Biossensor de cortisol eletroquímico salivar baseado em nanoflocos de dissulfeto de estanho

Resumo

O cortisol, um hormônio esteróide, é secretado pelo sistema hipotálamo-hipófise-adrenal. É um biomarcador bem conhecido de estresse psicológico e, portanto, é conhecido como o "hormônio do estresse". Se a superexpressão do cortisol for prolongada e repetida, ocorre disfunção na regulação do cortisol. Portanto, um teste rápido de ponto de atendimento para detectar o cortisol é necessário. A análise eletroquímica do cortisol salivar é um método não invasivo que é potencialmente útil para permitir a medição rápida dos níveis de cortisol. Neste estudo, filmes multicamadas contendo nanoflocos de dissulfeto de estanho bidimensionais, anticorpo de cortisol (C-M _ab ), e albumina de soro bovino (BSA) foram preparadas em eletrodos de carbono vítreo (GCE) como BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE, e caracterizado usando espectroscopia de impedância eletroquímica e voltametria cíclica. As respostas eletroquímicas do biossensor em função das concentrações de cortisol foram determinadas usando voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial. Este biossensor de cortisol exibiu uma faixa de detecção de 100 pM a 100 μM, um limite de detecção de 100 pM e uma sensibilidade de 0,0103 mA / Mcm ² ( R ² =0,9979). Finalmente, as concentrações de cortisol em amostras autênticas de saliva obtidas usando o sistema eletroquímico desenvolvido correlacionaram-se bem com os resultados obtidos usando ensaios de imunoabsorção enzimática. Este biossensor foi preparado e utilizado com sucesso para a detecção eletroquímica do cortisol salivar em faixas fisiológicas, com base na especificidade das interações anticorpo-antígeno.

Introdução

O cortisol, um hormônio esteróide, é secretado pelo sistema hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA). É um biomarcador bem conhecido de estresse psicológico e, portanto, chamado de “hormônio do estresse” [1, 2]. Os níveis de cortisol seguem um ritmo circadiano ao longo de um ciclo de 24 horas; os níveis mais elevados são observados de manhã cedo, e os níveis reduzem progressivamente à noite [3,4,5,6]. Níveis excessivos de cortisol podem causar doença de Cushing, com sintomas de obesidade central, estrias roxas e fraqueza muscular proximal. No entanto, níveis reduzidos de cortisol podem levar à doença de Addison, com fadiga crônica, mal-estar, anorexia, hipotensão postural e hipoglicemia [7,8,9]. Portanto, manter o equilíbrio adequado de cortisol é essencial para a saúde humana.

Desenvolveu-se um interesse crescente na medição do cortisol como um precursor de eventos médicos e psicologicamente relevantes, entre os quais a aflição mais recente é o transtorno de estresse pós-traumático (TEPT). A importância da função aberrante do eixo HPA no PTSD é indiscutível; portanto, os métodos tradicionais de avaliação ainda são capazes de fornecer evidências e informações abundantes [10,11,12,13,14]. Recentemente, muitos estudos relataram a importância da detecção do cortisol e identificaram correlações com diferentes doenças [15,16,17,18]. Vários estudos confirmaram que o cortisol está relacionado ao transtorno do espectro do autismo [19], depressão [20], ideação suicida [21], adversidades na infância e transtornos externalizantes [22].

Embora a identificação dos níveis de cortisol represente uma importante ferramenta de diagnóstico, técnicas de detecção de cortisol laboratorial de rotina, como cromatografia [23, 24], radioimunoensaio [25], imunoensaio eletroquimioluminescente [26,27,28], ensaio imunoenzimático [28, 29] ], ressonância de plasmão de superfície [1, 30, 31] e microbalança de cristal de quartzo [32] envolvem tempo de análise extenso, são caros e não podem ser implementados em configurações de ponto de atendimento (POC) [33]. Portanto, há atualmente uma necessidade de determinação sensível, eficiente e em tempo real dos níveis de cortisol.

