Estudos preliminares sobre nanopartículas biodegradáveis de óxido de zinco dopadas com Fe como forma potencial de entrega de ferro ao organismo vivo

Resumo

O ferro é o elemento crucial para os organismos vivos e sua deficiência é descrita como o distúrbio nutricional mais comum em todo o mundo. Hoje em dia, estratégias de suplementação de ferro mais eficazes e seguras para humanos e animais tornam-se um dos desafios mais importantes na terapia de deficiências nutricionais. Nossos estudos anteriores in vivo confirmaram a segurança e a biodegradabilidade das nanopartículas à base de óxido de zinco fabricadas internamente e sua rápida distribuição para a maioria dos órgãos e tecidos do corpo. Os exames in vitro realizados na linha celular Caco-2, um modelo de células epiteliais do trato gastrointestinal, revelaram uma baixa toxicidade dos nanomateriais estudados. No presente estudo, investigamos nanopartículas de óxido de zinco biodegradáveis dopadas com Fe (III) como uma perspectiva de estratégia de suplementação para deficiência de ferro. Nanopartículas biodegradáveis de ZnO:Fe foram administradas por via intragástrica a camundongos adultos e, após 24 h, os animais foram sacrificados com coleta de órgãos internos para análises posteriores. A concentração de ferro medida com espectrometria de absorção atômica e coloração histológica (método de Perl) mostrou uma rápida distribuição de nanopartículas dopadas com ferro para tecidos especificamente relacionados com a homeostase do ferro. O acúmulo de ferro também era visível nos hepatócitos e ao redor dos vasos sanguíneos do baço, o que pode indicar a transferência de nanopartículas dopadas com Fe da corrente sanguínea para o tecido. Assumindo, os resultados preliminares obtidos no presente estudo sugerem que as nanopartículas biodegradáveis de ZnO dopadas com Fe podem ser boas transportadoras de ferro exógeno no corpo vivo. Portanto, as investigações subsequentes se concentram na determinação de mecanismos exatos relacionados com a deposição de ferro no tecido e na influência dos transportadores de nanopartículas no metabolismo do ferro.

Introdução

O ferro é um dos mais importantes componentes da construção de organismos vivos na Terra, incluindo a população humana. A importância deste elemento está relacionada com um papel essencial do ferro em muitas estruturas e processos que ocorrem no corpo, e. transporte de oxigênio ao redor de todo o corpo, tecidos e células (parte da hemoglobina e mioglobina), produção de energia (componente interno das proteínas da cadeia respiratória mitocondrial), muito mais [1, 2]. Assim, o ferro participa de processos vitais cruciais das células e de todo o organismo, e sua deficiência pode levar a distúrbios significativos no funcionamento do corpo vivo.

Como relatórios mundiais mostram, a deficiência de ferro se torna um sério problema de saúde pública na população humana. De acordo com a OMS, quase 30% da sociedade em todo o mundo foi afetada pela anemia nos anos 1993-2005. A prevalência de anemia ainda é muito maior em crianças pequenas e mulheres grávidas [3]. A importância da suplementação de ferro na gravidez está relacionada ao fato de que a deficiência de ferro é um fator de risco para parto prematuro, baixo peso ao nascer em neonatos e sua pior condição geral de saúde [4]. No caso de bebês e crianças em idade pré-escolar, o fator de risco da deficiência de ferro é causado pelo rápido crescimento de todo o corpo e pelo consumo subsequente das reservas de ferro; assim, a suplementação de ferro também é recomendada para crianças de 0 a 5 anos [5]. Curiosamente, existem relatórios científicos que indicam a correlação do nível adequado de ferro em crianças e seu desenvolvimento emocional e neuropsicológico [6]. Além disso, a deficiência de ferro também é um distúrbio nutricional sério entre outras espécies de mamíferos, especialmente em leitões lactentes, onde a oferta intrauterina limitada deste elemento está associada a baixo teor de ferro no leite de porca [7, 8]. Além disso, um rápido crescimento dos leitões rapidamente esgota os estoques de ferro remanescentes, pois em poucos dias os leitões recém-nascidos dobram seu peso corporal, aumentando assim o número de glóbulos vermelhos e o volume geral de sangue. Assim, hoje em dia, a estratégia de suplementação de ferro mais eficaz e segura para a população humana e animal tornou-se um dos desafios mais importantes na prevenção e terapia das deficiências nutricionais.

