Uma análise comparativa in vivo de nanopartículas de óxido de cobre e zinco biossintetizadas por vias de administração intraperitoneal e intravenosa em ratos

Resumo

Atualmente, as características antimicrobianas das nanopartículas (NPs) de cobre (Cu) e óxido de zinco (ZnO) são amplamente utilizadas para combater o crescimento de micróbios patogênicos. CuNPs e ZnONPs são usados ​​recorrentemente em cosméticos, medicamentos e aditivos alimentares, e seu potencial para impactos tóxicos em humanos e no ecossistema é de grande preocupação. Neste estudo, o destino e a toxicidade de cobre biossintetizado de 16 a 96 nm (Bio-CuNPs) e óxido de zinco (Bio-ZnONPs) foram avaliados em ratos Wistar machos. As exposições in vivo das duas nanopartículas são obtidas por meio de duas vias de administração diferentes, a saber, injeções intraperitoneais (i / p) e intravenosas (i / v). As três concentrações diferentes, nenhuma concentração de efeito adverso observável (NOAEC), concentração inibitória (IC ₅₀ ) e a concentração letal total (TLC), foram avaliados na faixa de dose de 6,1 a 19,82 μg / kg e 11,14 a 30,3 μg / kg para Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs, respectivamente, para ambas as rotas i / pe i / v nas 14º e 28º dias de observação. Esses intervalos de dosagem são considerados com base no estudo anterior de dose antibacteriana em bactérias patogênicas multirresistentes. Neste estudo, investigamos o efeito tóxico de Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs no comportamento animal, massa animal, índices hematológicos, índices de órgãos e histopatologia de órgãos do fígado, baço, rins e cérebro. Descobrimos que a administração i / v e i / p de Bio-ZnONPs em três doses diferentes não causou mortalidade e o peso corporal foi ligeiramente reduzido até a segunda semana de administração em comparação com o grupo de controle de veículo. Nos intervalos de dose de 11–16 μg / kg (i / v) e 24–30 μg / kg (i / p), nenhuma alteração significativa foi observada no nível de creatinina sérica, bem como ALT sérica, nível de AST sérico e ALP que eram 40,7 mg / dl, 37,9 IU / L e 82,4 IU / L normais em comparação com o controle do veículo no 14º e 28º dias de observação. Esses achados são confirmados em índices de fígado, rim e baço e estudos histopatológicos. Além disso, a lesão hepática e renal ocorreu quando as concentrações de Bio-CuNPs estavam em 9,5 μg / kg (IC ₅₀ ) e 11,7 μg / kg (TLC) para a via de administração i / v. Da mesma forma, também foi observado aumento na ALT sérica (67,7 mg / dl), nível de AST (70 IU / L) e ALP (128 IU / L). E o peso corporal foi significativamente menor do que no grupo controle após o 14º dia, e houve diferenças estatisticamente significativas observadas por esta via; curiosamente, a toxicidade de Bio-CuNPs no soro é prolongada (até 28º dia). O efeito de Bio-CuNPs através da via i / p foi consideravelmente baixo em comparação com o controle. Os resultados do presente estudo revelaram que os Bio-ZnONPs não têm efeito sobre os biomarcadores da função renal e hepática (tanto i / v quanto i / p) em comparação com os Bio-CuNPs.

Conforme mostrado no resumo gráfico (Fig. 1), nosso objetivo é avaliar a toxicidade de Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs por meio do protocolo in vivo. De acordo com as revisões de Kahru e Dubourguier, AgNPs, CuNPs e ZnONPs têm sido historicamente usados ​​como biocidas, para prevenir o crescimento de microrganismos e algas (Kahru e Dubourguier 2010). Portanto, assim como os pesticidas, os nanomateriais devem ser monitorados quanto à sua resposta tóxica a espécies não-alvo, incluindo humanos e animais. Para compreender melhor se a liberação acidental de NPs contendo metal pode representar uma ameaça para espécies não-alvo, a avaliação do efeito tóxico é indispensável. O 'organismo não-alvo' é um organismo que será exposto a NPs após seu incidente liberar no meio ambiente.

