Adaptação de perturbações morfomecânicas celulares por meio de nanopartículas de óxido metálico

Resumo

O uso crescente hoje em dia de nanopartículas (NPs) em produtos comerciais não corresponde a um entendimento abrangente de sua potencial nocividade. Mais investigações in vitro são necessárias para abordar como as propriedades físico-químicas dos NPs guiam seu envolvimento nas células e seu tráfego intracelular, destino e toxicidade. Essas interações nanobio ainda não foram amplamente abordadas, especialmente do ponto de vista mecânico. A mecânica celular é um indicador crítico da saúde celular porque regula processos como a migração celular, a integridade do tecido e a diferenciação por meio de rearranjos do citoesqueleto. Aqui, investigamos in vitro a perturbação da elasticidade das linhas celulares Caco-2 e A549, em termos de modificação do módulo de Young induzida por SiO ₂ NP _S e TiO ₂ NP _S . TiO ₂ NPs demonstraram efeitos mais fortes na elasticidade celular em comparação com SiO ₂ NPs, uma vez que induziram mudanças morfológicas e morfométricas significativas na rede de actina. TiO ₂ NP _S aumentou a elasticidade nas células Caco-2, enquanto efeitos opostos foram observados nas células A549. Esses resultados demonstram a existência de uma correlação entre a alteração da elasticidade celular e a toxicidade dos NPs que depende, por sua vez, das propriedades físico-químicas dos NPs e da célula específica testada.

Histórico

O grande uso de nanopartículas projetadas (ENPs) em produtos comerciais está aumentando a conscientização sobre seu potencial de toxicidade para os humanos e o meio ambiente [1]. Muitas investigações in vitro e in vivo foram conduzidas até agora com o objetivo de lançar luz sobre os mecanismos moleculares de toxicidade [2, 3]. No entanto, a compreensão das interações entre nanopartículas (NPs) e organismos vivos é bastante difícil devido à falta de procedimentos operacionais padronizados, o que resultou nos dados atuais controversos da literatura disponíveis [4, 5]. Está estabelecido que os efeitos adversos dos NPs dependem estritamente de suas propriedades físico-químicas e da célula ou organismo específico testado [6]. Por esse motivo, a caracterização de NPs é fundamental para se obter dados confiáveis [7]. NPs de óxido metálico são amplamente difundidos em produtos comerciais [8]. Entre estes, amorfo SiO ₂ NPs e TiO cristalino ₂ NPs são usados em uma ampla gama de campos industriais como aditivos para medicamentos e cosméticos e em produtos de saúde, toners para impressoras, tintas, embalagens de alimentos e aditivos alimentares [9, 10]. Portanto, é provável que esses NPs possam acessar organismos vivos por diferentes rotas (ingestão, inalação e penetração dérmica) [11]. Os exemplos são, mas não se restringem a, produtos alimentícios baseados no TiO ₂ NPs (rotulados como E171 em rótulo comercial) e SiO ₂ NPs (E551, E554, E556 em rótulo comercial), que tiveram um grande crescimento [12,13,14]. Os estudos atuais sobre SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs sugerem que interferem ativamente com mecanismos celulares cruciais. Por exemplo, eles provaram que estimulam a liberação de citocinas (promovendo assim a inflamação) [15,16,17] para danificar os microvilos intestinais [18, 19], induzem a produção de ROS [20], inibem a síntese de ATP [21] e induzem genotoxicidade [22,23,24,25,26]. No entanto, poucos estudos exploraram se esses NPs interagem com a mecânica celular [27], um tópico que requer mais investigações. As adesões celulares e os rearranjos do citoesqueleto são cruciais para manter a homeostase celular de fato [28]. Quaisquer mudanças na arquitetura do citoesqueleto podem perturbar a mecânica celular e afetar a elasticidade celular e a dinâmica de migração [29]. Neste estudo, avaliamos cuidadosamente os efeitos biomecânicos de 20 nm SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs em células Caco-2 e A549, que são os melhores modelos semelhantes aos tecidos expostos a NPs. Exploramos preliminarmente seus mecanismos de entrada, bem como avaliamos a viabilidade celular, danos à membrana e produção de ROS juntamente com a ativação de superóxido dismutase (SOD) e malondialdeído (MDA). Em seguida, nos concentramos na caracterização das mudanças na elasticidade celular (módulo de Young) após a incubação de NPs por microscopia de força atômica (AFM). Nossos resultados mostram que os NPs podem induzir uma reorganização significativa da actina cortical, conforme confirmado pelas mudanças no módulo de Young. Em particular, uma importante biocompatibilidade de SiO ₂ NPs contra uma toxicidade crônica de TiO ₂ NPs foram observados. Nossa abordagem de acoplamento de investigações de citotoxicidade com caracterizações biomecânicas representa um novo método potencial para padronizar protocolos na avaliação de toxicidade NP.

Métodos

Síntese de SiO amorfo ₂ NPs

A microemulsão W / O ternária foi preparada à temperatura ambiente misturando água, um solvente orgânico (Cyclohexane, J.T. Baker), um surfactante (Triton X-100, Sigma-Aldrich) seguindo os métodos de Malvindi et al. [25]. Resumidamente, 880 μL de Triton X-100, 3,75 mL de ciclohexano, 170 mL de água e 50 μL de TEOS (98%, Sigma-Aldrich) foram misturados e agitados por 30 min. Mais tarde, 30 μL de NH ₄ OH (28,0-30,0%, Sigma-Aldrich) foi adicionado à microemulsão. Após 24 h, a suspensão foi separada por centrifugação (4500 rpm) seguida de cinco lavagens em etanol (98%, Sigma-Aldrich) e água milliQ. As nanopartículas foram então dispersas em água.

