Modulação Nanopartícula-Induzida da Mecânica Celular: Análise Comparativa dos Efeitos de SiO₂ e TiO₂ em Células Caco-2 e A549

Resumo

A crescente incorporação de nanopartículas (NPs) em produtos de consumo superou avaliações de segurança abrangentes. Este estudo investiga como os atributos físico-químicos de NPs de SiO₂ e TiO₂ influenciam captação celular, tráfego intracelular e perturbações mecânicas em dois modelos in vitro clinicamente relevantes — Caco-2 (epitélio intestinal) e A549 (epitélio alveolar). Quantificamos internalização de NP via ICP-AES, avaliamos citotoxicidade com ensaios WST-8 e LDH, medimos estresse oxidativo (ROS, SOD, MDA) e avaliamos remodelação do citoesqueleto de actina através de microscopia confocal. Microscopia de força atômica (AFM) determinou mudanças no módulo de Young nos compartimentos nuclear e citoplasmático. NPs de TiO₂ exibiram maior captação celular, geração pronunciada de ROS e significativa reorganização de actina, levando a aumento de rigidez em células A549 e redução de rigidez em células Caco-2. Estas alterações biomecânicas correlacionam-se com citotoxicidade induzida por NP e destacam a importância de integrar endpoints mecânicos em protocolos de nanototoxicologia.

Fundamentação

Nanopartículas engenheiradas (ENPs) são pervasivas em farmacêuticos, cosméticos, aditivos alimentares e formulações industriais, levantando preocupações sobre vias de exposição humana e ambiental (ingestão, inalação, dérmica). A toxicidade de ENPs é fortemente modulada por seu tamanho, forma, química de superfície e estado cristalino, ainda métodos de avaliação padronizados permanecem limitados, contribuindo para literatura conflitante [1-5]. NPs de óxido metálico, particularmente SiO₂ amorfo e TiO₂ cristalino, são amplamente empregados devido à sua estabilidade óptica e química, ainda evidências sugerem que podem perturbar funções celulares, incluindo liberação de citocinas, integridade de microvilosidades intestinais, produção de ROS, inibição de síntese de ATP e genotoxicidade [15-26]. No entanto, seu impacto na mecânica celular — determinante chave de migração, diferenciação e homeostase tecidual — recebeu atenção limitada [27, 28]. Este estudo preenche essa lacuna avaliando sistematicamente efeitos biomecânicos de NPs de SiO₂ e TiO₂ de 20 nm em células Caco-2 e A549.

Métodos

Síntese de Nanopartículas de SiO₂ e TiO₂

NPs de SiO₂ foram preparadas via microemulsão W/O usando TEOS, Triton X-100, ciclohexano e NH₄OH, resultando em partículas esféricas de 20 ± 2 nm. NPs de TiO₂ foram sintetizadas por rota sol-gel modificada a partir de TTIP sob condições ácidas, calcinadas a 430 °C para produzir fase mista anatase-rutilo com diâmetro médio de 25 ± 5 nm. Ambos os tipos de NP foram caracterizados por TEM, DLS, ζ-potencial e XRD para confirmar morfologia, tamanho hidrodinâmico, carga de superfície e estrutura cristalina (Fig. 1).

Cultura Celular e Exposição

Células Caco-2 e A549 foram mantidas em DMEM suplementado com 10-20 % FBS, 100 U/mL penicilina e 100 µg/mL estreptomicina. Para estudos de captação, células foram expostas a 15 ou 45 µg/mL de NPs por 48-96 h. Pós-exposição, células foram lavadas, tripsinizadas, contadas e lisadas em HCl/HNO₃ para análise ICP-AES de conteúdo de Si e Ti.

Citotoxicidade, Integridade de Membrana e Estresse Oxidativo

Viabilidade foi avaliada com ensaio WST-8; liberação de LDH quantificou dano de membrana. Produção de ROS foi medida por fluorescência DCF-DA, e resposta antioxidante avaliada via atividade SOD e níveis MDA (peroxidação lipídica). Todos os ensaios foram realizados em triplicata com controles apropriados.

Citoesqueleto de Actina e Morfometria

Células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com Phalloidin-ATTO 488 e DAPI. Microscopia confocal a laser (CLSM) capturou distribuição de actina cortical. ImageJ quantificou densidade integrada e coerência (plugin OrientationJ) para avaliar quantidade e alinhamento de actina. Razões de área nuclear-para-citoplasmática (N/C) foram calculadas para detectar mudanças morfológicas.

Microscopia de Força Atômica

AFM em modo volume-de-força mediu módulo de Young em regiões nuclear e citoplasmática de células tratadas com 45 µg/mL NPs por 72 h. Curvas força-distância foram ajustadas a modelo Sneddon modificado para extrair módulos elásticos (E). Dados de 20 células por condição foram analisados estatisticamente.

Análise Estatística

Resultados expressos como média ± DP. Teste t de Student comparou grupos tratado versus controle, com limiares de significância em p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) e p < 0,005 (***).

Resultados

Caracterização de Nanopartículas

Imagens TEM confirmam NPs de SiO₂ monodispersas, esféricas (~20 nm) e NPs de TiO₂ (~25 nm) com fases anatase-rutilo mistas (Fig. 1). DLS mostra diâmetros hidrodinâmicos de 21 ± 7 nm (SiO₂) e 27 ± 12 nm (TiO₂) em água; tamanhos aumentam para 29 ± 9 nm e 41 ± 14 nm, respectivamente, em DMEM com 20 % FBS após 96 h, indicando formação de coroa proteica. ζ-potenciais são -45 ± 3 mV (SiO₂) e -50 ± 3 mV (TiO₂) em água, tornando-se mais negativos em meios de cultura.

