tamanhos por 7 dias, respectivamente. Cada amostra foi medida em triplicata. A eficiência de encapsulação de NPs CPDP foi calculada através da seguinte fórmula:

Eficiência de encapsulação (%) = (Peso de DTX ou Ce6 carregado / Peso total de DTX ou Ce6) × 100%. Para verificar a encapsulação dos vários materiais, espectros UV-Vis de várias amostras foram investigados (UH5300, Hitachi). A encapsulação eficaz também foi analisada por TEM.

Taxa de Liberação de Fármaco de NPs CPDP

Para avaliar a capacidade de liberação de fármaco de Ce6 e DTX em NPs CPDP, duas soluções com pHs diferentes (solução tampão fosfato, PBS: 7,4, solução tampão acetato, ABS: 5,6) foram utilizadas para testar a eficiência de liberação cumulativa. Brevemente, NPs CPDP foram primeiramente dispersas com 1 mL de PBS ou ABS após a mistura ser selada em uma bolsa de diálise (Mw: 10.000); a solução inteira foi então transferida para um frasco de vidro (volume total: 150 mL) no qual 149 mL de PBS ou ABS foram adicionados para manter o volume total da solução em 150 mL. O frasco de vidro foi então colocado em um agitador de temperatura constante a 37 °C, e em diferentes períodos (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h), a solução foi coletada e imediatamente suplementada com o mesmo volume de meio. Cada grupo foi repetido três vezes. Finalmente, as concentrações de Ce6 e DTX foram medidas por Synergy Hybrid Multi-Mode Read (BioTek, EUA) a 403 e 229 nm, respectivamente, e a taxa de liberação de fármaco em cada ponto de tempo foi calculada.

Imagem Ultrassônica In Vitro

Para investigar a capacidade ultrassônica de NPs CPDP, a emulsão (1 mg/mL) foi primeiramente submetida a um equipamento de transdutor de ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU) (Centro de Pesquisa de Engenharia Médica Ultrassônica Ronghai, Chongqing, China), e o padrão de condução foi definido como ciclo de trabalho 50%, duração de pulso 1 s sob diferentes intensidades (1-2 W/cm²) por diferentes tempos de duração. Para imagem ultrassônica, NPs CPDP irradiadas foram adicionadas ao modelo de agarose preparado anteriormente, respectivamente, usando instrumento de diagnóstico ultrassônico Philips EPIQ5 (frequência da sonda: 12 MHz, MI: 0,06) para observar tanto imagem 2D quanto CEUS de NPs CPDP. Enquanto isso, software ImageJ foi aplicado para analisar o valor de escala de cinza de cada grupo.

Captação Celular e Geração de ROS In Vitro de NPs CPDP por Irradiação LIFU

A linhagem de células de câncer de mama murino 4T1 foi obtida do banco de células de Xangai da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) e incubada em meio RPMI 1640 misturado com 10% FBS e 1% estreptomicina/penicilina a 37 °C em incubadora umidificada com 5% CO₂.

Células 4T1 foram primeiramente incubadas na condição anterior a uma densidade de 1 × 10⁴ células por prato para testar a captação celular usando CLSM em diferentes intervalos de tempo (1 h, 2 h, 4 h, 8 h). Para verificar a geração de ROS, células foram separadas nos seguintes 5 grupos: controle, NPs CPDP, LIFU, Ce6 + LIFU, NPs CPDP + LIFU. Após cultura convencional de 24 h, o meio foi substituído por NPs CPDP (200 μL, 0,8 mg/mL) ou solução de Ce6 (200 μL), respectivamente, e as células foram co-incubadas por mais 3 h. Então, irradiação LIFU (2 W/cm², 120 s) foi conduzida, respectivamente, de acordo com diferentes grupos. Após co-incubação e tratamento LIFU, 100 μL de solução diluída de DCFH-DA foi adicionada, e cada grupo foi cultivado na incubadora anterior por 15 min. Um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) foi usado para confirmar o resultado da produção de espécies reativas de oxigênio, e as intensidades de fluorescência correspondentes foram medidas pelo software ImageJ.