Histórico

Certos metais são necessários para as funções fisiológicas normais nos organismos vivos. Desde a última década, tem havido um aumento no uso de NPs baseados em metal em aplicações biomédicas, o uso exponencial de NPs alerta as preocupações de segurança para reduzir e / ou prevenir efeitos adversos induzidos por NP no sistema vivo [1]. Entre os NPs, o Cu e o ZnO são geralmente encontrados nos suplementos alimentares e no corpo humano [2, 3]. Propriedades físico-químicas únicas de Cu e ZnONPs atingem aplicações funcionais em processos metabólicos fisiológicos, aumentando assim seu valor comercial nas indústrias [4,5,6]. No entanto, efeitos adversos, incluindo hemólise, desconforto gastrointestinal e danos ao fígado e rins foram observados com a ingestão excessiva de Cu e ZnONPs [7].

Particularmente, a absorção de CuNPs ocorre prontamente após a ingestão, inalação e exposição dérmica [8, 9], significativamente através do trato gastrointestinal [8, 10]. Os CuNPs têm como alvo as células da mucosa e as retêm em seu interior por meio da ligação com metalotioneína ou glutationa [11]. É armazenado principalmente no fígado, cérebro, coração, rins e músculos. Foi relatado que 98% do Cu se liga à ceruloplasmina, uma proteína sérica que causa toxicidade celular. [12, 13] .Cu é um indutor catalítico de radicais superóxido, radicais hidroxila e peróxido de hidrogênio via reação de Haber-Weiss [14], concentrações mais elevadas de Cu podem causar estresse oxidativo induzido.

Com base na extensão da solubilidade, os ZnONPs foram considerados como um grupo separado de NPs dentro dos NPs de óxido metálico [15]. O elemento zinco é encontrado no corpo humano e os ZnONPs são conhecidos por serem de menor toxidade [3]. No entanto, é relatado que o excesso de zinco induz efeitos tóxicos [16]. Liberação de cátions metálicos Zn ² de ZnONPs também são comprovadamente tóxicos em microrganismos e roedores [17]. Os NPs de ZnO podem entrar por diferentes rotas para alcançar o fluxo sanguíneo e induzir impactos adversos nos órgãos [18]. Os resultados preliminares indicaram que os sistemas de órgãos afetados por ZnONPs podem apresentar inflamação, alterações na frequência e funções cardíacas e estresse oxidativo [19, 20]. De acordo com [21], a inalação de ZnONPs de 20 nm (2,5 mg / kg pc) por ratos duas vezes ao dia resultou em um aumento do conteúdo de Zn no fígado após 12 he nos rins após 36 h.

Maior consciência em relação à nanotoxicidade, estudos foram relatados sobre a toxicidade in vivo de CuNPs e ZnONPs para instilação intranasal [22, 23], instilação intratraqueal [24, 25] e administração oral [26,27,28], exposição dérmica [29, 30]. A fim de avaliar a toxicidade, a administração intravenosa (i / v) e intraperitoneal (i / p) deve ser realizada. Até onde sabemos, há relatórios mínimos disponíveis sobre a toxicidade de CuNPs e ZnONPs para administração intravenosa e intraperitoneal. Além disso, o mecanismo toxicológico e a distribuição nos tecidos dos dois NPs ainda não foram sistematicamente estudados após a injeção i / v e i / p.

Por meio deste documento, demonstramos a toxicidade de CuNPs e ZnONPs biossintetizados em intervalos de 16-96 nm em ratos wistar machos por meio de injeções intraperitoneais (i / p) e intravenosas (i / v) no nível desejado no 14º e 28º dias de observação.

Método

Biossíntese de bio-CuNPs e bio-ZnONPs

Síntese biológica de CuNPs e ZnONPs de Enterococcus faecalis não patogênico foi adaptado pelo método enzimático extracelular [31, 32]. Além disso, a forma e o tamanho das nanopartículas sintetizadas foram confirmados usando microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FeSEM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

Estudos in vivo

Animais experimentais e criação de animais

Ratos Wistar machos de 12 a 13 semanas de idade, livres de doenças específicas, foram adquiridos na Mahaveera Enterprises, Hyderabad, Índia. Os animais foram selecionados dentro de uma faixa de peso de 160–200 g para cada grupo e aclimatados por 1 semana antes do início do tratamento, e o estado de saúde dos ratos foi monitorado diariamente. Os animais foram alojados em condições padrão de temperatura (24 ± 1 ° C) e umidade relativa (55 ± 10%), respectivamente, em ciclos claro / escuro de 12 horas. Durante o tratamento, os animais foram alojados em gaiolas com tampas de tela de aço inoxidável. Os animais foram alimentados com dieta granulada padrão disponível comercialmente (VRK Nutrition Solutions, Sangli, Maharashtra, India Ltd.). Água potável foi fornecida aos animais, ad libitum.