Existem três formas principais de entrega de ferro extra ao organismo vivo:intravenosa, intramuscular e oral. Cada um deles demonstra vantagens e desvantagens do método. A administração oral parece ser simples e mais natural para o corpo, envolvendo vias fisiológicas de absorção e sistemas de transporte do ferro. Além disso, este método preserva um sistema natural que controla a quantidade de ferro circulante no corpo com base na hepcidina [9]. No entanto, a via oral de suplementação é freqüentemente prejudicada com má absorção e baixa eficiência final. Estudos científicos relataram também que a estratégia de suplementação oral padrão com ferro solúvel afeta fortemente a composição e a atividade metabólica do microbioma intestinal do animal [10]. Por outro lado, as formas intravenosas ou intramusculares de entrega de ferro ao organismo são dificultadas pelo risco de efeitos colaterais tóxicos [11]. Além disso, na suinocultura industrial, o método padrão de suplementação de ferro baseado na administração intramuscular individual de dose única de ferro-dextrano é estressante para os animais e problemático para os criadores. Além disso, a injeção realizada de maneira inadequada pode causar inflamação e outras complicações nos animais, além de contribuir para a disseminação de diversas doenças no rebanho, quando não observadas condições de esterilidade.

Os efeitos colaterais tóxicos mencionados acima do fornecimento de ferro exógeno para o organismo vivo estão associados à ocorrência de elemento de ferro livre e não ligado no corpo, que como um metal de transição (através da mudança na valência) pode levar à produção de radicais livres prejudiciais (nomeadamente oxigênio reativo espécies — ROS) por meio da reação de Fenton [12]. Relatórios científicos indicaram um risco de aumento do nível de radicais livres no organismo como um fator que contribui para várias condições, incluindo:infecções bacterianas, neoplasia ou doenças hepáticas [13]. A estratégia fisiológica natural de prevenir a geração de ROS pelo ferro livre é baseada na ligação do elemento ferro com proteínas particulares em cada etapa de suas vias de absorção e transporte dentro do corpo. Em caso de sobrecarga de ferro oral e sua administração intravenosa / intramuscular, as vias fisiológicas da circulação do ferro são geralmente sobrecarregadas, resultando em rápido aumento de ROS [14].

Nanopartículas à base de ferro (NPs à base de Fe) têm sido amplamente estudadas como uma ferramenta promissora para fins biomédicos. O uso mais extenso dessas nanoestruturas está relacionado às suas propriedades magnéticas; assim, eles têm sido testados principalmente como agentes de contraste para técnicas de diagnóstico clínico voltadas para imagens de tumor ou acúmulo em tecidos específicos [15]. Recentemente, as nanoestruturas também foram estudadas como uma forma nova e mais eficaz de entrega de substâncias bioativas ao organismo. Os portadores de NP podem revelar biodisponibilidade consideravelmente aumentada para o organismo vivo, em comparação com substâncias na forma a granel, o que está principalmente relacionado ao seu tamanho menor [16, 17]. Em um dos estudos, a eficácia dos NPs contendo ferro foi comparada com o sulfato ferroso (suplemento padrão para o tratamento da anemia) em ratos anêmicos. Com base nas análises de sangue, os resultados obtidos mostraram um aumento da biodisponibilidade do ferro após uma dose oral única de NPs com ferro em animais anêmicos. No caso de doses múltiplas de nanopartículas e sulfato ferroso, os resultados obtidos foram semelhantes [18]. Outro estudo descreveu resultados obtidos de nanomateriais à base de Fe como um agente alternativo de entrega de ferro em humanos e um modelo de roedor. Os autores enfatizaram particularmente a segurança superior do nanoFe em comparação com as formas solúveis de ferro, o que resultou na falta de acúmulo de ferro na mucosa intestinal e promoção da microbiota benéfica [19]. Resultados promissores semelhantes foram obtidos no estudo em ratos anêmicos tratados com NPs à base de Fe cobertos com vitamina C, o que permitiu evitar a rota padrão de absorção de Fe a partir do trato gastrointestinal. Os resultados obtidos indicaram a recuperação dos animais testados da doença anêmica, juntamente com a melhoria de seus parâmetros sanguíneos em curto espaço de tempo, comparando com o método padrão de terapia para deficiência de ferro [20].