Citotoxicidade In Vitro e Capacidade de Tratamento Conjunto de NPs CPDP

Um ensaio CCK-8 foi aplicado para avaliar a citotoxicidade de NPs CPDP. Brevemente, células de câncer de mama murino 4T1 foram incubadas em placa de 96 poços, com densidade de 1 × 10⁴ por poço por 24 h. Então, NPs CPDP foram diluídas com meio RPMI 1640 livre de soro em várias concentrações (0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 mg/mL, n = 3), com ou sem irradiação LIFU (2 W/cm², 120 s). Após outro processo de co-cultura de 24 h, a viabilidade celular de células 4T1 foi realizada.

Para avaliar a eficiência de apoptose celular do tratamento conjunto, células 4T1 foram co-cultivadas como anterior por 24 h e então separadas em cinco grupos: (1) controle (sem qualquer tratamento), (2) LIFU (apenas com exposição LIFU a 2 W/cm²), (3) NPs CPDP (apenas com solução de NPs CPDP a 0,8 mg/mL), (4) NPs PDP + LIFU e (5) NPs CPDP + LIFU. Após várias co-incubação de nanopartículas (200 μL) e exposição LIFU, cada grupo foi tratado com coloração dupla de annexin V (5 μL) e iodeto de propídio (5 μL) por 20 min e analisado através de protocolo de citometria de fluxo.

Inibição In Vitro de Metástase Celular

Para investigar a inibição da capacidade metastática celular, ensaios de cicatrização de ferida e transwell foram desenhados. Para ensaio de cicatrização de ferida, células 4T1 foram cultivadas convencionalmente como anterior em placa de 6 poços. Após crescimento celular até 80% de confluência, uma ponta de pipeta (10 μL) foi aplicada para conduzir um arranhão artificial ao longo do centro da placa de 6 poços. Então, células foram tratadas nos mesmos grupos mencionados acima. Após co-incubação contínua por 24 h, as células foram lavadas com PBS 3 vezes e observadas sob microscopia óptica (Olympus, Japão).

Para ensaio transwell, o compartimento superior da câmara transwell (Corning, San Diego, EUA) foi primariamente aplicado para imitar a matriz extracelular in vivo. Células 4T1 a uma densidade de 1 × 10⁵ células por poço foram semeadas na câmara superior em meio RPMI 1640 livre de soro, enquanto o compartimento inferior foi preenchido com meio de cultura completo misturado com 10% FBS. Então, células foram separadas como os mesmos grupos acima e tratadas por 24 h, respectivamente. Após isso, células na superfície inferior foram fixadas com paraformaldeído e coradas com violeta de cristal. Os resultados foram observados com microscopia de luz (Olympus, Japão).

Imagem Ultrassônica In Vivo

Camundongos fêmeas BALB/c saudáveis (4 semanas) e camundongos Kunming (4 semanas) foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Médica de Ningxia. Todos os experimentos com animais foram conduzidos sob a diretriz aprovada pelo Comitê de Revisão Ética de Bem-Estar Animal da Universidade Médica de Ningxia. Para estabelecer o modelo de camundongos portadores de tumor, camundongos BALB/c foram inoculados com células de câncer de mama 4T1 (1 × 10⁷/mL) no flanco direito. Após o tamanho do tumor crescer para 60-80 mm³, camundongos BALB/c foram injetados com NPs CPDP (200 μL, 1 mg/mL) através da veia da cauda intravenosamente. 24 h depois, sítios tumorais dos camundongos foram conduzidos com LIFU (2 W/cm², 120 s), e então a imagem 2D e CEUS foram adquiridas através do instrumento de diagnóstico ultrassônico Philips EPIQ5 mencionado anteriormente. A análise de escala de cinza foi medida pelo software ImageJ.