Nos últimos anos, os métodos de imunoensaio eletroquímico, que são estabelecidos no reconhecimento molecular específico entre antígenos e anticorpos, surgiram como uma tecnologia promissora devido às características salientes, como envolver dispositivos simples, análise rápida, baixo custo, teste de POC sem etiqueta, alta sensibilidade e baixos limiares de detecção de cortisol em bifluidos [34, 35]. Mudanças no potencial elétrico são atribuídas a variações na concentração de reações redox eletroquímicas no eletrodo. O cortisol secretado eventualmente entra no sistema circulatório e pode ser encontrado em vários bio-fluidos, como fluido intersticial [36], sangue [37], urina [38], suor [39] e saliva [40]. As vantagens da detecção eletroquímica de cortisol salivar, que é um método não invasivo, com fácil coleta, manuseio e armazenamento de amostras, aumentaram seu potencial de aplicação em sensores POC para medição em tempo real [41].

Um biossensor ideal deve ter limites de detecção baixos, seletividade rápida e alta sensibilidade. Para a fabricação de um imunossensor, a matriz imobilizadora escolhida deve possuir alta funcionalidade de superfície, alto carregamento de biomoléculas e baixa resistência ao transporte de elétrons, com alta taxa de transferência de elétrons [42]. No entanto, nanomateriais de sulfeto de metal têm sido raramente sugeridos para a imobilização de proteínas para biosensorio eletroquímico. Portanto, aqui, o dissulfeto de estanho foi selecionado como uma matriz imobilizadora potencial para o desenvolvimento de imunossensores a fim de detectar o cortisol presente na saliva.

Os materiais nano-bidimensionais (2D) têm atraído abundantes interesses de pesquisa na última década. Há uma variedade de tipos de materiais 2D que variam de semicondutores a metais e de inorgânicos a orgânicos [43,44,45,46] e compostos relacionados [47,48,49,50]. A descoberta, fabricação e investigação em materiais nano 2D são correntes predominantes em vários campos. Dissulfeto de estanho nano 2D (SnS ₂ ), um semicondutor do tipo n com um bandgap de 2,18-2,44 eV [51, 52], consiste em átomos de Sn imprensados ​​entre duas camadas de átomos de enxofre (S) dispostos hexagonalmente e próximos, com camadas S adjacentes ligadas por van der fraco Forças de Waals [53]. Por causa de suas propriedades elétricas intrigantes, alta mobilidade de portadores, boa estabilidade química, baixo custo e propriedades ópticas [54], SnS ₂ evoluiu para um material promissor para várias aplicações em células solares e dispositivos optoeletrônicos [55, 56], como eletrodos em baterias de íon-lítio [57, 58], sensores de gás e monitores de glicose [59, 60]. A seleção do material do eletrodo é um fator chave importante para melhorar o desempenho, fornecendo uma grande área de reação e microambiente favorável para facilitar a transferência de elétrons entre a enzima e a superfície do eletrodo.

Neste trabalho, biossensores foram fabricados usando SnS ₂ como a matriz imobilizadora para detectar o cortisol. Os resultados dos estudos de voltametria de pulso diferencial (DPV) relacionados à detecção eletroquímica mostram uma alta sensibilidade de 0,0103 mA / Mcm ² e a concentração de detecção mais baixa de 100 pM.

Materiais e métodos

Materiais

Hidrocortisona (cortisol), anticorpo anti-cortisol de coelho (anti-cortisol, C-M _ab ), hexacianoferrato de potássio (II), hexacianoferrato de potássio (III), β-estradiol, testosterona, progesterona e corticosterona foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). A albumina de soro bovino (BSA) foi obtida da PanReac. Cloreto de estanho (IV) pentahidratado (SnCl ₄ ^. 5H ₂ O) e tioacetamida (C ₂ H ₅ NS) foram fornecidos pela Showa (Japão) e Alfa Aesar (Reino Unido). Solução salina tamponada com fosfato (PBS) preparada com NaCl, KCl, Na ₂ HPO ₄ , e KH ₂ PO ₄ foram adquiridos da Sigma-Aldrich. A alumina micropolida foi fornecida pela Buehler (Reino Unido). Todos os outros produtos químicos eram de grau analítico e foram usados ​​sem purificação adicional. O kit Cortisol Saliva ELISA (Cat # SA E-6000) foi adquirido na LDN (Alemanha).