Síntese de TiO ₂ NPs

TiO ₂ NPs foram preparados seguindo o método sol-gel descrito por Leena et al. [30] com algumas modificações. Resumidamente, isopropóxido de titânio (IV) (TTIP; 99,9% Sigma-Aldrich) foi gotejado em uma solução de etanol e água milliQ (5:1:1) sob agitação em condições ácidas (pH 3). NPs foram incubados por 5 h a 30 ° C primeiro e depois a 430 ° C por 3 h para obter um pó nano branco.

Caracterização TEM

As caracterizações por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram realizadas com um microscópio JEOL Jem 1011, operando a uma tensão de aceleração de 100 Kv (JEOL USA, Inc.). As amostras de TEM foram preparadas despejando uma solução diluída de NPs em água em grades de cobre revestidas com carbono (Formvar / Carbon 300 Mesh Cu).

Medições DLS e ζ-Potencial

O tamanho hidrodinâmico médio e o potencial zeta de SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs foram determinados por espalhamento de luz dinâmico (DLS) e medições de potencial ζ realizadas em um Zetasizer Nano-ZS equipado com um laser HeNe de 4,0 mW operando a 633 nm e um detector de fotodiodo de avalanche (Modelo ZEN3600, Malvern Instruments Ltd., Malvern, REINO UNIDO). As medições foram feitas a 25 ° C em soluções aquosas e em meio de cultura de células (DMEM, alta glicose, Sigma-Aldrich) suplementado com FBS (Sigma-Aldrich) a 10% e 20% pH 7). Cada amostra foi processada três vezes, usando duas repetições técnicas independentes, para obter os valores médios das medidas DLS e do potencial ζ.

Caracterização de XRD

Difração de raios-X de pó (XRD) para análise de fase cristalina de TiO ₂ NPs foram realizados em um Rigaku, difratômetro em geometria de reflexão Bragg-Brentano usando radiação Cu-Ka filtrada. Os padrões de XRD foram registrados na faixa de 2Q ¼ 20–80 por varredura em etapas, usando incrementos de 2Q de 0,02 e um tempo de contagem fixo de 2 s / etapa.

Cultura de células

Caco-2 (ATCC® HTB-37 ™) e A549 (ATCC® CCL-185 ™) foram mantidos em DMEM com 50 μM de glutamina, suplementado com 100 U / mL de penicilina e 100 mg / mL de estreptomicina. A porcentagem de FBS foi de 10% para células A549 e 20% para células Caco-2. As células foram incubadas em uma atmosfera controlada umidificada com uma proporção de ar / CO de 95 a 5% ₂ , a 37 ° C.

Determinação da captação intracelular de SiO ₂ NPS e TiO ₂ NPs

10 ⁵ Células Caco-2 e A549 foram semeadas em 1 mL de meio em uma placa de seis poços. Após 24 h de incubação a 37 ° C, o meio foi substituído por meio fresco contendo o SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs, em concentrações de 15 μg / ml e 45 μg / ml. Após 48 h, 72 h e 96 h de incubação a 37 ° C, DMEM foi removido e as células foram lavadas quatro vezes com PBS (pH 7,4), para remover NPs que poderiam ser ligados à membrana celular. As células foram tripsinizadas e contadas usando câmara de contagem automática de células. Trezentos e sessenta mil células foram suspensas em 200 μL de milliQ e tratadas com HCl / HNO ₃ 3:1 ( v / v ) e diluída para 5 mL:a solução resultante foi analisada para avaliar o teor de Si e Ti. A análise elementar foi realizada por espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-AES) com um espectrômetro Varian Vista AX.

Ensaio WST-8

Células Caco-2 e A549 foram semeadas em microplacas de 96 poços na concentração de 5 × 10 ³ células / poço após 24 h de estabilização. Soluções de estoque NP (SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs) foram adicionados ao meio celular a 15 μg / ml e 45 μg / ml. As células foram incubadas durante 24 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas. No ponto final, a viabilidade celular foi determinada usando um ensaio WST-8 padrão (Sigma-Aldrich). Os ensaios foram realizados seguindo o procedimento descrito anteriormente em De Matteis et al. [31]. Os dados foram expressos como média ± DP.

Ensaio de LDH

Células Caco-2 e A549 foram tratadas com SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs seguindo o procedimento relatado para o ensaio WST-8. O ensaio de lactato desidrogenase (LDH) foi realizado em microplacas aplicando o reagente CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay (Promega), seguindo as instruções do fabricante. O meio de cultura foi coletado e o nível de LDH foi medido lendo a absorbância a 490 nm usando um espectrofotômetro de microplaca Bio-Rad. Os dados foram expressos como média ± DP.

Ensaio DCF-DA

Células Caco-2 e A549 foram semeadas em microplacas de 96 poços e tratadas com SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs em concentrações finais de 15 μg / ml e 45 μg / ml. Após 24 h, 48 h, 72 h e 96 h de interação célula-NP, o ensaio DCF-DA (Sigma) foi realizado em microplacas seguindo o procedimento relatado por De Matteis et al. [32] Os dados foram expressos como média ± DP.