Os estudos de toxicidade foram realizados no Luqman College of Pharmacy, Kalaburagi, Índia. O manejo dos animais foi realizado de acordo com as Boas Práticas de Laboratório. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Animais do Instituto (número de aprovação:346 / CPCSEA).

Preparação e administração de Bio-Cu e ZnONPs

As suspensões de estoque de Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs (50 mg / ml) foram preparadas por dissolução separadamente em água destilada duas vezes durante a noite e foram filtradas usando filtros de seringa de 0,22 μ. Os filtrados são usados ​​para preparar o padrão de trabalho com concentração de 1,25-175 μg / ml.

Os animais foram divididos em três grupos de três concentrações diferentes para cada tipo de nanopartícula. Considerando seis ratos / grupo para a via intravenosa (codificados como conjunto do experimento A) e seis ratos / grupo para a via intraperitoneal (codificados como conjunto do experimento B), de acordo com as Tabelas 1 e 2. Em ambos os conjuntos de experimentos grupo A serviu de controle (água destilada do veículo).

Observação e itens de exame

Sinais clínicos

Durante o teste, a observação pós-tratamento foi feita uma vez ao dia para monitorar os sinais de toxicidade clínica e / ou morte.

Consumo de ração e água

O consumo de ração e água foi registado diariamente após a data de início do tratamento, calculado a partir das diferenças entre as quantidades fornecidas e as restantes.

Comportamento animal e peso corporal

A cada dois dias após a injeção, os ratos foram pesados ​​e avaliados quanto a mudanças comportamentais.

Índices hematológicos

Usando uma técnica padrão de coleta de sangue na veia safena, o sangue foi coletado para análise hematológica (usando tubos de coleta de ácido potássio-metilenodiaminotetracético). De acordo com a análise hematológica padrão, 300 μl de sangue foram coletados do rato e em 14 e 28 dias os parâmetros hematológicos padrão, ou seja, contagem de plaquetas, hematócrito, hemoglobina, contagem de glóbulos vermelhos e contagem de leucócitos foram analisados ​​[33].

Análise do painel de bioquímica do soro

Para determinar os níveis bioquímicos séricos, incluindo a alanina aminotransferase (ALT / GPT), creatinina (CRE), aspartato aminotransferase (AST) e fosfatase alcalina (ALP), ratos controle e tratados foram sacrificados e amostras de sangue total foram coletadas para centrifugação (3000 rpm ) por 15 minutos. A avaliação foi realizada por um analisador bioquímico automático para amostras de 14 e 28 dias [34].

Detecção de peso de organelas

Após 14 e 28 dias, os ratos foram anestesiados com éter com solução salina tamponada com fosfato e dissecados. Os órgãos dos grupos controle e tratado foram colhidos imediatamente. Coração, pulmão, timo, cérebro, rim, fígado e baço foram separados cuidadosamente e lavados com solução de cloreto de sódio e enxaguados com água desionizada gelada e secos com papel de filtro. A morfologia e a cor dos órgãos dissecados foram investigados e o peso de cada órgão foi medido. Para examinar o grau de mudanças explicitamente causadas por Bio-Cu e ZnONPs, o índice de órgão (O _X ) foi calculado separadamente usando a fórmula [35]:
$$ \ mathrm {Órgão} \ \ mathrm {index} \ \ left ({\ mathrm {O}} _ {\ mathrm {X}} \ right) =\ frac {\ mathrm {Peso} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {experimental} \ \ mathrm {órgão} / \ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {experimental} \ \ mathrm {animal}} {\ mathrm {Peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {controle} \ \ mathrm {órgão} / \ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {controle} \ \ mathrm {animal}} $$
Where Organ Index (O _X ) pode mudar como:

Índice cardíaco (H _X ), Índice de fígado (Li _X ), Índice do baço (S _X ), Índice pulmonar (Lu _X ), Índice de rim (K _X ), Índice do Timo (T _X ), Índice do cérebro (B _X )

Histologia

Um rato de cada grupo incluindo o controle foi fixado com formalina tamponada a 10% após sangramentos com solução salina tamponada com fosfato. Um pequeno pedaço de fígado, rim, baço e cérebro foi fixado em formalina a 10% e incluído em parafina. Blocos de parafina foram seccionados e processados ​​para coloração por hematoxilina e eosina. Seções coradas foram observadas usando microscopia de campo claro [36].