Síntese de dissulfeto de estanho

Pós de SnCl ₄ · 5H ₂ O e C ₂ H ₅ Os NS foram misturados em 70 mL de água desionizada e o pH ajustado para 7,4. Um reator autoclave hidrotérmico contendo os reagentes foi aquecido desde a temperatura ambiente até 200 ^° C em 1 h, e mantido a 200 ^° C por 11 h. Então, o SnS resultante ₂ pó foi lavado com água desionizada e etanol a 6000 rpm por 15 min e, finalmente, seco ao ar a 80 ^° C. Este método hidrotérmico foi aplicado com sucesso para a síntese de SnS ₂ .

Caracterização de materiais

A difração de raios-X (XRD, PANalytical, Holanda) foi utilizada para investigar a fase de cristal de SnS hexagonal 2D ₂ flocos. Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo multifuncional (FE-SEM, Zeiss, Alemanha) foi usada para obter imagens da morfologia da superfície dos materiais. Microscopia eletrônica de transmissão de canhão de emissão de campo (FEG-TEM, Tecnai, EUA) foi usada para discernir a microestrutura de SnS ₂ , e difração de área selecionada (SAED, Tecnai) foi usada para obter padrões de cristal.

Fabricação de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Biossensores GCE

Eletrodos de carbono vítreo (GCEs) foram primeiro polidos com pasta de alumina e, em seguida, gotas de uma mistura de 5 M SnS ₂ foram depositados na superfície de GCEs pré-tratados. Soluções de anticorpo anti-cortisol (1 mg / mL) e BSA (1%) foram preparadas em PBS. SnS ₂ / GCE foi então decorado com o anticorpo e as soluções de BSA em sequência. O BSA / C-M fabricado _ab / SnS ₂ / Os biossensores GCE foram armazenados sob refrigeração a 4 ^° C quando não estiver em uso. O conceito de pesquisa e a configuração do sistema de detecção são ilustrados na Fig. 1.

Conceito de pesquisa e configuração do sistema de detecção

Análise eletroquímica

BSA / C-M fabricado _ab / SnS ₂ / GCEs foram caracterizados usando espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e voltametria cíclica (CV) para comparar seus comportamentos eletroativos. Estudos de resposta eletroquímica em função da concentração de cortisol foram conduzidos usando CV e voltametria de pulso diferencial (DPV). Todos os experimentos foram realizados usando um sistema de três eletrodos com um GCE como eletrodo de trabalho, um fio de Pt como eletrodo auxiliar e um eletrodo de calomelano saturado como eletrodo de referência em PBS 10 mM (pH 7,4) contendo Fe 5 mM (CN ) ₆ ^{3- / 4-} . As medições eletroquímicas foram realizadas em uma estação de trabalho eletroquímica modelo CHI6114E (CH Instruments, EUA). As medições de CV e DPV foram realizadas entre -0,4 V e 1,0 V a uma taxa de varredura de 10 mV / s, a menos que especificado de outra forma.

Coleta de amostra de saliva e detecção eletroquímica

Amostra de saliva (2 mL) foi coletada de dois voluntários saudáveis ​​por volta do meio-dia para validação do BSA / C-M desenvolvido _ab / SnS ₂ / GCE. As amostras de saliva foram obtidas sem qualquer filtração e inicialmente armazenadas a -20 ° C para manutenção das características biológicas. Antes da detecção, as amostras de saliva foram descongeladas à temperatura ambiente e centrifugadas a 3500 rpm por 15 min para coletar o sobrenadante para medição. A saliva separada foi armazenada a -20 ° C. O BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE foi utilizado para a detecção eletroquímica das concentrações de cortisol em amostras de saliva. A detecção de cortisol usando análise eletroquímica com o BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE foi comparado com o kit de cortisol ELISA disponível comercialmente mencionado acima.

