Biossensor Eletroquímico Baseado em Nanoflocos de Dissulfeto de Estanho para Detecção Rápida e Sensível de Cortisol Salivar

Resumo

Cortisol, o hormônio do estresse por excelência, é secretado pelo eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e serve como biomarcador crítico para estresse psicológico e fisiológico. A superexpressão prolongada de cortisol pode levar a distúrbios graves como doenças de Cushing e Addison, ressaltando a necessidade de detecção rápida no ponto de cuidado (POC). Aqui, relatamos um ensaio eletroquímico não invasivo para cortisol salivar baseado em um filme multicamada de nanoflocos de dissulfeto de estanho (SnS₂), um anticorpo específico para cortisol (C-M_ab) e albumina sérica bovina (BSA) imobilizados em um eletrodo de carbono vítreo (GCE). O sensor BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE foi caracterizado por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e voltametria cíclica (CV). Voltametria de pulso diferencial (DPV) revelou resposta linear a concentrações de cortisol variando de 100 pM a 100 µM, com limite de detecção (LOD) de 100 pM e sensibilidade de 0,0103 mA M⁻¹ cm⁻² (R² = 0,9979). Amostras de saliva medidas com o sensor corresponderam a resultados de ELISA dentro de uma margem de 5%, demonstrando sua relevância clínica e especificidade. O dispositivo oferece uma alternativa rápida e econômica aos imunoensaios convencionais para monitoramento de biomarcadores relacionados ao estresse.

Introdução

Cortisol é um hormônio esteróide liberado pelo eixo HPA e é o biomarcador mais amplamente usado para avaliar estresse psicológico. Seu ritmo circadiano atinge o pico no início da manhã e declina à noite, e a desregulação pode desencadear condições que variam da síndrome de Cushing à doença de Addison. Monitoramento preciso e em tempo real de cortisol é, portanto, essencial para diagnosticar e gerenciar uma variedade de distúrbios relacionados ao estresse, incluindo TEPT, depressão e transtorno do espectro autista.

Métodos laboratoriais atuais — cromatografia, radioimunoensaio, ELISA, SPR e QCM — são limitados ao laboratório, demorados e caros, limitando seu uso em configurações POC. Imunosensores eletroquímicos, que dependem de interações específicas antígeno-anticorpo, oferecem uma solução promissora com instrumentação simples, leituras rápidas, baixo custo e alta sensibilidade. A medição de cortisol salivar é especialmente atraente porque é não invasiva e requer mínimo manuseio de amostra.

Embora numerosos nanomateriais de sulfeto metálico tenham sido explorados para biossensores, dissulfeto de estanho (SnS₂) raramente foi usado como matriz de imobilização de proteínas. SnS₂ é um semicondutor tipo n com banda proibida de 2,18–2,44 eV, alta mobilidade de portadores e excelente estabilidade química, tornando-o uma plataforma ideal para transdução eletroquímica. Neste trabalho, aproveitamos nanoflocos 2D de SnS₂ para construir um sensor de cortisol altamente sensível que opera em toda a faixa de concentração fisiológica.

Materiais e Métodos

Materiais

Hidrocortisona, anticorpo anti-coelho para cortisol (C-M_ab), hexacianoferrato de potássio (II/III), β-estradiol, testosterona, progesterona, corticosterona e albumina sérica bovina (BSA) foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cloreto de estanho(IV) pentaidratado e tioacetamida foram fornecidos pela Showa (Japão) e Alfa Aesar (Reino Unido), respectivamente. Salina fosfatada tamponada (PBS) e alumina micro-polidada foram obtidos da Sigma-Aldrich e Buehler (Reino Unido). Todos os reagentes foram usados sem purificação adicional. Um kit comercial de ELISA para cortisol (Cat # SA E-6000) foi comprado da LDN (Alemanha).

Síntese de Dissulfeto de Estanho

SnCl₄·5H₂O e C₂H₅NS foram dissolvidos em 70 mL de água desionizada e ajustados para pH 7,4. A solução foi transferida para um autoclave hidrotérmico e aquecida a 200 °C em 1 h, então mantida por 11 h. O pó de SnS₂ resultante foi lavado com água e etanol a 6000 rpm por 15 min e seco a 80 °C no ar, resultando em nanoflocos uniformes.

Caracterização dos Materiais

Difração de raios X (XRD) confirmou a fase hexagonal de SnS₂ (JCPDS 89-2358). Microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FE-SEM) revelou morfologia em flocos com dimensões laterais ~300 nm. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e difração eletrônica de área selecionada (SAED) confirmaram estrutura monocristalina com espaçamentos de rede de 0,167 nm e 0,316 nm; os nanoflocos tinham menos de 10 nm de espessura.