Eficiência Terapêutica Sinérgica In Vivo de NPs CPDP

Após inoculação de células cancerígenas 4T1, o tamanho do tumor foi registrado a cada dois dias, e o volume do tumor foi calculado pela fórmula: Volume = 1/2 × Comprimento × Largura². Tamanho do tumor e peso corporal dos camundongos foram registrados a cada 2 dias, enquanto as fotos do crescimento do tumor foram registradas a cada 3 dias. Quando o volume do tumor atingiu 60-80 mm³, camundongos com tamanho de tumor semelhante foram aleatoriamente divididos nos mesmos cinco grupos: controle, LIFU, NPs CPDP, NPs PDP + LIFU, e NPs CPDP + LIFU (n = 3). Cada grupo foi injetado intravenosamente com várias NPs (200 μL) via veia da cauda, exceto grupo controle (200 μL PBS em vez). Vinte e quatro horas depois, o sítio tumoral foi exposto com irradiação LIFU (2 W/cm²) por 120 s. Toda a administração SDT foi repetida a cada 3 dias e durou 18 dias. O peso corporal e volume do tumor dos camundongos foram medidos e calculados. Após o tratamento, camundongos foram sacrificados e tecidos tumorais foram enviados para H&E, TUNEL e PCNA para análise histológica adicional.

Biossegurança de NPs CPDP In Vivo

Para investigar a biossegurança de nanopartículas CPDP in vivo, camundongos fêmeas Kunming saudáveis (n = 3) foram separados nos seguintes 4 grupos: controle, 5 mg/mL, 10 mg/mL e 20 mg/mL. NPs CPDP (200 μL) foram injetadas através da veia da cauda dos camundongos; então, os camundongos tiveram acesso livre a comida e água sem qualquer administração adicional. O peso corporal dos camundongos foi medido a cada 2 dias. Após 30 dias, camundongos foram sacrificados e amostras de sangue foram coletadas para análise de células sanguíneas e bioquímica. Os órgãos principais (coração, fígado, baço, pulmão e rim) foram coletados e investigados para coloração H&E, respectivamente.

Inibição In Vivo de Metástase Pulmonar

Para avaliar a inibição de metástase pulmonar de cada grupo, todo o processo foi conduzido observando o número de nódulos metastáticos no pulmão, bem como avaliação histológica de coloração H&E. Após todos os camundongos serem eutanasiados, os tecidos pulmonares foram removidos e fixados; então, fotografias de nódulos cancerígenos foram tiradas e tecidos pulmonares foram analisados com coloração H&E.

Análise Estatística

Dados de medição foram todos realizados 3 vezes e expressos como média ± desvio padrão (DP) e analisados por ANOVA one-way ou teste t de Student padrão através do software SPSS (versão: 19.0), enquanto valor p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização de NPs CPDP e Eficiência de Liberação de Fármaco

Um método de dupla emulsão foi aplicado na fabricação de NPs CPDP, que encapsulou simultaneamente material de mudança de fase PFP, sonossensibilizador Ce6 e fármaco quimioterápico DTX. Quando dispersas em PBS ou água deionizada, a solução apresentou aparência cinza-clara. NPs CPDP exibiram forma esférica homogênea e estrutura núcleo-casca clara, seja observada via microscopia óptica ou microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 1a, b). Os diâmetros médios de NPs CPDP e NPs PDP foram 249,5 ± 77,46 nm e 246,6 ± 81,01 nm, e os potenciais zeta médios de superfície foram -18,47 ± 0,55 mV e -3,987 ± 0,66 mV, respectivamente (Fig. 1c, d). O tamanho de NPs CPDP garantiu que pudesse ser acumulado no sítio tumoral passivamente através do efeito EPR [40]. A carga diferente entre NPs CPDP e NPs PDP é principalmente devida ao Ce6 carregado negativamente [41]. Além disso, o potencial zeta negativo de NPs CPDP indicou menor adsorção de proteína plasmática, verificando a estabilidade relativa das nanopartículas. As distribuições de tamanho de partícula foram mantidas entre uma faixa de 249,5 e 385,1 nm em 7 dias (Fig. 1e), demonstrando a estabilidade relativa de NPs CPDP. De acordo com a curva padrão, a eficiência de encapsulação de DTX e Ce6 foi 83,84 ± 1,39% e 60,54 ± 3,79%, respectivamente.

Conforme a eficiência de liberação de fármaco de Ce6 e DTX de NPs CPDP indicada na Fig. 1f, g, um aumento de quase duas vezes no índice de liberação de DTX foi registrado a pH 5,5 comparado com nanopartículas dissolvidas em pH 7,4, o que indicou que a taxa razoável de liberação de DTX poderia ser alcançada efetivamente em um microambiente tumoral ácido. Os resultados acima todos exibiram que as NPs CPDP delicadamente desenhadas podem exercer uma liberação estável e oportuna de fármaco quimioterápico no ambiente tumoral ácido, e também fundamentalmente desejável para ser preparada para SDT.