Estudo de interferência

O efeito inibitório de potenciais agentes de confusão, como outros hormônios esteróides, em BSA / C-M _ab / SnS ₂ A especificidade / GCE foi investigada colocando o biossensor nas seguintes soluções diferentes:100 nM β-estradiol, 100 nM de testosterona, 100 nM de progesterona e 100 nM de corticosterona, por 10 min e, em seguida, varrido por CV. A taxa de varredura foi de 10 mV / s e a faixa de varredura foi de - 0,4 V a 0,6 V.

Detecção de cortisol salivar por ELISA

O ELISA foi realizado nas amostras de saliva de acordo com o protocolo do fabricante. Para estabelecer uma curva de calibração para medições de cortisol, o ensaio foi realizado em uma placa de título de 96 poços contendo seis concentrações de cortisol padrão conhecidas (0,0, 0,1, 0,4, 1,7, 7,0 e 30 ng / mL) para determinar a absorbância de cada poço a 450 nm. A curva de calibração foi ajustada com uma linha de tendência para obter uma equação para o cálculo de amostras desconhecidas.

Resultados e discussão

Análise de material de SnS ₂

Como visto a partir do padrão de XRD na Fig. 2a, o produto sintetizado exibe apenas os picos de XRD correspondentes à fase hexagonal SnS ₂ (Cartão JCPDS nº 89-2358). A Figura 2b, c ilustra as imagens FE-SEM do SnS como sintetizado ₂ tendo morfologia semelhante a flocos uniforme com um tamanho de aproximadamente 300 nm. A Figura 2d – f mostra as imagens FEG-TEM e SAED de SnS ₂ , em que espaçamentos de franja de rede de 0,167 nm e 0,316 nm são identificados para SnS hexagonal ₂ como uma única estrutura cristalina. O empilhamento de nanoflocos é inferior a 10 camadas com uma espessura total inferior a 10 nm.

a Padrão de XRD de SnS ₂ . Imagens FE-SEM de SnS ₂ nanoflocos foram obtidos com ampliações de ( b ) × 250.000 e ( c ) × 100.000. d Imagens FEG-TEM de SnS ₂ nanoflakes. e Seção transversal FEG-TEM de SnS ₂ nanoflakes e imagem FEG-TEM ampliada. f Imagem SAED de SnS ₂ nanoflakes

Respostas eletroquímicas do eletrodo

A corrente de oxidação pode aumentar muito com a adição de dissulfeto de estanho. Como mostrado na Fig. 3a, b, a magnitude da corrente de oxidação reduzida de SnS ₂ / GCE para C-M _ab / SnS ₂ / GCE, seguido por BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE, conforme o valor da resistência de transferência de carga aumentou. Portanto, os resultados indicam que as propriedades do sensor foram modificadas no eletrodo. Inicialmente, BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE foi estudado variando a taxa de varredura de 10 mV / s a ​​100 mV / s, conforme mostrado na Fig. 3c. A mudança na resposta da corrente com a taxa de varredura, conforme plotado na Fig. 3d, mostra que a corrente de oxidação aumentou linearmente com a taxa de varredura e seguiu a relação: I =0,5156 υ – 0,0319 ( R ² =0,9985) em oxidação, e I =0,6758υ – 0,0288 ( R ² =0,9997) na redução. No entanto, quase linearidade para o incremento na corrente de pico com aumento da taxa de varredura com picos redox bem definidos indica um processo de superfície controlada, com transferência de elétrons estável.