Ensaio SOD

Extratos celulares de Caco-2 e A549 (incubados com 15 μg / ml, 45 μg / ml por 24 h, 48 h, 72 h e 96 h) foram preparados de acordo com o protocolo descrito em [33]. O ensaio foi realizado em microplacas aplicando um ensaio SOD (Cayman Chemical Company, Michigan, OH, EUA) que mede todos os três tipos de SOD (Cu / ZnSOD, MnSOD e FeSOD). O ensaio utilizou um sal de tetrazólio para detecção de radicais superóxido gerados por xantina oxidase e hipoxantina. Uma unidade de SOD é definida como a quantidade de enzima necessária para exibir 50% de dismutação do radical superóxido. A atividade SOD foi medida pela leitura da absorbância em 440-460 nm usando um espectrofotômetro de microplaca Bio-Rad.

Ensaio MDA

Extratos celulares de Caco-2 e A549 (incubados com 15 μg / ml, 45 μg / ml por 24 h, 48 h, 72 h e 96 h) foram preparados de acordo com os procedimentos descritos anteriormente [33]. O ensaio foi realizado em microplacas aplicando o kit de ensaio de peroxidação lipídica (MDA) (Abcam):o MDA da amostra reagiu com ácido tiobarbitúrico (TBA) para gerar um aduto MDA-TBA. Esta rota envolveu a medição espectrofotométrica da cor vermelha produzida durante a formação do aduto MDA-TBA, que pode ser quantificada (em termos de nmol / mg de proteína) pela leitura da absorbância a 532 nm usando um espectrofotômetro de microplaca Bio-Rad.

Análise CLSM

As células foram semeadas em placas de 24 poços na concentração de 10 ⁵ células / poço e sucessivamente incubadas com SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs na concentração de 15 μg / ml e 45 μg / ml por 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. Após o tratamento, para cada ponto de tempo, o meio contendo nanopartículas foi removido e as células foram lavadas três vezes com PBS, fixadas com 0,25% de glutaraldeído ( v / v em PBS, Sigma-Aldrich) por 20 min, e finalmente permeabilizado com Triton 0,1% ( v / v em PBS, Sigma-Aldrich) por 5 min. Para a coloração de actina, Phalloidin – ATTO 488 (Sigma-Aldrich) foi usado na concentração de 1 μg / ml por 30 min. Os núcleos foram marcados por meio de DAPI (Sigma-Aldrich) na concentração de 1 μg / ml por 7 min. A microscopia confocal de varredura a laser foi realizada em um microscópio confocal Zeiss LSM700 (Zeiss) equipado com um microscópio invertido Axio Observer Z1 (Zeiss) usando lentes de imersão em óleo de abertura numérica × 100, 1,46 para geração de imagens. Os arquivos de dados confocais foram processados no software ZEN2010 (Zeiss) e as quantificações morfométricas (coerência e densidade integrada da F-actina) foram realizadas em 15 células, usando o software de análise ImageJ 1.47. O plugin OrientationJ foi usado para quantificar o parâmetro de coerência escolhendo uma sequência específica de ROIs em aquisições confocais, com base na medida dos tensores da estrutura em uma vizinhança local. Ao mesmo tempo, o software calculou o valor de orientação e coerência que representava o grau em que as fibras de actina eram orientadas:fibras mais desordenadas têm valores próximos a 0, enquanto as perfeitamente alinhadas apresentam valor de coerência em torno de 1 [34]. A densidade integrada também foi calculada pela soma dos valores dos pixels nas ROIs nas aquisições confocais para quantificar a quantidade de fibras de actina nas células.

Análise AFM

As células Caco-2 e A549 foram semeadas em placas de Petri de plástico (Corning) a uma concentração de 10 ⁵ célula / poço e cultivadas até 70–80% da confluência. As células foram então tratadas com 45 μg / ml de um TiO ₂ NP _S e SiO ₂ NPs em DMEM por 72 h. Sucessivamente, os NPs foram removidos e as células lavadas com PBS. As células foram fixadas com glutaraldeído 0,25% por 20 min, seguido de lavagem com PBS. As medidas foram realizadas por um microscópio de varredura avançado (Bioscope Catalyst, Bruker Inc., EUA) montado em um microscópio óptico invertido (Zeiss Observer Z1, Zeiss GERMANY). Todo o sistema é colocado sobre uma base que atua como um isolante em relação às vibrações mecânicas ambientais. Os experimentos de AFM foram realizados no modo força-volume usando o Microlever Sharp de Bruker em forma de V (MSNL, ponta C):um cantilever de nitreto de silício de alta sensibilidade com constante de mola nominal de 0,01 N / m. Este valor foi estimado com precisão pelo método de ajuste térmico [35] antes de realizar as aquisições AFM. Os parâmetros usados foram os seguintes:área de varredura 50 μm, taxa de rampa 3 Hz, taxa de varredura FV 0,03 Hz, limiar de disparo 100 nm, número de amostra 128, amostra por linha 64 e linhas 64. O módulo de Young (E) foi determinado em 20 células, das quais foram extraídas 25 curvas força-distância na correspondência da área nuclear e 25 curvas na região citoplasmática. O conjunto de dados de abordagem (do ponto de contato ao valor de força máxima) derivado das curvas extraídas foi ajustado com um modelo Sneddon modificado:
$$ - {k} _ {\ mathrm {c}} {\ delta} _ {\ mathrm {c}} =\ frac {2 Etg \ alpha} {\ pi \ left (1 - {\ nu} ^ 2 \ direita)} {\ left (z - {\ delta} _ {\ mathrm {c}} \ right)} ^ 2 $$
onde z e δ c foram os dados experimentais de carregamento (altura e deflexão cantilever, respectivamente), α é a metade do ângulo da ponta, k _c era o valor constante elástico do cantilever, e ν é o coeficiente de Poisson (assumido como 0,5 para a amostra biológica). No algoritmo de ajuste, o ponto de contato foi tratado como variável de ajuste e as forças de adesão foram levadas em consideração e foram adquiridas em 20 células.