Análise estatística

Todos os dados são expressos em média ± DP da média das três experiências independentes; cada um foi realizado em triplicado, N =6 ratos por grupo.

Resultados e discussão

A síntese de Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs foi realizada por método enzimático extracelular durante a exposição de reagentes a Enterococcus faecalis sobrenadante. A análise FeSEM de Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs pode ser vista com tamanho variando de 1 a 100 nm na distribuição (arquivo adicional 1). A análise de TEM relata a presença de CuNPs e ZnONPs biossintetizados com morfologia de casca de núcleo de tamanho 12–90 nm e forma esférica para CuNPs [31] e ZnONPs variando de 16 a 96 nm [32] (arquivo adicional 2).

A avaliação de Bio-Cu e ZnONPs em ratos wistar machos foi investigada sem sinais de mortalidade após o tratamento com NP. Além disso, após o tratamento e até o final da duração do experimento, o exame frequente de fezes brancas foi monitorado após a administração i / v de Bio-CuNPs na dosagem de 9,5 a 11,5 μg / kg. Entre a terceira e a quarta semana, os ratos tratados com Bio-CuNPs mostraram um aumento significativo na alimentação e o consumo de água para i / v foi de 9,5 μg / kg (IC ₅₀ ) e 11,5 μg / kg (TLC) enquanto para a via i / p (faixa de dose:24,8 a 30,3 μg / kg) e ratos do grupo de controle da 3ª à 4ª semana. Variação no peso corporal dos ratos após i / v e i / A administração p de Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs foi mostrada nas Tabelas 3 e 4. A redução e o aumento do peso corporal são indicadores valiosos na avaliação da toxicidade de uma amostra de teste [37]. Relatórios anteriores evidenciados em estudos de toxicidade em ouro de 13,5 nm [33] e prata de 100 nm [38] O efeito dos NPs no peso corporal por injeção i / v foi inferior a i / pe administração oral. De acordo com Rhiouani et al. , a baixa diminuição do peso após 4 dias de tratamento em todos os grupos tratados pode sugerir efeitos adversos de substâncias tóxicas nos animais [39].

Pode-se observar que a administração i / v e i / p de Bio-ZnONPs nas três doses diferentes (NOAEC, IC ₅₀ e TLC) o peso corporal foi ligeiramente reduzido até a segunda semana de administração em comparação com o grupo de controle. No entanto, após o 14º dia o peso corporal foi recuperado. No caso de administração i / p, a redução no peso corporal foi induzida por Bio-ZnONPs (30,3 μg / kg) na concentração letal total e foi menor do que o grupo de controle, indicando assim toxicidade trivial por via i / p em relação à via i / v (Tabela 4, Fig. 1a). Da mesma forma, ratos tratados com Bio-CuNPs, nas concentrações de 9,5 μg / kg e 11,7 μg / kg por via i / v, ligeira redução no peso corporal foi observada. Até 14 dias de tratamento com Bio-CuNPs nenhum sinal de efeitos adversos no crescimento e ganho de peso corporal foram observados. A variação do peso corporal em 28 dias com uma dose de 11,7 μg / kg (via i / v) é mostrada na Tabela 3. Após o 14º dia de tratamento, foi encontrada redução considerável no peso corporal por meio da via i / v quando comparado com o controle grupo. Assim, indica toxicidade de Bio-CuNPs por esta via (Fig. 1b). Ratos tratados com Bio-CuNPs via administração da via i / p induziu diminuição menor no peso corporal e nenhum sinal de mortalidade foi observado em ambas as vias i / pe i / v. Portanto, as injeções i / p induziram menor toxicidade (mostrado na Tabela 4 e Fig. 1a).