a Estudo de resposta CV do eletrodo GCE (curva a), SnS ₂ / Eletrodo GCE (curva b), C-M _ab / SnS ₂ / Eletrodo GCE (curva c), BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Eletrodo GCE (curva d). b Estudo de resposta EIS do GCE, SnS ₂ / GCE, C-M _ab / SnS ₂ / GCE e BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Eletrodos GCE. Detalhe:o circuito equivalente correspondente. c Aumento da magnitude da corrente de resposta à oxidação de BSA / C-M _ab / SnS ₂ Eletrodo / GCE com taxa de varredura aumentada de 10 mV / s para 100 mV / s. d A magnitude da corrente aumentou com o aumento da taxa de varredura. e Estudos de CV de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Eletrodo GCE em função da concentração de cortisol variando de 100 pM a 100 μM. f Curva de linearidade para a resposta de corrente com diferentes concentrações de cortisol. g Estudos DPV de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Eletrodo GCE em função da concentração de cortisol variando de 100 pM a 100 μM. h Curva de linearidade para a resposta de corrente com diferentes concentrações de cortisol

A corrente diminuiu com o aumento da concentração de cortisol na faixa de 100 pM a 100 μM. A diferença na corrente está diretamente relacionada à concentração de cortisol detectada. Valores atuais e picos de oxidação bem separados foram obtidos para BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Eletrodos GCE, como mostrado na Fig. 3e, f. A mudança na corrente com o log da concentração foi quase linear. É claro que a redução no coeficiente de regressão linear é melhor para CV. Portanto, novas medições foram feitas com DPV mais específico e preciso. Os resultados de tais estudos DPV indicaram que a magnitude da resposta da corrente diminuiu com a adição de cortisol, conforme ilustrado na Fig. 3g. Uma curva de calibração apresentada na Fig. 3h traça a magnitude da resposta da corrente e o logaritmo da concentração de cortisol, e foi considerada linearmente dependente e segue a equação: y =- 0,0103 x + 0,0443; R ² =0,9979. Este sensor exibiu uma faixa de detecção entre 100 pM a 100 μM, com limite de detecção de 100 pM e sensibilidade de 0,0103 mA / Mcm ² ( R ² =0,9979).

Estudo de estabilidade de armazenamento

Estudos de CV também foram realizados para estudar a vida útil do BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE em intervalos de 1 dia a 1 semana. Para comparar duas condições de preservação, uma condição foi armazenar os eletrodos secos sob vácuo, enquanto a outra foi armazenar os eletrodos a 4 ° C. A estabilidade do pico redox dos eletrodos a 4 ° C e sob vácuo é mostrada na Fig. 4a, c, respectivamente. É claro que a condição de preservação a 4 ° C era melhor do que sob vácuo. A Figura 4b, d mostra que o valor de estabilidade do eletrodo foi de 82% com os eletrodos armazenados sob vácuo por 7 dias, enquanto o valor de estabilidade do eletrodo foi de 91% com os eletrodos armazenados a 4 ° C. Pode-se observar que a estabilidade dos eletrodos armazenados a 4 ° C foi maior do que sob vácuo. A perda de atividade do eletrodo foi possivelmente causada pela degradação da atividade do anticorpo cortisol sob vácuo. A estabilidade de armazenamento é uma questão crucial para o sensor enzimático. Um revestimento protetor pode ser introduzido no projeto futuro do eletrodo.

Estabilidade de pico redox de BSA / C-M _ab / SnS ₂ Eletrodo / GCE com diferentes condições de preservação ( a e b ) sob vácuo ( c e d ) a 4 ° C por 7 dias

Estudo de interferência

Os resultados dos estudos de CV de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE para medir potenciais agentes de confusão, como β-estradiol (100 nM), testosterona (100 nM), progesterona (100 nM) e corticosterona (100 nM) em relação ao cortisol (10 nM), são mostrados na Fig. 5a. Em comparação com a mudança na resposta do sinal do cortisol, os efeitos da interferência foram menos de 5% do resultado para o cortisol, sugerindo que tais interferências potenciais podem ser convenientemente negligenciadas.