Material e métodos

Síntese de Nanopartículas

Nanopartículas de óxido de zinco dopadas com ferro (ZnO:Fe NPs) foram sintetizadas usando a técnica hidrotérmica de microondas. Método é bem estabelecido, relativamente barato, biofriendly e industrialmente escalável, capaz de introdução de íons estranhos diferentes como dopantes funcionais [21,22,23,24,25], em uma variedade de óxidos [26,27,28]. A concentração de ferro nas nanopartículas presentes foi fixada em 5% molar. A síntese foi conduzida a partir de nitratos (V):Zn (NO ₃ ) ₂ · 6H ₂ O (99%, Sigma – Aldrich) e Fe (NO ₃ ) ₃ · 9H ₂ O (96%, Carl Roth). Testamos vários fornecedores e escolhemos aqueles que oferecem o produto mais uniforme e que não continha níveis mensuráveis de sobras insolúveis. Os compostos foram dissolvidos em água destilada:17,63 g de nitrato de zinco (V) e 1,25 g de nitrato de ferro (III) (V). A solução límpida foi então alcalinizada usando solução aquosa de amônia a 25% (Carl Roth) até pH 8. O resíduo vermelho resultante foi lavado usando um funil de Büchner, com ~ 1 L de água destilada e filtrado por sucção. O precipitado foi colocado em um recipiente de Teflon de 100 ml, preenchido com água até 80% do volume e então fechado na câmara do reator Ertec Magnum II. O processo hidrotérmico de micro-ondas foi conduzido a 4 MPa por 20 min. Após a reação, o produto vermelho pálido foi coletado e seco durante a noite a 60 ° C.

Caracterização de Nanopartículas

A caracterização do produto foi realizada por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de fotoluminescência (PL) e catodoluminescência (CL) e análise elementar por dispersão de energia (EDX). As medições de MEV foram realizadas com microscópio Hitachi SU-70 de alta resolução (1 nm), equipado com detector de radiação característica e sistema de catodoluminescência GATAN Mono CL3 nos modos de elétron secundário (SE) e transmissão (TE). Os espectros de emissão e excitação da fotoluminescência foram registrados usando espectrofluorímetro Horiba / Jobin-Yvon Fluorolog-3, equipado com lâmpada de xenônio como fonte de excitação e fotomultiplicador Hamamatsu R928P. O espalhamento de luz dinâmico (DLS) e o potencial zeta foram medidos com o sistema de caracterização de partículas DelsaMax Pro. A análise termogravimétrica (TGA) foi conduzida usando o termogravímetro NETZSCH STA 449 F1 Júpiter sob fluxo de argônio. As medições SEM foram realizadas após a deposição das nanopartículas na malha de cobre 400 revestida com policarbonato de ágar. A amostra foi suspensa em água destilada usando o processador ultrassônico Sonics VCX500 e, em seguida, a gota da suspensão foi colocada na tela e seca. A amostra foi preparada após 2 h de sedimentação de partículas mais pesadas.

Modelo In Vitro

Para o estudo atual, foi utilizada a linha celular Caco-2 (células de adenocarcinoma de cólon caucasiana), como modelo de células epiteliais do trato gastrointestinal. A linha de células foi obtida da Coleção Europeia de Culturas de Células Autenticadas - ECACC (Sigma-Aldrich, Cat. No. 86010202). As células foram semeadas em 0,5 × 10 ⁶ células / ml em placas de 6 ou 96 poços e mantidas em Dulbecco's Modification of Eagle's Medium - DMEM (Gibco), suplementado com 10% de soro fetal bovino - FBS (Gibco), 1% de aminoácidos não essenciais - NEAA (Gibco ), 1% de penicilina-estreptomicina-neomicina-PSN (Gibco) e 0,2% de bicarbonato de sódio (Gibco) a 37 ° C e 5% de CO ₂ . Quando 95-100% de confluência foi observada, o meio de cultura de células foi removido e a suspensão de NPs de ZnO:Fe em meio de crescimento fresco foi adicionada. As células foram incubadas com quatro concentrações diferentes de ZnO:Fe NPs (1,0; 0,1; 0,01; e 0,001 mg de ZnO:Fe NPs / ml) por 24 h a 37 ° C e 5% de CO ₂ .

Análises de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada para Caco-2 usando dois métodos:ensaio XTT e coloração com azul de Trypan. Todos os reagentes necessários para o ensaio XTT foram fornecidos com o kit comercial (Cell Proliferation Kit II, Roche). Após a incubação de células cultivadas em placa de 96 poços com diferentes concentrações de NPs de ZnO:Fe, as células foram incubadas com 50 μl de mistura de marcação XTT por 4 h a 37 ° C e 5% de CO ₂ . Posteriormente, a concentração de formazan foi avaliada com método espectrofotométrico. A absorbância foi medida a 470/650 nm e os resultados foram correlacionados com o número de células viáveis. No seguinte experimento, o resultado de absorvância mais alto foi assumido como 100% de viabilidade das células. Os resultados finais foram calculados com base em quatro repetições de experimentos separados ( n =4).