Alteração no peso corporal de ratos não tratados (controle) e tratados com Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs. Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs tratados através da via de administração (A) intraperitoneal (i / p) e (B) intravenosa (i / v) até o 28º dia de observação. Todos os tratamentos de Bio-CuNPs (Cu) e Bio-ZnONPs (ZnO) em sua concentração letal total foram administrados e mantidos em observação por 28 dias; N =6 ratos por grupo

Índices hematológicos

A estimativa de parâmetros hematológicos como contagem de hemácias, contagem de leucócitos, contagem de plaquetas, nível de hemoglobina e tempo de coagulação do sangue são entidades importantes para medir a toxicidade dos NPs tratados. Para os dias 14 e 28, os resultados da hematologia dependente da concentração são apresentados nas Tabelas 5 e 6 para a via de administração i / pe i / v. Dosagem de Bio-CuNPs a 9,5 μg / kg (IC ₅₀ ) e 11,7 μg / kg (TLC) por via i / v mostrou contagem de RBC reduzida em contraste com Bio-ZnONPs. No entanto, a tendência dependente da concentração não foi observada. Para ratos tratados com Bio-ZnONPs através da via de administração i / v, o nível de hemoglobina, contagem de plaquetas e leucócitos mudaram, mas nenhuma diferença significativa foi observada entre as três concentrações (NOAEC, IC ₅₀ e TLC). Mas no caso da via de administração i / p, diminuição significativa e alterações na contagem de glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, nível de hemoglobina e contagem de plaquetas foram encontrados no 14º dia de observação (Tabela 5) em comparação com o controle e Bio- CuNPs tratados. Surpreendentemente, os efeitos hematológicos são normais no 28º dia (Tabela 6).

Os efeitos hematológicos dos diferentes métodos de injeção (i / v, i / p) para os dois Bio-NPs diferentes no 14º e 28º dias de observações são diversos. Pode ser observado que a hemoglobina, os glóbulos vermelhos, os glóbulos brancos e as plaquetas diminuem por via i / v no tratamento com Bio-CuNPs e via via i / p em ratos tratados com Bio-ZnONPs. Mas a diminuição significativa nas contagens de RBC foi observada. Isso indica que as diferentes vias de injeção não induziram diferenças significativas na contagem de plaquetas, hemoglobina ou leucócitos, exceto em ratos injetados com Bio-CuNPs (via i / v). Os glóbulos vermelhos mostram uma diferença significativa após a injeção i / p e i / v (conforme mostrado nas Tabelas 5 e 6).

Ensaio bioquímico de soro

A creatinina sérica é um produto residual; maior produção de creatinina indica dano renal. Bio-ZnONPs (via i / v:dosagem de 11-16 μg / kg, via i / p:dosagem de 24-30 μg / kg) não afetou significativamente o nível de creatinina sérica quando comparado com o controle no 14º e 28º dia. (Tabelas 7 e 8, Fig. 2a, b). Ratos tratados com Bio-CuNPs (via i / v:dosagem de 06-12 μg / kg) apresentaram aumento do nível de creatinina sérica para 2,3 mg / dl quando comparados ao controle. No entanto, a via de injeção i / p não apresentou alterações significativas (Tabelas 7 e 8). O soro sanguíneo possui um grande número de enzimas, mas para avaliar os sintomas normais e patológicos do fígado, alanina transaminse (glutamato piruvato transaminase) e aspartato transaminases (glutamato oxalato acetato transaminase) são úteis. A aspartato transaminase é de origem mitocondrial e está presente em grandes quantidades no fígado, coração, rim e músculos esqueléticos. A fosfatase alcalina sérica é uma enzima globulina de baixo peso molecular, encontrada em maior concentração nos ossos, trato hepatobiliar e rim. A atividade dessa enzima pode ser determinada pela estimativa do fosfato orgânico liberado do fosfato de glicerol. O nível sérico das enzimas estava aumentado na icterícia hepatocelular e obstrutiva. Na via de administração i / v, os Bio-ZnONPs (40,7 mg / dl, 37,9 IU / L, 82,4 IU / L) não afetaram significativamente os níveis séricos de ALT, AST sérica e ALP em comparação com o controle. Embora a administração i / p tenha mostrado aumento significativo nos níveis de ALT, AST e ALP em comparação com o controle no 14º e 28º dia (Fig. 2a eb). Os resultados do estudo de toxicidade no soro mostraram que os Bio-ZnONPs não apresentaram alterações nos níveis de creatinina, ALT, AST e ALP para a via i / v até 28 dias.