Fabricação dos Biossensores BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE

Eletrodos de carbono vítreo (GCE) foram polidos com suspensão de alumina e depositados por gota com dispersão de SnS₂ 5 M. Os eletrodos foram então incubados sequencialmente com soluções de C-M_ab 1 mg mL⁻¹ e BSA 1% em PBS. Os sensores finalizados foram armazenados a 4 °C quando não em uso.

Análise Eletroquímica

Espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e voltametria cíclica (CV) foram empregadas para avaliar o comportamento eletroativo do sensor. Todas as medições usaram uma célula de três eletrodos: BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE como eletrodo de trabalho, fio de Pt como contraeletrodo e eletrodo de calomel saturado como referência, em PBS 10 mM (pH 7,4) contendo 5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻. Varreduras de CV e voltametria de pulso diferencial (DPV) foram realizadas de –0,4 V a 1,0 V a 10 mV s⁻¹.

Coleta de Amostras de Saliva e Detecção Eletroquímica

Dois voluntários saudáveis forneceram amostras de saliva de 2 mL ao meio-dia. As amostras foram congeladas a –20 °C, descongeladas, centrifugadas (3500 rpm, 15 min), e o sobrenadante foi usado para análise. As medições de cortisol do sensor foram comparadas com resultados do kit ELISA.

Estudo de Interferência

Interferentes potenciais — β-estradiol, testosterona, progesterona, corticosterona (cada 100 nM) — foram testados incubando o sensor por 10 min e medindo a resposta de CV. A influência na detecção de cortisol foi inferior a 5%.

Resultados e Discussão

Análise de Material do SnS₂

O padrão de XRD corresponde à fase hexagonal de SnS₂. Imagens de FE-SEM mostram partículas uniformes, semelhantes a flocos, de 300 nm. TEM confirma flocos monocristalinos com espaçamentos intercamadas de 0,167 nm e 0,316 nm, e espessura total abaixo de 10 nm.

Respostas Eletroquímicas do Eletrodo

A adição de SnS₂ ao GCE aumentou significativamente a corrente de oxidação. A subsequente modificação com anticorpo e BSA aumentou a resistência de transferência de carga, como refletido nos dados de EIS. CV do BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE em taxas de varredura de 10–100 mV s⁻¹ mostrou aumento linear da corrente de pico, confirmando um processo redox reversível controlado por superfície.

Tanto CV quanto DPV demonstraram diminuição monótona da corrente de pico com aumento da concentração de cortisol. DPV produziu relação linear: y = –0,0103 x + 0,0443 (R² = 0,9979), com LOD de 100 pM e sensibilidade de 0,0103 mA M⁻¹ cm⁻². A faixa dinâmica do sensor (100 pM–100 µM) cobre todo o espectro fisiológico de cortisol salivar.

Estudo de Estabilidade de Armazenamento

CV foi realizado em sensores armazenados por 1 dia a 1 semana sob duas condições: vácuo-seco e 4 °C. O armazenamento a 4 °C preservou 91% da corrente de pico redox após 7 dias, comparado a 82% sob vácuo, indicando melhor estabilidade da atividade do anticorpo a temperatura mais baixa.

Estudo de Interferência

Incubação com 100 nM de β-estradiol, testosterona, progesterona e corticosterona produziu <5% de mudança no sinal de cortisol, confirmando alta especificidade do ensaio.

Detecção de Cortisol Salivar por ELISA e Métodos Eletroquímicos

Amostras de saliva de dois voluntários produziram concentrações de cortisol de 1,105 × 10⁻⁸ M e 3,998 × 10⁻⁹ M por ELISA, e 1,046 × 10⁻⁸ M e 3,911 × 10⁻⁹ M pelo sensor eletroquímico — apenas discrepância de 2–5% — confirmando a precisão do sensor.

Comparação com Outros Estudos

Vantagens do presente trabalho incluem: (1) custo de material significativamente menor; (2) protocolo de fabricação rápido e direto; e (3) LOD comparável ou melhor que dispositivos existentes.

Conclusões

Demonstramos um biossensor eletroquímico baseado em nanoflocos de dissulfeto de estanho que fornece LOD de 100 pM e faixa de detecção de 100 pM–100 µM para cortisol salivar, correspondendo à precisão do ELISA. O sensor exibe <5% de interferência de esteróides estruturalmente similares e mantém >90% de atividade após 7 dias a 4 °C. Seu baixo custo, montagem simples e leitura rápida o tornam um candidato atraente para monitoramento de estresse no ponto de cuidado.