Análise estatística

Os dados foram expressos como valor médio e desvio padrão associado. As diferenças entre os diferentes valores médios foram consideradas estatisticamente significativas para o desempenho de Student t teste com um p valor ˂ 0,05 (<0,05 *, <0,01 ** e <0,005 ***).

Resultados

Caracterização de SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs

SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs foram sintetizados com rotas sintéticas diferentes e reproduzíveis, a fim de obter NPs com uma distribuição de tamanho estreita e controlada (consulte a seção “Métodos”). Em seguida, os NPs foram profundamente caracterizados por meio de TEM, DLS, potencial ζ e XRD, tanto em água quanto em meio de cultura de células (DMEM) com diferentes concentrações de fonte de proteína (FBS). Isso é crucial, pois as proteínas do meio podem cobrir a superfície das NPs, alterando assim suas propriedades físico-químicas e, consequentemente, os efeitos biológicos [36]. As análises TEM mostraram que SiO ₂ NPs são de forma esférica, com um diâmetro médio de 20 ± 2 nm (Fig. 1a). TiO ₂ NPs têm um tamanho semelhante (25 ± 5 nm), mas morfologia diferente (Fig. 1). As medições DLS realizadas em água às 96 h confirmaram um raio hidrodinâmico de 21 ± 7 nm e 27 ± 12 nm para SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs, respectivamente (Fig. 1b e Fig. 1e). Como esperado, esses dados estão de acordo com as observações do TEM. As análises de ζ-potencial também confirmaram os valores de carga superficial na água de - 45 ± 3 mV para SiO ₂ NPs e de - 50 ± 3 mV para TiO ₂ NPs (Fig. 1c, f). Como esperado, as propriedades físico-químicas dos NPs mudaram após a inoculação no meio de cultura de células. DLS confirmou um aumento significativo no tamanho de NP, especialmente na presença de DMEM suplementado com 20% de FBS (Tabela 1). Em particular, SiO ₂ NPs mostraram um tamanho de 29 ± 9 nm, enquanto TiO ₂ NPs aumentaram até 41 ± 14 nm após 96 h. O aumento do pico de DLS observado nas medições de DMEM (com ou sem FBS) é um sinal de aglomeração de NPs, que pode ser promovido pela força iônica do meio (dados não mostrados). Além disso, as medições de potencial ζ demonstraram que a carga superficial de ambos os NPs mudou para valores mais negativos . Este grande fenômeno dependente do tempo foi devido à formação de proteína corona bastante estável [37, 38] induzida pela presença de proteínas séricas em meios de cultura de células que foram adsorvidas na superfície dos NPs:o tamanho e a carga dos NPs mudam como uma função da concentração de FBS.

Caracterizações de SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs na água. a - d Imagens representativas do TEM. b - e Espalhamento de luz dinâmico (DLS) e c - f medições de potencial ζ. g Análise de difração de raios-X (XRD) padrão de TiO ₂ NPs

O padrão XRD de TiO ₂ NP _S , calcinado a 430 ° C, mostrou uma mistura de fases cristalinas anatase e rutilo (Fig. 1g ) . Os picos dominantes em 2θ =25,4 ° (101), 48,1 ° (200), 54,1 ° (211), 62,4 ° (204) e 68,8 ° (116) foram distintos da fase anatase combinando bem com os dados JCPDS padrão ( número do cartão:21–1272). A fase de rutilo foi representada com picos de difração a 27,5 ° (110), 36,2 ° (101) e 41,2 ° (111).

Captação de NPs em células Caco-2 e A549

A fim de quantificar a quantidade de SiO ₂ NPs e TiO ₂ NP _S absorvido pelas células, realizamos a análise elementar ICP-AES sobre as células lisadas como investigação preliminar. As células foram tratadas com 15 μg / ml e 45 μg / ml de NPs. Os dados experimentais confirmaram a presença de SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs em ambas as linhas celulares, com uma eficiência de internalização dependente do tempo (Fig. 2a). TiO ₂ NPs mostraram uma absorção maior em relação ao SiO ₂ NPs. Isso foi particularmente evidente no Caco-2, onde o conteúdo de Ti atingiu concentrações intracelulares de 8,2 ± 0,4 μg e 9,7 ± 0,031 μg após 72 he 96 h, respectivamente . A quantidade de Ti detectada no A549 foi menor, pois encontramos 5 ± 0,599 μg após 72 he 7,12 ± 0,11 μg após 96 h de incubação. SiO ₂ NPs foram menos absorvidos pelas células em comparação com TiO ₂ NPs, mesmo que a internalização tenha sido mais pronunciada no Caco-2. Também neste caso, de fato, a quantidade de SiO internalizado ₂ NPs em células Caco-2 foi de 4,69 ± 0,031 μg após 72 he 5,78 ± 0,045 μg após 96 h de incubação. Os valores diminuíram em A549, onde quantificamos 2,58 ± 0,045 μg após 72 he 4,7 ± 0,04 μg após 96 h.