Resultados bioquímicos de ratos tratados com Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs. Os níveis de creatinina, ALT, AST e ALP de S. foram medidos em ratos tratados com Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs através das vias de administração intraperitoneal (i / p) e intravenosa (i / v) no (A) 14º dia e (B) 28º dia. Todos os dados são expressos em média ± DP da média das três experiências independentes; cada um foi realizado em triplicado, N =6 ratos por grupo. Nota:Cu:Bio-CuNPs, ZnO:Bio-ZnONPs, i / p:intraperitoneal, i / v:intravenoso

Em contraste, ratos tratados com Bio-CuNPs por via i / v, apresentaram aumento significativo na ALT sérica (67,7 mg / dl), nível de AST (70 IU / L) e ALP (128 IU / L). O efeito de Bio-CuNPs através da via i / p foi consideravelmente baixo em comparação com o controle. A diferença dos resultados pode ser atribuída à diferença nas vias de dosagem, à toxicidade das nanopartículas e também à duração da administração. Descobrimos que Bio-ZnONPs não têm efeito sobre biomarcadores de função renal e hepática (tanto i / v quanto i / p) em comparação com Bio-CuNPs.

Detecção do peso das organelas e estudo histológico

Mudanças nos pesos dos órgãos de ratos em diferentes doses de Bio-NPs ilustram os efeitos adversos dos NPs nos órgãos. Pode-se ver que os pesos do coração, fígado, baço, pulmão, rins e cérebro são diminuídos em ratos quando tratados com Bio-ZnONPs conforme ilustrado nas Tabelas 9 e 10. Além disso, consideração da reação do órgão e grau de alterações foram examinados calculando o índice do órgão (O _X ) de cada órgão separadamente. Os índices de órgãos para coração, fígado, baço, pulmão, rins, cérebro e timo são apresentados nas Tabelas 9 e 10.

Diferenças no peso do baço e do timo foram observadas após a administração i / v e i / p em ratos tratados com Bio-CuNPs e Bio-ZnONPs. No 14º dia, Bio-ZnONPs mostrou índice de baço diminuído via injeção i / p e aumentado por administração i / v (Tabela 9). No caso de ratos tratados com Bio-CuNPs via i / v, a administração apresentou redução significativa no índice do baço no 14º (0,265) e 28º dia (0,49). Indicando assim, o sistema imunológico foi afetado pela administração i / v de Bio-CuNPs e administração i / p de Bio-ZnONPs. Em caso de administração i / p de Bio-ZnONPs, o sistema imunológico do rato retorna ao estado normal após o 14º dia e prova que o efeito não é prolongado. Em conjunto com a variação de peso corporal anterior, parece que a via de administração i / v de Bio-CuNPs pode afetar o coração, fígado, pulmão, rins e cérebro; além disso, pode danificar o sistema imunológico. Da Fig. 3a, isso implica que o baço e o timo são os principais alvos dos órgãos pelos Bio-CuNPs.

Mudança na morfologia da organela. Onde a baço, b fígado, c rim, d cérebro, e pulmões e f coração de ratos Wistar machos tratados com Bio-CuNPs por via intravenosa em comparação com o controle no 28º dia de observação

No caso de grupos tratados com Bio-CuNPs i / v e i / p, efeitos óbvios no índice de órgãos foram observados em ambos IC ₅₀ e doses de TLC. Além disso, das duas vias de administração diferentes, a injeção intraperitoneal mostra a toxicidade modesta nos grupos tratados com Bio-ZnONPs e a toxicidade mais elevada nos grupos tratados com Bio-CuNPs. A absorção eficiente da droga por injeção i / p era conhecida por ser rápida devido aos vasos sanguíneos densos e linfa no peritônio murino [40]. Correspondentemente, a injeção intravenosa mostra a menor toxicidade nos grupos tratados com Bio-ZnONPs e a maior toxicidade nos grupos tratados com Bio-CuNPs.