Conforme o UV-Vis exibiu, DTX e Ce6 revelaram picos de absorção únicos em 229 nm e 403 nm, respectivamente, e, ao contrário, PFP/PLGA não mostrou nenhum dos picos. Deve-se notar que o espectro de NPs CPDP exibiu picos semelhantes ambos próximos aos dois comprimentos de onda acima, enquanto o resto mostrou a mesma tendência do espectro PFP/PLGA, indicando a encapsulação bem-sucedida dos vários materiais (Fig. 1h). Para verificar ainda mais a encapsulação eficaz, Fig. 1i indicou que a nanopartícula PFP/PLGA possui casca muito mais fina e núcleo redondo, enquanto a nanopartícula CPDP revela casca relativamente mais espessa e núcleo ovalado devido à encapsulação de ambos DTX e Ce6.

Imagem Ultrassônica In Vitro

É destacado que PFP possui excelente capacidade de mudança de fase. A transformação líquido-gás não apenas ajuda nanopartículas a agregarem dentro do sítio tumoral, mas também concede sua capacidade de melhorar a eficiência de imagem ultrassônica [42]. Para demonstrar isso, irradiação LIFU foi aplicada como gatilho para induzir a transformação de fase de PFP, ou seja, o efeito de vaporização de gota acústica (ADV) [43]. Os resultados mostraram que as intensidades de escala de cinza foram mantidas em nível relativamente baixo antes da irradiação LIFU, enquanto após o aumento da intensidade e tempo de irradiação de LIFU, a tendência de imagem ultrassônica aprimorada foi revelada tanto em 2D quanto em CEUS (Fig. 2a). A análise acústica do ImageJ convenceu ainda mais o resultado pelo valor de escala de cinza elevado (Fig. 2b, c), que foi consistente com os achados de imagem. Deve-se notar que o resultado mais significativo de 2D e CEUS foi obtido quando a intensidade de LIFU atingiu 2 W/cm² e durou 120 s. Os resultados acima demonstraram que PFP foi encapsulado com sucesso em NPs CPDP, e a capacidade de imagem ultrassônica foi significativamente promovida sob maior intensidade e tempo mais longo de administração de LIFU.

Captação Celular e Geração de ROS In Vitro de NPs CPDP por Irradiação LIFU

Conforme o resultado de CLSM mostrado na Fig. 3, a captação celular de NPs CPDP exibiu tendência aprimorada em diferentes intervalos de tempo, atingindo a agregação mais significativa na co-incubação de 8 h.

A principal estratégia da terapia sonodinâmica (SDT) é a geração de ROS - uma série de produtos de redução de elétron único - para induzir apoptose de células cancerígenas e inibir proliferação celular [44]. É destacado que quando exposto a ultrassom, o sonossensibilizador tende a desencadear produção de ROS; enquanto isso, uma quantidade considerável de energia será liberada durante todo o processo [45]. Dado que tanto ultrassom quanto sonossensibilizador são elementos dispensáveis para promover SDT, portanto, a geração intracelular de ROS foi desenhada e analisada para investigar as diferenças entre grupos divididos. De acordo com a Fig. 4a, a quantidade de ROS gerada pelo grupo Ce6 livre mais irradiação LIFU foi desprezível, o que pode ser porque o metabolismo rápido de Ce6 livre leva a uma produção de ROS insatisfatória. Ao contrário, a intensidade fluorescente mais forte foi revelada pelo grupo NPs CPDP + LIFU. Assumiu-se que o Ce6 encapsulado foi bem protegido e, assim, mantido longe de ser metabolizado. Como consequência, após estimulação LIFU, Ce6 foi liberado para produzir ROS abundantes. Comparativamente, não foram encontrados sinais fluorescentes significativos em outros grupos (Fig. 4b).