TiO ₂ NPs e SiO ₂ Acumulação de NPs em linhas celulares Caco-2 e A549 expostas a 15 μg / ml e 45 μg / ml de TiO ₂ NPs e SiO ₂ NPs por 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. As células foram então colhidas, as células vivas foram contadas e o conteúdo de Ti e Si foi medido em 360.000 células (μg de Ti e μg de Si). Dados relatados como média ± DP de três experimentos independentes; significância estatística de células expostas vs. células de controle para p valor <0,05 (<0,05 *, <0,01 ** e <0,005 ***)

Efeitos de NPs em CaCo-2 e A549:Viabilidade de Células, Danos de Membrana e Produção de ROS

A viabilidade das células Caco-2 e A549 foi avaliada com o ensaio WST-8. O tratamento com SiO ₂ NPs e TiO ₂ Os NPs induziram uma ligeira redução da viabilidade dependente da dose em ambas as linhas celulares testadas (Fig. 3). TiO ₂ NPs induziram uma citotoxicidade aumentada em relação a SiO ₂ NPs, e a viabilidade celular das células CaCo-2 foi mais afetada do que o A549, após o tratamento com TiO ₂ NPs. Em particular, observamos uma redução da viabilidade de cerca de 40% em Caco-2 tratado com 45 μg / ml de TiO ₂ NPs por 72 h. Essa redução caiu ainda mais para 50% após 96 h, enquanto, em linhas de células A549, TiO ₂ NPs induziram redução de 30% da viabilidade somente após 96 horas de tratamento. A liberação de LDH e a produção de ROS foram avaliadas em células Caco-2 e A549 após a exposição a TiO ₂ NPs e SiO ₂ NPs. Como mostrado na Fig. 4a, b, os NPs induziram a poração da membrana celular (e, na verdade, a liberação de LDH) em estreita concordância com os resultados de viabilidade. O efeito foi mais evidente no Caco-2 em relação ao A549, especialmente no TiO ₂ Tratamento NP, nos momentos mais altos (72 e 96 h). A porcentagem de liberação de LDH atingiu um aumento de cerca de 160% em relação às células não tratadas (controle), após 96 h de exposição. A geração de ROS tem sido amplamente estudada porque é um dos principais efeitos induzidos por NPs [39]. Este fenômeno interfere na resposta de defesa antioxidante biológica [40], embora seja importante ressaltar que o real mecanismo de ação ainda está sob investigação. O potencial estresse oxidativo induzido por NP foi estimado pelo ensaio DCFH-DA. Como esperado, a interação entre NPs e células estimulou a geração de ROS, de maneira dose-dependente com forte efeito do Caco-2 sobre o TiO ₂ Tratamento de NP (Fig. 4c, d). A porcentagem de liberação atingiu valores de 165% em relação às células controle, na maior concentração testada.

Ensaio de viabilidade (WST-8) de Caco-2 ( a ) e A549 ( b ) células após 24 h, 48 h, 72 h e 96 h de exposição a duas doses (15 μg / ml e 45 μg / ml) de TiO ₂ NPs e SiO ₂ NPs. A viabilidade das células tratadas com NP foi normalizada para células de controle não tratadas. Como controle positivo (P), as células foram incubadas com 5% de DMSO (dados não mostrados). Os dados relatados como média ± DP de três experimentos independentes são considerados estatisticamente significativos em comparação com o controle ( n =8) para p valor <0,05 (<0,05 *, <0,01 ** e <0,005 ***)

LDH ( a - b ) e ROS ( c - d ) ensaios em células Caco-2 e A549. As células foram incubadas com 15 μg / ml e 45 μg / ml de TiO ₂ NPs e SiO ₂ NPs por 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. A porcentagem de vazamento de LDH de células tratadas com nanopartículas é expressa em relação às células de controle não tratadas. Os controles positivos (P) consistiram no tratamento das células com Triton X-100 0,9% apresentando ca. Aumento de 500% de LDH (dados não mostrados). Os níveis de ROS foram registrados expondo células Caco-2 e A549 com 15 μg / ml e 45 μg / ml de TiO ₂ NPs e SiO ₂ NPs por 24 h, 48 h, 72 h e 96 h incubados com DCFH-DA 100 μM. A fluorescência celular foi medida. Como um controle positivo (P), as células foram incubadas com 500 μM de H ₂ O ₂ mostrando um ca. Aumento de 300% de DCFH-DA (não mostrado). Os dados relatados como média ± DP de três experimentos independentes são considerados estatisticamente significativos em comparação com o controle ( n =8) para p valor <0,05 (<0,05 *, <0,01 ** e <0,005 ***)

Efeitos induzidos por NPs na atividade antioxidante e na peroxidação lipídica em células Caco-2 e A549