Captação de NP

ICP-AES revelou internalização dependente de dose e tempo. NPs de TiO₂ acumularam-se mais prontamente, atingindo 8,2 ± 0,4 µg por 3,6 × 10⁵ células em Caco-2 após 72 h e 9,7 ± 0,03 µg após 96 h. Em A549, captação foi 5 ± 0,6 µg (72 h) e 7,1 ± 0,1 µg (96 h). NPs de SiO₂ exibiram menor acumulação, particularmente em A549 (2,6 ± 0,05 µg a 72 h). No geral, NPs de TiO₂ exibem maior captação celular em ambas linhagens.

Viabilidade Celular, Dano de Membrana e ROS

Ensaios WST-8 mostraram redução modesta de viabilidade em ambas linhagens a 45 µg/mL. Viabilidade de Caco-2 caiu ~40 % após 72 h e ~50 % após 96 h de exposição a TiO₂; A549 exibiu redução ~30 % apenas após 96 h. Liberação de LDH espelhou estas tendências, atingindo pico ~160 % do controle após 96 h em Caco-2. Geração de ROS aumentou dose-dependente, com NPs de TiO₂ induzindo até 165 % fluorescência DCF-DA em Caco-2 (Fig. 4).

Resposta Antioxidante e Peroxidação Lipídica

Atividade SOD declinou de forma dose e tempo-dependente. Em Caco-2, SOD diminuiu de 4,1 ± 0,2 U/mL (controle) para 1,0 ± 0,3 U/mL após 96 h de 45 µg/mL TiO₂. Exposição a SiO₂ reduziu SOD para 1,4 ± 0,1 U/mL. Níveis MDA subiram correspondentemente em ambas linhagens, indicando peroxidação lipídica aumentada.

Remodelação do Citoesqueleto de Actina

Imagem confocal revelou junções estreitas desorganizadas e morfologia alongada em Caco-2, e contatos célula-célula diminuídos em A549 sob tratamento com NP. Análise quantitativa mostrou nenhuma mudança significativa em densidade integrada (quantidade de actina) mas diminuição pronunciada em coerência: coerência de Caco-2 caiu de 0,26 ± 0,03 (controle) para 0,09 ± 0,02 (TiO₂). Coerência de A549 diminuiu de 0,40 ± 0,03 para 0,16 ± 0,04. Razões N/C aumentaram em Caco-2 (0,40 → 0,62) e diminuíram em A549 (0,55 → 0,23), refletindo respostas morfológicas divergentes.

Propriedades Mecânicas (Módulo de Young)

Medidas AFM indicaram mudanças contrastantes de rigidez. Em Caco-2, módulo de Young diminuiu de 105 ± 25 kPa (núcleo) para 27 ± 4 kPa após exposição a TiO₂; módulo citoplasmático caiu de 47 ± 21 kPa para 18 ± 4 kPa. Inversamente, rigidez de A549 aumentou dramaticamente: módulo nuclear subiu de 129 ± 24 kPa para 372 ± 60 kPa, e módulo citoplasmático de 147 ± 26 kPa para 549 ± 40 kPa sob tratamento com TiO₂.

Discussão

Nossos achados demonstram que NPs de TiO₂, devido à sua estrutura cristalina e reatividade de superfície, provocam respostas celulares mais fortes que NPs de SiO₂ amorfas. A captação aprimorada, geração de ROS e reorganização de actina correlacionam-se com alterações significativas na elasticidade celular — amolecimento de células Caco-2 e endurecimento de células A549 — sugerindo vias mecanísticas distintas em contextos epitelial versus alveolar. Tais mudanças biomecânicas podem influenciar migração celular, integridade de barreira e potencialmente progressão tumoral. Integrar endpoints mecânicos com ensaios citotóxicos convencionais oferece avaliação nanotoxicológica mais abrangente.

Conclusão

NPs de SiO₂ exibem menor citotoxicidade comparadas a NPs de TiO₂. Exposição a TiO₂ induz remodelação de actina, razões N/C alteradas e respostas mecânicas divergentes: aumento de rigidez em A549 e redução de rigidez em Caco-2. Estas perturbações biomecânicas sublinham a importância de avaliar dinâmica citoesquelética e mecânica celular em estudos de nanototoxicologia para prever potenciais desfechos patológicos.

Abreviações

A549

Células epiteliais basais alveolares de adenocarcinoma humano

AFM

Microscopia de força atômica

ATP

Adenosina trifosfato

Caco-2

Adenocarcinoma colorretal epitelial humano

CLSM

Microscopia confocal a laser

DAPI

4',6'-Diamidino-2-fenilindol

DCF-DA

2',7'-Diclorofluoresceína diacetato

DLS

Espalhamento dinâmico de luz

DMEM

Meio modificado de Dulbecco Eagle

ENPs

Nanopartículas engenheiradas

FBS

Soro fetal bovino

HCl/HNO₃

Ácido clorídrico/nítrico

ICP-AES

Espectroscopia de emissão atômica por plasma acoplado indutivamente

LDH

Lactato desidrogenase

MDA

Malondialdeído

NH₄OH

Hidróxido de amônio

NPs

Nanopartículas

PBS

Salino fosfatado tamponado

ROIs

Regiões de interesse

ROS

Espécies reativas de oxigênio

SiO₂ NPs

Nanopartículas de dióxido de silício

SOD

Superóxido dismutase

TBA

Ácido tiobarbitúrico

TEM

Microscopia eletrônica de transmissão

TEOS

Ortossilicato de tetraetila

TiO₂ NPs

Nanopartículas de dióxido de titânio

TTIP

Isopropoxido de titânio (IV)

XRD

Difração de raios X