A fim de realizar a coloração com azul de tripano, após as células cultivadas em placas de 6 poços serem incubadas com diferentes concentrações de NPs de ZnO:Fe, as células foram coletadas (0,05% de tripsina e 0,2% de EDTA por 10 min), centrifugadas e o pellet foi novamente suspenso em 1 ml de meio de crescimento. Cem microlitros de solução estéril de azul de tripano a 0,4% foram misturados com 100 μl de suspensão de células. Dez microlitros de amostra foram carregados na lâmina de contagem e analisados usando o software JuLi Br Couting (NanoEnTek) para avaliar o número de células viáveis. Os resultados finais foram calculados com base em três repetições de experimentos separados ( n =3).

Modelo Animal

Para fins deste estudo preliminar, camundongos Balb-c machos adultos ( n =6) foram mantidos individualmente em condições de vida padrão e controladas (período claro-escuro de 12/12 h, 25 ° C, umidade 30%) com comida e água padrão (fornecidos ad libitum). Todos os procedimentos foram aceitos pelo Comitê de Ética Local, acordo nº. WAW2 / 59/2017. Após 7 dias de aclimatação, uma suspensão de NPs de ZnO:Fe em água (10 mg / ml; 0,3 ml / camundongo) foi administrada por gavagem oral (IG) aos animais do grupo experimental ( n =4). Os camundongos do grupo de controle receberam 0,3 ml de água potável por IG ( n =2). Durante o experimento, não observamos nenhuma alteração comportamental nos animais testados, nem anormalidades nos tecidos. Após 24 h, os camundongos do grupo experimental e controle foram sacrificados em CO ₂ -O ₂ câmara (CO2 Box, Bioscape, Merazet) com posterior coleta de tecidos. Metade das amostras recém-coletadas foram congeladas em - 20 ° C para espectrometria de absorção atômica (AAS). A segunda metade dos tecidos foi fixada em formalina tamponada a 4% e transferida para etanol 70% (após 24 h). Posteriormente, as amostras foram desidratadas nas concentrações crescentes de etanol, incluídas em parafina (Leica TP1020, Leica EG1150) e lâminas microscópicas de 6 μm de espessura (ou 4 μm para exames histopatológicos) foram preparadas com micrótomo (Leica RM2255).

Acumulação de ferro avaliada por coloração de Perl

Lâminas de microscopia de baço, fígado e cérebro foram coradas com o método de Perl (azul da Prússia) para a presença de ferro. As amostras foram desparafinizadas e reidratadas em água destilada, a seguir colocadas em uma solução de trabalho com partes iguais de ferricianeto de potássio 5% (Sigma-Aldrich) e ácido clorídrico 5% (Sigma-Aldrich) e coradas por 30 min. Posteriormente, as seções foram enxaguadas em água e contra-coradas com vermelho nuclear rápido (Sigma-Aldrich) por 5 min, enxaguadas em água e montadas sob as lamelas com Permount (Fisher Scientific). As imagens das amostras coradas foram tiradas usando o microscópio Olympus BX60 e o software de aquisição de imagem Cell ^ P. De cada amostra testada, 16 imagens escolhidas aleatoriamente foram selecionadas para exames adicionais com MicroImage v.4.0 (Olympus) de acordo com o protocolo de análise de imagem em casa [29]. Para exames do baço, apenas a polpa vermelha dentro do tecido foi considerada durante as análises. O conteúdo de ferro foi calculado como uma razão entre a área e a intensidade das manchas positivas para ferro (cor azul) e a área dos núcleos das células em uma imagem.

Concentração de ferro em tecidos testados medida com espectrometria de absorção atômica

Amostras de tecido previamente coletadas, armazenadas a −20 ° C e posteriormente descongeladas foram preparadas para posterior avaliação quantitativa da concentração de ferro com o método de espectrometria de absorção atômica (AAS), de acordo com o protocolo descrito em detalhes antes [24]. Resumidamente, os tecidos foram pesados e mantidos por> 16 h na solução contendo 5 ml de ácido nítrico 65% e 1 ml de peróxido de hidrogênio a 30% (Merck). Posteriormente, as amostras foram mineralizadas no sistema de micro-ondas Ethos 900 (Milestone, EUA) em solução líquida e avaliadas com AAS (Perkin-Elmer) quanto ao teor de ferro.

Análise estatística

Os dados obtidos no estudo foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Para avaliação estatística do acúmulo de ferro obtido com a coloração de Perl, ANOVA unilateral com teste post hoc de comparação múltipla de Tukey-Kramer foi realizada para todos os grupos. Para avaliar uma diferença significativa entre os grupos de controle e experimental de análises AAS, um t não pareado teste foi usado. As diferenças significativas entre os grupos controle e experimental em experimentos in vitro foram avaliadas usando ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Dunnett. As análises estatísticas foram calculadas com GraphPad InStat 3.10. Para todos os testes, os resultados obtidos foram considerados estatisticamente significativos com P ≤ 0,05 e P ≤ 0,01 e P ≤ 0,001 como altamente e extremamente significativo.