Alterações toxicológicas em ratos

Tentamos examinar os efeitos da toxicidade, em diferentes doses e intervalos de tempo de Bio-NPs. Os tecidos tratados com Bio-ZnONPs (via i / v:faixa de dosagem 11-16 μg / kg, via i / p:faixa de dosagem 24-30 μg / kg) não mostraram alterações no fígado, rim, baço e cérebro quando comparados com tecidos de controle (Figs. 4, 5, 6 e 7). As observações de necropsia (autópsia:exame dissecativo de rato morto) especificaram que todos os órgãos de ratos tratados com Bio-NPs exibiram as características anatômicas (por exemplo, características de cor, forma e tamanho) que seriam esperadas com base em sua aparência em animais não tratados. Em comparação com Bio-ZnONPs, ratos tratados com Bio-CuNPs mostraram alterações mais significativas nas características anatômicas dos tecidos do rim, fígado, baço e cérebro em contraste com o controle (Figs. 4, 5, 6 e 7).

Seções de rim de rato coradas com H&E. Ratos tratados por via i / v e i / p com Bio-Cu e ZnONPs; as amostras não tratadas foram consideradas como controle. Onde as seções tratadas com Bio-CuNPs observadas no dia 14 (A – C) e no dia 28 (D – F). Seções tratadas com Bio-ZnONPs no dia 14 (G – I) e no dia 28 (J – L). Cápsula de Bowman BC, G glomerular, túbulo proximal PT, necrose glomerular GN, dano ao túbulo proximal PTD

Secções de baço de rato coradas com H&E. Ratos tratados por via i / v e i / p com Bio-Cu e ZnONPs; as amostras não tratadas foram consideradas como controle. Seções tratadas com Bio-CuNPs observadas no dia 14 (A – C) e no dia 28 (D – F). Seções tratadas com Bio-ZnONPs no dia 14 (G – I) e no dia 28 (J – L). Polpa branca WP, polpa vermelha RP, declínio DRP na polpa vermelha

Seções de fígado de rato coradas com H&E. Ratos tratados por via i / v e i / p com Bio-Cu e ZnONPs; as amostras não tratadas foram consideradas como controle. Seções tratadas com Bio-CuNPs observadas no dia 14 (A – C) e no dia 28 (D – F). Seções tratadas com Bio-ZnONPs no dia 14 (G – I) e no dia 28 (J – L). Veia central CV, células KC Kupffer, vacuolização da veia central CVV (vacuolização citoplasmática), hemorragia hepática HH

Seções de cérebro de rato coradas com H&E. Ratos tratados por via i / v e i / p com Bio-Cu e ZnONPs; as amostras não tratadas foram consideradas como controle. Seções tratadas com Bio-CuNPs observadas no dia 14 (A – C) e no dia 28 (D – F). Seções tratadas com Bio-ZnONPs no dia 14 (G – I) e no dia 28 (J – L). [Todas as lâminas são observadas com ampliação de 40 ×, NIKON eclipse E200 (microscópio trinacular)]

Bio-CuNPs induziu danos por via de administração i / v e mostrou tendência dependente da dose nos tecidos. Na concentração de TLC (11,7 μg / kg), o Bio-CuNPs mostrou graves danos aos tecidos hepático e renal de ratos Wistar. Além disso, Bio-CuNPs tratados por via i / v e i / p induziram necrose de células glomerulares (atrofia glomerular), cápsula de Bowman e tubular proximal em ratos do grupo de 14 e 28 dias (Fig. 4b, e, c e f ) quando comparado ao controle não tratado. A necrose glomerular se deve ao reembolso imunológico, mas os danos aos túbulos se devem principalmente ao efeito tóxico dos NPs. O dano tubular causado pelos efeitos tóxicos de Bio-CuNPs por via i / v e i / p também aumenta a pressão glomerular e causa atrofia glomerular.