Citotoxicidade In Vitro e Capacidade de Tratamento Conjunto de NPs CPDP

O ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) foi introduzido para testar a citotoxicidade in vitro de NPs CPDP. Neste aspecto, diferentes grupos foram desenhados com ou sem irradiação LIFU em diferentes concentrações. Os resultados indicaram que após co-incubação de 24 h sem exposição LIFU, não houve efeito óbvio da taxa de sobrevivência de NPs CPDP mesmo na concentração mais alta (0,8 mg/mL), demonstrando a biossegurança desejável de NPs CPDP (Fig. 5a). Por outro lado, mostrou que houve uma diminuição marcante da viabilidade celular após irradiação LIFU, mostrando que a combinação de NPs CPDP e LIFU desencadeou notavelmente a morte de células 4T1, o que foi consistente com a geração de ROS in vitro.

Para avaliar ainda mais a eficácia da SDT, um ensaio de citometria de fluxo foi introduzido. Conforme os resultados mostrados na Fig. 5b, c, o índice de necrose e apoptose celular foi mais alto observado no grupo NPs CPDP + LIFU, enquanto outros grupos não mostraram necrose e apoptose óbvias. Notavelmente, a taxa de necrose e apoptose do grupo NPs CPDP + LIFU foi três vezes maior que a do grupo apenas NPs CPDP, o que assegurou a eficiência significativa de morte de células tumorais da SDT de outro aspecto. Intrigantemente, comparado com grupo NPs PDP + LIFU, a taxa de necrose e apoptose celular no grupo NPs CPDP + LIFU foi significativamente aumentada, exibindo a eficiência de terapia sinérgica de SDT e quimioterapia.

Inibição In Vitro de Metástase Celular

A capacidade invasiva e de migração de células tumorais são indispensáveis na progressão tumoral [46, 47]. Como mostrado na Fig. 6a, o fechamento entre a lacuna física do grupo NPs CPDP + LIFU foi significativamente mais amplo que outros grupos, indicando velocidade relativamente menor de eficiência de migração. De acordo com a análise do software ImageJ (Fig. 6c), a taxa de migração do grupo NPs CPDP + LIFU também foi notavelmente reduzida comparada com outros grupos.

Similarmente no ensaio transwell, comparado com a velocidade rápida de migração de outros grupos, grupo NPs CPDP + LIFU revelou redução significativa do número de células (Fig. 6b), demonstrando excelente capacidade anti-migração da terapia sinérgica. Especificamente, com a ausência de SDT (grupos apenas NPs CPDP e apenas LIFU), o número de células tumorais foi levemente diminuído (Fig. 6d). No geral, devido à combinação de SDT e quimioterapia, a metástase de células 4T1 foi notavelmente inibida in vitro.

Imagem Ultrassônica In Vivo

Como PFP foi encapsulado em NPs CPDP, também é necessário avaliar a capacidade característica de imagem ultrassônica in vivo. Após injeção via veia da cauda de NPs CPDP, LIFU foi então aplicado ao sítio tumoral para adquirir tanto imagem 2D quanto CEUS (Fig. 7a). A diferença gráfica clara entre os dois grupos indicou que após irradiação LIFU, a intensidade correspondente de NPs CPDP foi elevada obviamente comparada com o grupo pré-irradiação. Dados adicionais da intensidade média de eco também confirmaram este resultado, que também foi consistente com o resultado de imagem in vitro anteriormente (Fig. 7b, c).

Eficiência Terapêutica Sinérgica In Vivo de NPs CPDP

Vendo da Fig. 8a, b, o volume do tumor do grupo NPs CPDP + LIFU foi significativamente menor após 18 dias de tratamento que o de outros grupos, o que pode atribuir-se à eficácia de ROS originados do tratamento SDT, bem como quimioterapia para exercer uma eficiência de terapia sinérgica válida. Similarmente, fotografias de camundongos portadores de tumores (Fig. 8a) também mostraram a mesma tendência, verificando a eficácia de tratamento cooperativo de NPs CPDP desencadeada por exposição LIFU. Além disso, não houve redução óbvia de peso dos camundongos entre diferentes grupos (Fig. 8c). Os resultados acima todos indicaram uma taxa de inibição muito maior do grupo NPs CPDP + LIFU, revelando que a terapia sinérgica poderia prevenir significativamente o crescimento tumoral.