Resultados

Caracterização de Nanopartículas

Imagens de microscopia eletrônica de varredura (SEM) de nanocristais de ZnO:Fe são cristalizadas em processo hidrotérmico de micro-ondas. O pó seco armazenado após a síntese foi disperso em água usando banho ultrassônico e, em seguida, depositado na malha 400 de cobre. A suspensão resultante do tratamento ultrassônico foi deixada por 2h para aglomeração e sedimentação dos grãos graúdos. Na amostra são comumente vistos cristais de ZnO em forma de prismas hexagonais alongados. Os cristais são alongados na direção do crescimento dos planos C - [001]. A interseção dos prismas é claramente vista na imagem:os hexágonos têm 50–100 nm de tamanho. Basicamente, as nanopartículas são aglomeradas e formam estruturas maiores. Na Fig. 1b, é mostrada essa estrutura de cristais de ZnO:Fe fortemente aglomerados e agrupados. A amostra também é composta por grãos não uniformes cuja distribuição de tamanho contém entre centenas de nanômetros e micrômetros. Não há indicação clara de separação diferente da existência da fase de ZnO, sugerindo ausência de cristalização de fase à base de ferro (por exemplo, óxido de ferro) [30].

Imagens de microscopia eletrônica de varredura de NPs de ZnO:Fe depositados em malha de cobre após sedimentação de grandes agregados. Ampliação 100 kx ( a ) e 20 kx ( b ) Suspensão contendo 1 mg de nanopartículas de ZnO por mililitro de água foi colocada gota a gota na malha de cobre revestida de policarbonato para permitir observações de microscopia de varredura de alta resolução

A análise termogravimétrica (TGA) e calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizadas sob o fluxo de argônio da temperatura ambiente até 800 ° C e os resultados obtidos são mostrados na Fig. 2. A primeira perda de massa ocorreu até 200 ° C e causou uma diminuição da massa da amostra em 4,78% em relação à sua massa inicial. A segunda perda foi registrada entre 200 e 400 ° C e seu valor é de cerca de 7,36%. Não houve outras diminuições de massa até 800 ° C. O primeiro foi relacionado à evaporação de moléculas de água adsorvidas na superfície e o segundo provavelmente foi causado por uma redução dos grupos hidroxila. A curva DSC mostra o pico endotérmico a 118,3 ° C (- 0,6175 mW / mg, evaporação da água) e o pico exotérmico a 283,1 ° C (0,4356 mW / mg, decomposição de grupos hidroxila). Um pequeno efeito relacionado à decomposição indicou que a cristalização quase total das nanopartículas de ZnO:Fe ocorreu no processo hidrotérmico de microondas.

TGA / DSC de ZnO:Fe NPs aquecidos em argônio

A Figura 3 mostra os espectros de fotoluminescência à temperatura ambiente de NPs de ZnO:Fe. O espectro de emissão (Fig. 3a) consiste em duas características:luminescência de baixa intensidade estreita perto da borda da banda (NBE) e luminescência de emissão de nível profundo amplo (DLE) muito intensa. O primeiro atinge o pico em ~ 380 nm, enquanto o segundo em 600 nm. A predominância da intensidade de DLE no espectro sugere que os nanocristais obtidos foram fortemente defectados no nível cristalográfico [31,32,33]. O espectro de excitação (Fig. 3b) indica o mecanismo de emissão de níveis profundos no bandgap de ZnO:Fe.

Emissão de fotoluminescência (PL) ( a , λ _exc =260 nm) e excitação ( b , λ _em =595 nm) espectros de NPs de ZnO:Fe. As amostras foram vertidas livremente na matriz de alumínio e então reequilibradas para permitir medições de PL. As segundas ordens e ordens superiores de comprimento de onda de excitação foram filtradas com filtro passa-banda espectral

O espectro de catodoluminescência de NPs de ZnO:Fe é mostrado na Fig. 4; A relação de intensidade DLE / NBE é de ≈ 25. Picos de banda NBE em ca. 380 nm, a banda DLE contém quatro componentes com pico em ~ 570, 625, 653 nm e muito fraca em 770 nm. De acordo com McCluskey e Jokela [34], a banda de 570 nm está relacionada a vacâncias de oxigênio, enquanto outras foram atribuídas a vacâncias de zinco na rede do tipo wurtzita [35].