O grupo controle normal apresentou estrutura histológica normal do lóbulo hepático e da veia central que é circundada por hepatócitos normais (Fig. 6). Bio-CuNPs tratados por via i / p (19,82 μg / kg) mostraram mudanças histológicas leves, incluindo ativação de células de Kupffer no 14º e 28º dia de observação (Fig. 6b, e). Os ratos tratados com Bio-CuNPs por via i / v mostraram alterações graves, incluindo vacuolização citoplasmática da veia central rodeada de hepatócitos e hemorragia hepática para observação no 14º dia (Fig. 6c). Surpreendentemente, o grupo do 28º dia apresentou alterações moderadas, incluindo alterações gordurosas dos hepatócitos e picnose dos núcleos hepatocíticos (Fig. 6f). O tecido hepático tratado com Bio-ZnONPs, para o 14º dia do grupo administrado pela via i / p, mostrou alterações moderadas demonstradas por alterações gordurosas dos hepatócitos (Fig. 6i). Os grupos tratados com Bio-ZnONPs mostraram ligeira melhora e atividade hepatoprotetora significativa foi observada no 28º dia em comparação com o 14º dia (Fig. 6l). No 14º dia em diante, a restauração da arquitetura hepática normal ocorreu em animais tratados com Bio-ZnONPs.

Foi observado um declínio na célula do baço (polpa vermelha), enquanto um aumento nos linfócitos (polpa branca), no tecido do baço extraído de rato tratado com Bio-CuNPs por via i / v (Fig. 5c, f). Na observação primária, o acréscimo de Bio-CuNPs no baço foi notado na polpa vermelha e foi relacionado com uma perda modesta de massa celular; a redução da massa celular era óbvia no 28º dia, quando comparada com o 14º dia de administração i / v (Fig. 5f), enquanto pequenas alterações foram observadas na depleção da polpa vermelha quando os ratos foram tratados com Bio-CuNPs por via i / p em ponto de tempo do 14º e 28º dia. Structural changes were not seen in the white pulp or in splenic blood vessels (arteries or venous sinuses) and intravascular erythrocytes (Fig. 5b, e). No morphological changes have been found in spleen tissues treated with Bio-ZnONPs (Fig. 5). The H&E-stained brain sections of rats, treated (i/v and i/p) with NPs, showed no changes in brain region, olfactory bulb (perivascular localization) and the choroid plexus and ependyma of the lateral ventricles (Fig. 7).

Conclusion

Animal toxicity studies using 16- to 96-nm-ranged biosynthesized copper (Bio-CuNPs) and zinc oxide (Bio-ZnONPs) was assessed in male Wistar rat at the dose range of 6.1 to 19.82 μg/kg and 11.14 to 30.3 μg/kg respectively for both i/p and i/v routes on 14th and 28th day of observation. We observed no mortality and normal behaviour in the animals treated with Bio-CuNPs and Bio-ZnONPs in their specific dose range. The results also verified the Bio-CuNPs and Bio-ZnONPs at low concentrations do not cause identifiable toxicity even after their breakdown in vivo over time. Increased concentrations of these Bio-NPs induce weight reduction, but no significant statistical difference was observed for Bio-ZnONPs’ treated animals. In the case of i/v and i/p Bio-CuNPs’ treated groups, obvious effects on organ index have been observed at both IC₅₀ and TLC doses. Moreover, of the two different administration routes, the intraperitoneal injection shows the modest toxicity in Bio-ZnONPs’ treated groups and highest toxicity in Bio-CuNPs’ treated groups. Correspondingly, the intravenous injection shows the least toxicity in Bio-ZnONPs’ treated groups and highest toxicity in Bio-CuNPs’ treated groups. Considering all the results of studies, targeting Bio-ZnONPs by intravenous injection is promising for possible biomedical application.

Abreviações

±:

Plus or minus

ALP:

Alkaline phosphatase

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartate aminotransferase

Bio-CuNPs:

Biogenic copper nanoparticles

Bio-ZnONPs:

Biogenic zinc oxide nanoparticles

B_X :

Brain index

CRE:

Creatinine

Cu:

Copper

FesEM:

Field emission scanning electron microscopy

H&E:

Haematoxylin eosin

Hb:

Haemoglobin

H_X :

Heart index

i.e.:

Aquilo é

i/p route:

Intraperitoneal route

i/v route:

Intravenous route

IC:

Inhibitory concentration

K_X :

Kidney index

Li_X :

Liver index

Lu_X :

Lung index

NOAEC:

No observable adverse effect concentration

NPs:

Nanoparticles

O_x :

Organ index

RBC:

hemácia

SD:

Standard deviation

S_X :

Spleen index

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

TLC:

Total lethal concentration

T_X :

Thymus index

WBC:

White blood cell

ZnO:

Zinc oxide

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