A enzima SOD está envolvida no sistema de defesa antioxidante após a indução do estresse oxidativo. Esta enzima catalisa a dismutação de superóxido altamente reativo (O ₂ ^{• -} ) ânion em peróxidos H ₂ O ₂ [41]. Observamos uma redução dependente da dose na atividade da enzima SOD em ambos Caco-2 e A549 após a incubação com SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs (15 μg / ml, 45 μg / ml) em diferentes pontos de tempo (de 24 a 96 h) (Fig. 5a, b). Em estreita concordância com as avaliações de citotoxicidade, o efeito foi mais evidente no Caco-2 sobre TiO ₂ Exposição NP. Por exemplo, os níveis de atividade de SOD foram reduzidos de 4,1 ± 0,2 U / ml no controle para 1,03 ± 0,325 U / ml em células Caco-2 expostas a 45 μg / ml de TiO ₂ NPs, após 96 h. A exposição à mesma concentração de SiO ₂ NPs reduziram a atividade de SOD para 1,45 ± 0,12 U / ml. O ensaio baseado em MDA foi usado para verificar a peroxidação lipídica potencial mediada por ROS, que por sua vez é outra maneira de verificar o estresse oxidativo celular. [42] Os níveis celulares de MDA aumentaram após a exposição aos dois tipos de NPs para Caco-2 e A549 (Fig. 5c, d). Como esperado, os níveis aumentados de MDA foram proporcionais à concentração e ao tempo de exposição.

a - d Ensaios de SOD e MDA em células Caco-2 e A549. As células foram incubadas com 15 μg / ml e 45 μg / ml de TiO ₂ NPs e SiO ₂ NPs por 24 h, 48 h, 72 h, 96 h. O ensaio SOD usou um sal de tetrazólio para detecção de radicais superóxido gerados por xantina oxidase e hipoxantina. A curva padrão foi usada como um controle positivo (dados não mostrados). Os níveis de MDA foram detectados pela quantificação do aduto MDA-TBA (OD =532 nm). Os dados relatados como média ± DP de três experimentos independentes são considerados estatisticamente significativos em comparação com o controle ( n =8) para p valor <0,05 (<0,05 *, <0,01 ** e <0,005 ***)

Efeitos morfomecânicos induzidos por NPs

Análises de microscopia confocal de Caco-2 e A549 incubados com 15 μg / ml e 45 μg / ml de SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs para 24 h, 48 h, 72 h e 96 h são relatados nas Figs. 6 e 7. Células Caco-2 de controle exibiram uma morfologia semelhante a enterócitos intestinais com junções apertadas e borda em escova no lado apical [43]. Após o tratamento com NPs, as junções estreitas das células entraram em colapso e o padrão das células resultou ser isolado, com uma forma alongada. Esses efeitos foram mais evidentes quando as células foram tratadas com TiO ₂ NPs a 45 μg / ml por 72 h de incubação, mostrando alterações relevantes nos padrões de actina, bem como alterações na morfologia celular. As células A549 não tratadas exibiram uma forma semelhante a seixo e aderências célula-célula funcionais [44], enquanto o tratamento com NPs diminuiu os contatos célula-célula e modificou a morfologia celular para formas mais alongadas. A Figura 8 mostra uma figura confocal ampliada, que permite detectar mudanças na distribuição de actina. A organização alterada da rede de actina após a exposição a NP (72 h de 45 μg / ml de SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs) foi analisado quantitativamente por densidade de fluorescência e coerência usando o software ImageJ (Fig. 9). Optamos especificamente por esses dois parâmetros porque a densidade integrada nos permitiu quantificar a quantidade de actina, enquanto a coerência nos deu informações sobre o grau de orientação da fibra em comparação com o ambiente [45]. As células Caco-2 não tratadas tinham um valor de densidade de 129,4 ± 16, e isso não foi afetado nos tratamentos NP; os valores foram 127,7 ± 20 e 128,5 ± 18 após a exposição a SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs, respectivamente, Fig. 9a). Da mesma forma, também a densidade da rede corada com actina permaneceu a mesma em A549 antes e depois do tratamento (68,4 ± 14, 67,9 ± 15 e 67,7 ± 18 para controle negativo, SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs, respectivamente, Fig. 9b). Embora os tratamentos NP não tenham induzido alteração na quantidade de actina, as análises de coerência sugeriram reorganização espacial da actina diferente. No Caco-2, os valores de coerência das células tratadas para SiO ₂ NP (0,16 ± 0,04) e para TiO ₂ O tratamento NP (0,09 ± 0,02) diminuiu em relação ao do controle (0,26 ± 0,03) (Fig. 9c). Mesmo as células A549 sofreram uma diminuição de coerência após interagir com SiO ₂ NPs e TiO ₂ NPs (0.2 ± 0.07 and 0.158 ± 0.04) compared to the control cells (0.4 ± 0.03) (Fig. 9d). Hence, NPs induced a significant reorganization of actin network, which showed an actin isotropic orientation, but they did not change the overall quantity of actin expressed. In addition to cytoskeletal rearrangements, we also analyzed the area described by the nucleus/cytoplasm ratio. Values of N/C ratio were calculated as the ratio between nuclear area and the whole cellular area (measured performed on 15 cells). We observed opposite values following the treatment with 45 μg/ml of NPs for 72 h with significant statistical validity. In particular, the ratio was (0.40 ± 1.7) in untreated Caco-2 cells, and this increased up to 0.554 ± 0.09 and 0.62 ± 0.12 after SiO₂ NP e TiO ₂ NP exposure (Fig. 9e). The trend was different in A549. The nuclear/cytoplasm ratio dropped down upon exposure to NPs from values of 0.550 ± 0.04 for control cells to 0.334 ± 0.06 for SiO₂ NPs and 0.225 ± 0.09 for TiO₂ NPs. After the morphological investigations, we analyzed the elastic properties of cells after exposing them to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h by AFM, in force–volume mode. We measured the different elasticity expressed by Young’s modulus values in the nuclear and cytoplasmic region. Caco-2 cells displayed Young’s modulus value of 105 ± 25 kPa for nuclear region and 47 ± 21 kPa for the cytoplasm. After SiO₂ NP treatment, we observed a reduction of value to 42 ± 8 kPa for the nucleus and 19.59 ± 2 kPa for the cytoplasm. The effects were more evident after treatment with TiO₂ NPs:the Young modulus for the nucleus was 27 ± 4 kPa and 18 ± 4 kPa for the cytoplasm (Fig. 10a). We found an opposite outcome concerning the elastic properties of A549 cells. In this case, Young’s modulus was 129 ± 24 kPa for the nuclear region and 147 ± 26 kPa for the cytoplasmic area. After SiO₂ NP treatment, the values of elasticity increased to 152 ± 23 kPa for nucleus and 152 ± 25 kPa for cytoplasm. When cells were doped with TiO₂ NPs, Young’s modulus values drastically increased to 372 ± 60 kPa for nucleus region and 549 ± 40 kPa for cytoplasmic region (Fig. 10b).