Espectro de catodoluminescência (CL) de NPs de ZnO:Fe. O nanopó seco foi peletizado para obtenção do espectro CL proveniente de grande volume da amostra. As bandas mostradas ilustram a quantidade e a qualidade dos defeitos cristalográficos presentes nos nanocristais de óxido de zinco

A quantidade de ferro na amostra foi determinada por meio de duas técnicas:espectroscopia de absorção atômica (AAS) e espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX). No caso do AAS, a suspensão preparada de forma semelhante à usada no experimento com roedores foi analisada para indicar 3,98 de% atômica de Fe no ZnO:Fe. Pelo método EDX, o pó seco foi analisado na malha de cobre para encontrar a concentração de ferro de 4,5% em. em relação aos íons de zinco.

As propriedades da suspensão foram medidas usando os métodos DLS e TEM, com distribuição dos diâmetros das nanopartículas mostrada na Fig. 5. A distribuição é bimodal:para uma população, o diâmetro mais frequente atingiu o pico entre 20 e 100 nm (TEM), bem como entre 50 e 200 nm (DLS). A segunda população contém menor quantidade de objetos maiores 100–500 nm (TEM) e ca. 150–500 nm (DLS). O caráter bimodal das nanopartículas é claramente observado por ambos os métodos mostrados. A alta dispersão de tamanhos na população maior indica que corresponde a nanopartículas aglomeradas. As estatísticas mostradas para diâmetros acima de 100 nm indicam muitas maneiras diferentes de aglomeração de nanopartículas de ZnO:Fe. As nanopartículas em suspensão aquosa foram carregadas negativamente conforme revelado pelo potencial zeta abaixo de 0 V. O valor de aproximadamente - 40 mV também indicou que a suspensão aquosa final era estável e as nanopartículas não tinham afinidade para aglomeração.

Distribuição dos raios hidrodinâmicos das nanopartículas conforme medido em suspensão de água (pontos) e tomadas diretamente de imagens TEM ao longo dos lados mais curtos e mais longos dos nanocristais (ver texto). As nanopartículas foram transferidas para suspensão em água por uma buzina ultrassônica de alta potência. A concentração do material seco foi de 1 mg por 1 ml de água. Após o término da sedimentação, dez medições de mobilidade foram realizadas para obter um gráfico de mobilidade confiável vs. diâmetro de nanopartículas. Os tamanhos do TEM foram obtidos diretamente das imagens:ao longo de c eixo (lados mais longos dos cristais de ZnO) e ao longo de m e a eixos (lados mais curtos dos cristais)

Avaliação Toxicológica In Vitro de Nanopartículas de ZnO:Fe

Ambas as análises de viabilidade celular (XTT e azul de tripano) revelaram absorvância diminuída de células Caco-2 incubadas com NPs de ZnO:Fe, que se correlacionou diretamente com o número de células viáveis. Mudanças estatisticamente significativas foram observadas apenas após 24 h de exposição das células incubadas às maiores concentrações de NPs (1,0 e 0,1 mg / ml), enquanto os níveis fisiológicos de concentração de NPs (0,01 e 0,001 mg / ml) não tiveram efeito significativo nas culturas de células (Figs. 6 e 7).

Viabilidade celular (linha Caco-2) testada pelo método XTT. As células foram expostas por 24 h a uma suspensão de ZnO NPs dopados com ferro em diferentes concentrações como segue:0,001 mg / ml; 0,01 mg / ml; 0,1 mg / ml; e 1 mg / ml. Os resultados representam a porcentagem média de células viáveis (± SEM) para os grupos controle e experimental ( n =4). Diferença significativa de ** P ≤ 0,01 vs. controle foi marcado no gráfico

Viabilidade celular (linha Caco-2) testada com coloração com azul Trypan. As células foram expostas por 24 h a uma suspensão de ZnO NPs dopados com ferro em diferentes concentrações como segue:0,001 mg / ml; 0,01 mg / ml; 0,1 mg / ml; e 1 mg / ml. Os resultados representam a porcentagem média de células viáveis (± SEM) para os grupos controle e experimental ( n =3). Diferença significativa de ** P ≤ 0,01 vs. controle foi marcado no gráfico