Para testar ainda mais os resultados terapêuticos de todos os grupos, tanto colorações H&E, PCNA quanto TUNEL foram utilizadas (Fig. 8d). A taxa de proliferação de PCNA no grupo NPs CPDP + LIFU foi apenas 20,50%, que foi quatro vezes menor que grupo controle, três vezes menor que grupos apenas LIFU e apenas NPs CPDP e duas vezes menor que grupo NPs PDP + LIFU, respectivamente, demonstrando taxa significativa de anti-proliferação tumoral (Fig. 8e). Como mostrado na Fig. 8d, f, os resultados TUNEL indicaram que grupo NPs CPDP + LIFU exibiu índice apoptótico óbvio de 72,86%, que foi muito maior que controle (9,66%), LIFU (12,86%), NPs CPDP (19,59%) e grupo NPs PDP + LIFU (37,06%). Os resultados acima todos demonstraram a eficácia da terapia sinérgica exercida in vivo, que também foi provada consistente com os resultados in vitro anteriores.

Biossegurança de NPs CPDP In Vivo

Apesar do resultado terapêutico eficaz, é de grande importância explorar a biossegurança das nanopartículas recém-estabelecidas também. Em nome da distribuição segura de NPs CPDP in vivo, a segurança metabólica foi conduzida. Os resultados mostraram que, em vez de perda aparente de peso corporal, o peso corporal dos camundongos elevou gradualmente em todos os grupos de camundongos (Fig. 9a), o que indicou influência negativa desprezível de NPs CPDP. Além disso, como vários órgãos e amostras de sangue exibidos na Fig. 9b, nenhuma mudança significativa foi observada em células sanguíneas, índice de análise bioquímica e coloração H&E (Fig. 9c) entre diferentes grupos de tratamento, indicando a excelente biossegurança de NPs CPDP in vivo.

Inibição In Vivo de Metástase Pulmonar

É bem estabelecido que o pulmão é o órgão-alvo principal para metástase à distância do câncer de mama [48]. Para avaliar a eficiência supressora de metástase, tecidos pulmonares de camundongos foram utilizados para investigação anti-metastática. Como visto na Fig. 10a, b, comparado com controle, LIFU, NPs CPDP e grupo NPs PDP + LIFU, o grupo NPs CPDP + LIFU exibiu a diminuição mais notável de nódulos pulmonares, sugerindo sua eficiência desejável de inibição metastática pulmonar. Tendência similar de diminuição também indicada por coloração H&E (Fig. 10c), que em tudo demonstrou que esta estratégia de terapia sinérgica poderia exercer esforço efetivo na eliminação de metástase pulmonar em camundongos.

Discussão

Foi amplamente reconhecido que a metástase do câncer de mama influenciará extensivamente seu prognóstico ruim [3, 49]. Como abordagem terapêutica desejável, SDT pode servir por sua alta eficiência e capacidade de penetração profunda foi extensivamente convencida [11, 50]. Admitidamente, como certas limitações existem na aplicação única de sonossensibilizadores, usar SDT sozinha ainda pode ser menos suficiente na exploração futura do câncer. O desenvolvimento de nanotecnologia combinada com medicina clínica foi promovido significativamente nos últimos anos, devido aos méritos inspiradores como toxicidade desprezível, não invasividade e excelente biocompatibilidade. Usando esta nova abordagem, pesquisadores fizeram muitos esforços na exploração de estratégias terapêuticas multifuncionais para aumentar a eficiência antitumoral.

A biossegurança é a prioridade de nanoagentes. Como material amplamente aceito aprovado pela certificação Food and Drug Administration (FDA), é destacado que PLGA poderia ser realizado como carregador desejável em aplicação [51, 52]. Baseado em suas vantagens, estabelecemos um nanosistema para realizar eficiência de terapia multifuncional, explorando PLGA como estrutura externa para encapsular sonossensibilizador Ce6, material de mudança de fase PFP e agente quimioterápico DTX. As nanopartículas CPDP (NPs CPDP) foram primariamente observadas pela estrutura núcleo-casca e tamanho apropriado para que uma agregação desejável através do efeito EPR pudesse ser alcançada. A viabilidade celular de NPs CPDP foi provada ser acima de 80% após co-incubação de 24 h, indicando a boa segurança desta nanoplataforma. Além disso, a transformação de fase de PFP encapsulado também garantiu NPs CPDP como agente de realce de contraste quando ativado por LIFU. A capacidade aprimorada de imagem ultrassônica não apenas garantirá a janela terapêutica ideal, mas também promoverá o futuro promissor para NPs CPDP realizar uma integração de diagnóstico preciso e tratamento preciso.