a Estudo de interferência envolvendo β-estradiol (100 nM), testosterona (100 nM), progesterona (100 nM) e corticosterona (100 nM) em relação ao cortisol (1 0 nM). b Comparação de medições de cortisol salivar usando ELISA e métodos eletroquímicos

Detecção de cortisol salivar usando ELISA e métodos eletroquímicos

Medições de amostras de cortisol salivar realizadas com ELISA e o BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE eletrodo estão resumidos na Tabela 1 e Fig. 5b. As concentrações de cortisol determinadas usando ELISA foram 1,105 × 10 ⁻⁸ M e 3,998 × 10 ⁻⁹ M. Os resultados calculados do cortisol usando medição eletroquímica foram 1,046 × 10 ⁻⁸ M e 3,911 × 10 ⁻⁹ M. Boa correlação foi alcançada com essas duas técnicas, exibindo resultados comparáveis ​​com apenas uma diferença de 2–5%. Portanto, os resultados demonstram que este BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE pode ser empregado para detecção eletroquímica de cortisol em fluidos biologicamente relevantes, como a saliva.

Comparação com outros estudos

Os resultados deste estudo foram comparados com outros estudos envolvendo sensores eletroquímicos de cortisol salivar relatados na literatura, a fim de obter uma melhor compreensão do desempenho deste BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE. As tabelas 2 e 3 mostram comparações de resultados obtidos usando eletrodos diferentes de ouro na detecção de cortisol. Existem três vantagens principais no presente trabalho. Primeiro, os materiais são muito mais baratos do que os dispositivos apresentados em outros estudos. Em segundo lugar, o processo de preparação foi relativamente simples e rápido. Por fim, o limite de detecção foi semelhante ao relatado em outra literatura ou, de fato, até melhor do que os relatados, enquanto a faixa de detecção alvo para o cortisol salivar é facilmente obtida.

Conclusões

Um método hidrotérmico foi aplicado com sucesso para a síntese de SnS ₂ . As propriedades de SnS ₂ foram caracterizados por XRD, FE-SEM, FEG-TEM e SAED. As respostas eletroquímicas do eletrodo em função das concentrações de cortisol foram determinadas usando CV e DPV. Nosso sensor de cortisol exibiu uma faixa de detecção de 100 pM a 100 μM, um limite de detecção de 100 pM e sensibilidade de 0,0103 mA / Mcm ² ( R ² =0,9979). Os parâmetros de detecção obtidos estavam em faixas fisiológicas normais. O impacto da interferência potencial foi inferior a 5%, indicando boa especificidade deste sensor. O teste de estabilidade demonstrou que a atividade do sensor armazenado a 4 ° C foi melhor do que sob vácuo. Os resultados deste eletrodo para a medição do cortisol em amostras de saliva foram consistentes com ELISA. Portanto, a análise eletroquímica usando este BSA / C-M _ab / SnS ₂ / O eletrodo GCE pode substituir as abordagens de imunoensaio demoradas mais tradicionais.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados gerados ou analisados ​​durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.

Abreviações

2D:

Bidimensional

BSA:

Albumina sérica bovina

C-M _ab :

Anticorpo cortisol

CV:

Voltametria cíclica

DPV:

Voltametria de pulso diferencial

EIS:

Espectroscopia de impedância eletroquímica

ELISA:

Ensaio de imunoabsorção enzimática

FEG-TEM:

Microscópio eletrônico de transmissão de canhão de emissão de campo

FE-SEM:

Microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo

GCE:

Eletrodos de carbono vítreo

HPA:

Hipotálamo-hipófise-adrenal

PBS:

Salina tamponada com fosfato

POC:

Ponto de atendimento

PTSD:

Transtorno de estresse pós-traumático

SAED:

Difração de área selecionada

XRD:

Difração de raios X

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