Distribuição de ferro em modelo animal

Para avaliar a acessibilidade de ferro in vivo de ZnO:Fe NPs, camundongos ( n =4) recebeu suspensão oral de NPs de ZnO:Fe e após 24 h, os animais foram escarificados com coleta adicional de tecidos cruciais. A avaliação quantitativa do teor de ferro nos tecidos examinados foi analisada com o método AAS para todos os órgãos coletados e calculada com o software Micro Image (com base na coloração de Perl) para tecidos do fígado, baço e cérebro. Apresentado na Fig. 8, os dados mostram um nível elevado de conteúdo de ferro (vs. controle) no coração, músculo esquelético, baço e tecidos do intestino delgado 24 horas após a administração oral de NPs de ZnO:Fe (sem aumento estatisticamente significativo). No caso do osso, o nível médio de ferro no grupo experimental foi apenas ligeiramente mais alto do que no resultado de controle. O conteúdo de ferro no fígado e tecidos cerebrais foi alto e significativamente aumentado ( P ≤ 0,01) 24 h após IG de NPs de ZnO:Fe, vs. grupo controle (Fig. 8). Nos rins, tecidos adiposos visceral e subcutâneo e pulmões, os níveis de Fe caíram 24 horas após a administração de NPs de ZnO:Fe.

Distribuição do ferro nos tecidos analisados 24 horas após a administração IG de NPs de ZnO:Fe. Os dados representam uma porcentagem média de Fe em órgãos testados do grupo experimental ( n = 4) em comparação com o grupo de controle (100% - linha horizontal). O conteúdo de ferro foi analisado com AAS. Diferença significativa de ** P ≤ 0,01 vs. controle

A avaliação do conteúdo de ferro corado com o método de Perl dentro do fígado revelou um valor extremamente significativo ( P ≤ 0,001) aumento do nível de Fe em todos os animais experimentais vs. controle (Fig. 9b). Da mesma forma, os resultados obtidos para a polpa vermelha do tecido do baço mostraram um resultado extremamente significativo ( P ≤ 0,001) aumento do teor de ferro em todos os animais experimentais vs. controle (Fig. 10b). Os dados obtidos da análise do tecido cerebral não indicaram aumento de Fe no grupo experimental 24 h após IG de NPs de ZnO:Fe (Fig. 11b).

Conteúdo de ferro no fígado calculado com a coloração de Perl e software MicroImage. Resultados calculados como uma razão entre a área e a intensidade das manchas positivas para ferro e a área dos núcleos das células. Dados apresentados como resultado médio (± SEM) para cada animal examinado ( a ) e como valor médio (± SEM) para os grupos controle e experimental ( b ) Diferença significativa de * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01 e *** P ≤ 0,001

Conteúdo de ferro na polpa vermelha do baço calculado com a coloração de Perl e software MicroImage. Resultados calculados como uma razão entre a área e a intensidade das manchas positivas para ferro e a área dos núcleos das células. Dados apresentados como resultado médio (± SEM) para cada animal examinado ( a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ) Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001

Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b )

In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).

Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).

Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens

General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).

Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a , b ) and red pulp (c , d ) The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a , b ) or × 20 (c , d ) lens

Discussão

As was mentioned in the “Introduction” section, the iron deficiency is a considerable nutritional disorder in human population, as well as in other mammalian species [3, 7, 8]. Consequently, an implementation of new, more efficient and safe iron supplementation strategy seems to be highly desirable. Currently presented results come from preliminary studies aimed at further, detailed investigations related with potential usage of biodegradable ZnO NPs doped with Fe as a novel strategy for iron supplementation. As was confirmed previously, in-house manufactured zinc-based NPs undergo very efficient absorption after their oral administration with further, rapid distribution to major organs and tissues in the living organism [22,23,24]. Moreover, we reported that these nanostructures demonstrated bio-safety and biodegradability within the body along with fast clearance from the organism [36]. Employed in the current study, the oral way of NP administration provides a highly efficient way of fast delivery of the exogenous nanostructures to the body, based on persorption process [37, 38]. Furthermore, this strategy decreases chance of eventual toxic effects related with administration of iron-doped substances, because of the existence physiological “security mechanisms” related to both Zn and Fe absorption from the gastrointestinal tract. This crucial, physiological pathways of iron distribution may be avoided in case of intravenous/intramuscular application iron-doped substances [14], which can result in increased possibility of occurrence iron-related toxic side effects. The examination of the internalization pathways of the nanoparticles, their dynamics, and cellular systems involved in the process is being currently studied in the frame of other publication. In the current paper, we decided to show overall effect of our nanoparticles on living organism, focusing on the effect of iron.