A estratégia chave na SDT é a geração de ROS. Comparado com o emprego único de Ce6, o Ce6 encapsulado em PLGA exerceu uma proteção desejável, que pôde ser verificada pelo resultado de ROS. Em nosso estudo, houve apenas quantidade desprezível de ROS gerada por uso único de Ce6, enquanto Ce6 encapsulado em nanopartículas produziu quantidade considerável de ROS, que foi ainda provada pela eficiência da SDT. O resultado indicou que a geração de ROS foi preservada pelo Ce6 encapsulado em NPs CPDP, que poderia estabelecer base firme para posterior inibição tumoral. Além disso, a taxa de liberação de fármaco mostrou que mesmo a pH 5,5, pouco Ce6 foi liberado das nanopartículas, demonstrando uma boa proteção do sonossensibilizador por PLGA, que foi ainda provada pela produção de ROS e resultado de SDT com alta eficiência. Curiosamente, a eficiência de liberação de fármaco de DTX e Ce6 a pH 5,5 foi bastante diferente de acordo com os resultados (mais de 40% e cerca de 20%, respectivamente), o que pode possivelmente causar pela diversa eficiência de encapsulação dos dois fármacos. A taxa menor de liberação de Ce6 demonstrou que ele poderia ser efetivamente protegido em PLGA para que geração substancial de ROS através de estimulação LIFU pudesse ser alcançada para obter eficiência SDT mais convincente. Outra razão para esta diferença pode ser devida aos diferentes solventes dos dois fármacos durante o processo de preparação. Especificamente, DTX e PLGA foram diretamente dissolvidos em diclorometano, enquanto Ce6 precisou ser primeiro dissolvido em metanol e então adicionado gota a gota ao diclorometano, devido à sua baixa solubilidade no último [53]. Como a liberação de fármaco em nanopartículas está diretamente relacionada à eficácia da terapia de combinação subsequente, a avaliação da taxa de liberação de fármaco, bem como resultado de geração de ROS, provaram mutuamente este ponto. Pesquisas atuais sugeriram que usar quimioterapia sozinha pode não reverter significativamente a progressão tumoral [41]. Neste estudo, a nanoplataforma que desenhamos demonstrou forte evidência de que, comparado com o emprego único de quimioterapia, o tratamento sinérgico elevou notavelmente a eficiência terapêutica tanto in vitro quanto in vivo. Como a estimulação LIFU otimizou a estratégia terapêutica, uma taxa aumentada de apoptose celular foi notavelmente elevada. Vale notar que, devido a esta estratégia sinérgica, a metástase pulmonar pôde ser significativamente inibida tanto no nível de célula tumoral quanto no modelo de camundongos inoculados, o que é consistente com relatos prévios [16, 52].

Conclusão

Em conclusão, as NPs CPDP seguras e estáveis que desenhamos e preparamos mais irradiação LIFU poderiam eliminar notavelmente a progressão do tumor de mama e sua metástase pulmonar. Com capacidade de imagem aprimorada, esta nanoplataforma também foi considerada um agente de realce de contraste promissor em clínica. Portanto, a nova estratégia sinérgica combinada com LIFU pode ser considerada como uma aplicação de tratamento eficaz para reverter o desfecho ruim do câncer de mama metastático.

Abreviações

LIFU:

Ultrassom focalizado de baixa intensidade

SDT:

Terapia sonodinâmica

PFP:

Perfluoropentano

EPR:

Efeito de permeabilidade e retenção aprimorada

DCFH-DA:

Diclorodihidrofluoresceína diacetato

PI:

Iodeto de propídio

TEM:

Microscópio eletrônico de transmissão

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

Ce6:

Clorina e6

DTX:

Docetaxel

FBS:

Soro fetal bovino

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CPDP NPs:

Nanopartículas Ce6/PFP/DTX/PLGA

PDP NPs:

Nanopartículas PFP/DTX/PLGA