Effects of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 cells. Caco2 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; cells were fixed and then stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network on A549 cells. A549 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; successively they were fixed and stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Local enlargement of confocal acquisitions acquired in Figs. 6 and 7 showed (more in details) the effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 and A549 cells after the exposure of 45 μg/ml of NPs for 72 h and 96 h

Integrated density (a , b ) and coherency (c , d ) for Caco-2 and A549 cells treated with 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs after 72 h. The integrated density and coherency values were expressed as a mean value and relative SD, calculated from confocal acquisitions by ImageJ (calculation on 15 cells). The mean values and their standard deviations were reported in the histograms. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***). e Analyses of nucleus/cytoplasm ratio on Caco-2 and A549 after exposure to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h. The ratio was calculated on 15 cells by ImageJ. The mean values and the SD were reported in the histogram. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***)

Young’s modulus values expressed in kPa, calculated from the nuclear region and the cytoskeletal area of Caco-2 (a ) and A549 (b ) cell lines after a treatment to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h

Discussion

The spread of different kind of ENPs in several fields raises awareness about the importance to assess their potential toxicity in living organisms and the environments as well, taking into account their potential application in biomedical field [46,47,48]. In vitro and in vivo investigations are crucial to enrich the scientific knowledge and to release reliable clinical and epidemiological data [49]. The toxicity tests performed on different cells are considered the golden standard to assess the safety of NPs. However, few studies have investigated the interactions between NPs and cells from a biomechanical point of view. Cell mechanic is an important factor that influences many cellular pathways, including apoptosis, differentiation, migration, cancer metastasis, and wound healing [50]. In our work, we have addressed this point and related cell viability with the changes in mechanical properties of cells treated with different NPs. Firstly, we synthetized amorphous SiO₂ NPs and crystalline TiO₂ NPs with a size of c.a. 20 nm. NPs were stable in water and DMEM up to 96 h, even upon incubation with 10% and 20% of FBS. This was found to induce an increase in NPs size due to the formation of protein corona, in perfect agreement with the literature data. [51]. Since the entry route of NPs often occurs through inhalation and ingestion, we opted to investigate the potential effects on Caco-2 and A549 cells, which are representative models for the intestinal tract and airways mimicking oral and inhalation uptake [52]. As primary investigation, we quantified the cellular internalization of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs by elemental analysis. The most effective uptake was observed in Caco-2 cells, especially upon treatment with TiO₂ NPs in a time-dependent manner. It has been reported that amorphous SiO₂ NPs, with a small size range of 15–20 nm, can bind the plasma membrane and then passively pass across the lipid bilayer to get access into the cells [53]. As demonstrated in A549 [54] and Caco-2 [55], in fact, small SiO₂ NPs can translocate in the cytoplasm with no apparent membrane encapsulation. The anatase crystalline form of TiO₂ NPs is the more chemically reactive [56] showing a faster absorption with respect to rutile, as previously reported [32]. However, the uptake mechanisms of Caco2 are still unclear, despite that some hypothesis have been formulated, some of these include metal ion release upon NPs degradation in the intestinal barrier lumen or/and direct uptake by endocytosis. [57]. In A549 cells, TiO₂ NPs were localized in cytoplasm and close the nucleus region [58]. We used WST-8 assay to assess the influence of different concentrations of SiO₂ NPs and TiO2NPs on cell viability. We have observed a general decrease of viability, especially in Caco-2, with TiO₂ NPs displaying the strongest toxicity. After assessing the viability, we monitored the extracellular release of the cytoplasmic enzyme LDH. We confirmed that the NPs induced an extensive membrane damage, which relates also to the increase of intracellular ROS levels, resulting in oxidative stress. In this context SOD, which acts as strong antioxidant against ROS [59], was significantly reduced most probably because of the unbalance of the redox repair systems. In addition, the oxidative stress increased the lipid peroxidation [60], as demonstrated by MDA measurements after NPs incubation. This is particularly evident in Caco-2 cells after TiO₂ NP exposure. It is worth mentioning that this effect can decrease membrane fluidity, which can further explain the observed higher entry levels of the TiO₂ NPs [61]. This was in significant accordance with the intracellular oxidative stress levels measured by SOD inhibition, as well as with the reactive oxygen species generation. After these assessments, we investigated the modulation of the cell cytoskeleton, as an increase of intracellular ROS could affect the F-actin organization [62]. The cytoskeleton is characterized by a set of filaments (actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments) organized in a network that affects the mechanical properties of cells, as well as their behavior [29]. In particular, actin filaments are crucial for cell mechanics, and any alterations may induce aberrations in cell morphology under sub-toxic conditions [63]. It has been demonstrated that actin was one of the most commonly bound protein by SiO₂ NPs and TiO₂ NPs in cellular