Toxicity of nanostructures may be related with various features of material, not only with chemical composition, but also with e.g. size, shape, or their ability to aggregate [39]. Nevertheless, it was confirmed that smaller NPs were better absorbed than bigger one and high surface-to-volume ratio makes the particles of some metals exceptionally reactive and cytotoxic [40, 41]. Nanostructures were able to enter cells and affect their components, which altered the viability of cells [42, 43]. In one of the previous investigations on cytotoxicity of ZnO or FeO NPs, authors did not observe toxic effects (based on ability of examined cells to grow and divide), even in high doses of NPs [44]. Presented here is a study performed on Caco-2 cell line, as a model of epithelial cells of the gastrointestinal tract, revealing a low toxicity of used nanomaterials. ZnO:Fe NPs in small/physiological doses (0.001 mg/ml and 0.001 mg/ml) did not alter the viability of cells (Figs. 6 and 7). Following the incubation of Caco-2 cells with high doses of ZnO:Fe NPs, a statistically significant decrease of viability was observed. However, IC50 (the half maximal inhibitory concentration), as a measure of the effectiveness of a substance in inhibiting a specific biological or biochemical function, still remained surprisingly high—around 1 mg/ml (Figs. 6 and 7). Observed drop of cell viability was probably associated with the physical deposition of nanoparticles on the surface and overstress of the cells rather than the cytotoxic effect related to the nanoparticles themselves. In another study, authors concluded decrease IC50 of cells from cancer cell line following incubation with ZnO and ZnO:Fe3O4 NPs and relatively low cytotoxicity effect (and non-dose-depended) of examined NPs on noncancerous cells [45]. Similar observations were also reported for ZnO and platinum NPs [46, 47]. Nevertheless, further examinations on chronic toxicity profile of such composites including antioxidant activity profiling, production of reactive oxygen species (ROS), and using another cells and cell line must be performed.

Obtained in the in vivo experiment, results indicated a rapid distribution of ZnO:Fe NPs to tissues mostly related with iron homeostasis (Figs. 8, 9, and 10). Similar studies, concerning the bioavailability of iron from “nano” form, were mostly performed on anemic animals or examined following the iron depletion period [18, 19, 48], where our preliminary studies were carried out on healthy, normally maintained mice. Comparison of data presented in the current work with similar studies may be misleading because of differences in employed NPs e.g. their size, shape and compound or route, dose, and frequency of their administration to animals. Results of iron level in the liver showed significantly increased level at 24 h after application of ZnO:Fe NPs, comparing with control (Figs. 8 and 9). Iron accumulation was visible in hepatocytes of liver tissue (Fig. 12), where the major storage site of the element takes place [49]. Similarly, previous studies with intraperitoneally injected iron oxide, magnetic NPs to rats also resulted in 55% accumulation of these nanomaterials in the liver at 6 h following injection [50]. Likewise, the spleen level of iron in the current study was clearly higher in experimental group, than within control (Figs. 8 and 10). Interestingly, tendency of iron accumulation was detected around blood vessels within the spleen, which might indicate the transfer of ZnO:Fe NPs from general bloodstream into the tissue (Fig. 13b, d). Primary accumulation of nanostructures within the liver and spleen after their application might also be attributed with clearance via mononuclear phagocytes in these tissues, as was also postulated previously [50,51,52].

In case of brain tissue, the measurement of total iron level (AAS method) showed significantly higher level of the element in animals with previously administered ZnO:Fe NPs (Fig. 8), which was not confirmed by analysis based on Perl’s staining (Fig. 11). Inconsistency between both, employed in the study methods, may be related with sensitivity of Perl’s staining. This histological method of iron visualization is dedicated to detect iron aggregates. Iron contained in the “nano” form, additionally distributed within the tissue without physiological deposits of these elements, might not be sensitive enough to stain these extremely small deposits of iron. Possibility of overcoming the blood-brain barrier with manufactured by us nanostructures was already described [23, 24, 53]. In another study, with intraperitoneally administered superparamagnetic maghemite iron oxide NPs to mice, no accumulation of iron in experimental group was detected, nor within brain or heart tissues, which is inconsistent with our results [52]. Another study, focused on a distribution pattern of iron oxide magnetic NPs within living organism, indicated similar circulation mechanism of nanostructures as in our study—increased level of Fe within the brain and heart after administration of NPs [51]. Increased level of iron in heart tissue may be caused by presence of ZnO:Fe NPs in the general blood stream and consequently its higher level within the tissue. Likewise, higher level of iron within a skeletal muscle detected in AAS analyses is probably related with intensive blood circulation within this muscle and in case of small intestine, the improved content of iron is caused by residues of orally administered NPs.

Conclusões

In conclusion, we performed the preliminary study on the distribution of biodegradable ZnO:Fe NPs as a perspective, new supplementation strategy in iron deficiency. Deposition of iron in the body of mice following oral administration of the nanostructures was detected within the crucial tissues, where the major storage site of the element takes place. We assumed that obtained in the study results might indicate the biodegradable ZnO:Fe NPs as a good carriers of exogenous iron in the living body. However, further research is needed to completely understand the exact mechanisms of the deposition, elimination, and influence of ZnO:Fe NPs on the body.