extracts. This definitely suggests that the actin functions, as well as cell motility and organelles trafficking, can be strongly affected by the presence of these NPs [64, 65]. As a further proof, several in vivo studies have revealed the potential of NPs to induce alterations in the expression of genes related to the cytoskeleton [63]. In order to understand how NPs modulate the cytoskeleton, we performed qualitative and quantitative confocal analyses on Caco-2 and A549 cells, after SiO₂ NP and TIO₂ NP treatment. We focused on actin stress fibers and cortical actin because they allowed to maintain the physiological mechanical architecture of cells. As reported in Figs. 4 and 5, the treatment with NPs induced a significant reorganization of actin. This was more evident after 72 h of treatment with 45 μg/ml of NPs, and especially with the use of TiO₂ NPs. The adverse effects were stronger in intestinal cells, where we have observed the formation of protrusions and philopodia at the plasma membrane level, together with the disruption of tight junctions. Fluorescence coherency and fluorescence density have been used as quantitative parameters to assess alterations of actin distribution in the cytoskeleton. While coherency gives information about the organization of actin, density quantifies the levels of fluorescent actin. Caco-2 and A549 exposed to NPs showed a reduction of coherency compared to untreated cells, especially upon incubation with TiO₂ NPs. This was in good agreement with the qualitative confocal imaging analyses. The fluorescence density of actin was not altered by NP treatment in both the cell lines, even if untreated Caco-2 cells showed higher values with respect to untreated A549. These data could suggest a potential difference in the amount of actin, which is dependent on>the specific cell type. We also evaluated the nucleus-to-cytoplasm ratio as the relative area of the nucleus over the whole cell. We confirmed a reduction of values in A549 and an increase of the ratio in Caco-2 with respect to the control cells. This indicates changes in cell morphology after NP treatment:Caco-2 underwent an increase of nucleus area, whereas A549 became larger through cytoplasm extension. As a final point, we explored any potential change in cell elasticity upon NP treatment. Cell elasticity is commonly expressed by Young’s modulus (E), which is a ratio between the stress and the applied strain (with unit in Pascal) [66, 67]. Changes in cell elasticity due to cytoskeleton reorganization is often associated to disease progression [68], hence (E) can be a refined indicator of potential pathological states [67]. The deformability of cells was measured through indentation experiments by AFM [69]. Many studies showed the detrimental effects of NPs on the F-actin that induced an enhancement of cell elasticity. However, a clear relation between change in cell stiffness, actin rearrangement and cell viability has not been clearly established yet. Here, we have covered such topic and found that Caco-2 and A549 cells significantly change their (E) upon NP treatment, even though in two different ways. Caco-2 cells are softer as confirmed by the decreased Young’s modulus, which has been found to be a function of both the NPs type and the cell regions analyzed. In particular, TiO₂ NPs induced a general enhancement of elasticity, and this effect is more evident in the nuclear regions rather than the cytoplasmic one. On the other side, A549 displayed a remarkable increase of Young’s modulus after TiO₂ NP exposure in cytoplasm region, compared to control cells (594 ± 40 kPa versus 146 ± 26 kPa, respectively). These data indicated that TiO₂ NPs induce dose-dependent changes in force–deformation profiles in both cell lines, whereas SiO₂ NPs showed little effects. The decrease of Young’s Modulus, and consequently an increase of elasticity after NPs exposure, can potentially impact cell homeostasis and physiological pathways. The reorganization F-actin, together with a reduction of coherency, showed a strong modulation of mechanical cell properties. NPs have been demonstrated to make the nuclear region of Caco-2 cells softer than untreated cells. The increase of elasticity (corresponding to a reduction of Young’s modulus) is a critical factor in tumor progression, because it is an indicator of disruption of cell junctions, which promotes in turn cell migration and metastatization [70]. Therefore, the treatment with NPs on Caco-2 (and TiO₂ NP_S in particular) can potentially promote migration due to change of elastic properties and deformability of cells. Also, the larger and softer nucleus area can be associated to cancer progression [71].

Conclusion

In this paper, we careful assessed the adverse effects of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs on two different cell lines (Caco-2 and A549), mimicking the typical tissue that are exposed to NPs (ingestion and inhalation). SiO ₂ NPs presented a low cytotoxicity in comparison with TiO₂ NPS. We demonstrated how the cellular exposure to high doses of NPs induced morphostructural changes in term of actin reorganization, coherency, density and nucleus/cytoplasm ratio, which were more evident upon TiO₂ NP treatment. Cell membrane deformability measurements showed different behavior in the two cells. In Caco-2, the cell elasticity increased after NP treatment, whereas A549 displayed an increase of stiffness. These results demonstrated that NPs induce modifications of cytoskeleton structures and, as consequence, a different Young’s Modulus values. Hence, the phenotype of cancer cells can turn into a more invasive profile, characterized by enhanced migration. On the other side, the increased stiffness observed in A549 might not promote the mobility of this specific cell indeed. We are sure that the analysis of cell mechanics upon NP exposure, combined with standard toxicological assays, will represent a golden standard to accurately assess the safety of NPs and to predict any potential possible diseases triggered by NPs.