Nanopartículas Biodegradáveis de Óxido de Zinco Dopado com Ferro: Promissor Sistema de Entrega de Ferro para Aplicações Biológicas

Resumo

O ferro é o elemento crucial para organismos vivos e sua deficiência é descrita como o distúrbio nutricional mais comum em todo o mundo. Atualmente, estratégias de suplementação de ferro mais eficazes e seguras para humanos e animais tornaram-se um dos desafios mais importantes na terapia de deficiências nutricionais. Nossos estudos prévios in vivo confirmaram a segurança e biodegradabilidade de nanopartículas baseadas em óxido de zinco fabricadas internamente e sua rápida distribuição à maioria dos órgãos e tecidos do corpo. Exames in vitro realizados na linhagem celular Caco-2, modelo de células epiteliais do trato gastrointestinal, revelaram baixa toxicidade dos nanomateriais estudados. No estudo atual, investigamos nanopartículas biodegradáveis de óxido de zinco dopadas com Fe(III) como estratégia promissora de suplementação para deficiência de ferro. Nanopartículas biodegradáveis ZnO:Fe foram administradas por via intragástrica a camundongos adultos e, após 24 h, os animais foram sacrificados com coleta de órgãos internos para análises posteriores. A concentração de ferro medida com espectrometria de absorção atômica e coloração histológica (método de Perl) mostrou uma rápida distribuição de nanopartículas dopadas com ferro para tecidos especificamente relacionados com a homeostase do ferro. O acúmulo de ferro também foi visível dentro de hepatócitos e ao redor de vasos sanguíneos no baço, o que pode indicar a transferência de nanopartículas dopadas com Fe da corrente sanguínea para o tecido. Em resumo, resultados preliminares obtidos no estudo atual sugerem que nanopartículas biodegradáveis de ZnO dopadas com Fe podem ser bons carreadores de ferro exógeno no corpo vivo. Portanto, investigações subsequentes focadas na determinação de mecanismos exatos relacionados com a deposição de ferro no tecido e influência dos carreadores nanoparticulados no metabolismo do ferro são necessárias.

Introdução

O ferro é um dos componentes mais importantes na construção de organismos vivos na Terra, incluindo a população humana. A importância deste elemento está relacionada com o papel essencial do ferro em muitas estruturas e processos que ocorrem no corpo, por exemplo, transporte de oxigênio por todos os tecidos e células do corpo (parte da hemoglobina e mioglobina), produção de energia (componente de proteínas da cadeia respiratória mitocondrial) e muitos mais [1, 2]. Assim, o ferro participa de processos vitais cruciais de células e de todo o organismo e sua deficiência pode levar a distúrbios significativos no funcionamento do corpo vivo.

Como mostram relatórios mundiais, a deficiência de ferro torna-se um sério problema de saúde pública na população humana. Segundo a OMS, quase 30% da sociedade em todo o mundo foi afetada por anemia nos anos 1993–2005. A prevalência de anemia é ainda muito maior em crianças pequenas e mulheres grávidas [3]. A importância da suplementação de ferro na gravidez está relacionada ao fato de que a deficiência de ferro é um fator de risco para parto prematuro, baixo peso ao nascer de neonatos e sua condição geral de saúde pior [4]. No caso de lactentes e crianças pré-escolares, o fator de risco de deficiência de ferro é causado pelo rápido crescimento de todo o corpo e subsequente consumo das reservas de ferro; assim, a suplementação de ferro também é recomendada para crianças entre 0 e 5 anos [5]. Curiosamente, existem relatórios científicos indicando a correlação do nível adequado de ferro em crianças e seu desenvolvimento emocional e neuropsicológico [6]. Além disso, a deficiência de ferro também é um sério distúrbio nutricional entre outras espécies de mamíferos, especialmente em leitões lactentes, onde o fornecimento intrauterino limitado deste elemento é acoplado com baixo teor de ferro no leite da porca [7, 8]. Também, o rápido crescimento dos leitões esgota rapidamente os restos de reservas de ferro, pois em poucos dias leitões recém-nascidos dobram seu peso corporal, aumentando assim o número de glóbulos vermelhos e volume sanguíneo geral. Assim, atualmente, estratégias de suplementação de ferro mais eficazes e seguras para populações humana e animal tornaram-se um dos desafios mais importantes na prevenção e terapia de deficiências nutricionais.

Existem três principais vias de entrega extra de ferro ao organismo vivo: intravenosa, intramuscular e oral. Cada uma delas demonstra vantagens e desvantagens do método. A administração oral parece ser simples e mais natural para o corpo, envolvendo vias fisiológicas de absorção e sistemas de transporte de ferro. Além disso, este método preserva um sistema natural de controle da quantidade de ferro circulante no corpo baseado na hepcidina [9]. No entanto, a via oral de suplementação é frequentemente assolada por pobre absorção e baixa eficiência final. Estudos científicos também relataram que a estratégia padrão de suplementação oral de ferro solúvel afeta fortemente a composição e atividade metabólica do microbioma intestinal animal [10]. Por outro lado, vias intravenosas ou intramusculares de entrega de ferro ao organismo são dificultadas pelo risco de efeitos colaterais tóxicos [11]. Além disso, na suinocultura industrial, o método padrão de suplementação de ferro baseado em administração individual, intramuscular, de dose única de ferro-dextran é estressante para os animais e problemático para criadores. Além disso, injeção mal realizada pode causar inflamação e outras complicações nos animais, bem como contribuir para a disseminação de várias doenças no rebanho, quando condições de esterilidade não são observadas.

Os efeitos colaterais tóxicos mencionados acima da entrega exógena de ferro ao organismo vivo estão associados à ocorrência de elemento ferro livre e não ligado no corpo, que como metal de transição (através de mudança de valência) pode levar à produção de radicais livres prejudiciais (espécies reativas de oxigênio — ROS) através da reação de Fenton [12]. Relatórios científicos indicaram risco de nível aumentado de radicais livres no organismo como fator contribuinte para várias condições, incluindo: infecções bacterianas, neoplasia ou doenças hepáticas [13]. A estratégia natural e fisiológica de prevenir a geração de ROS por ferro livre baseia-se na ligação do elemento ferro com proteínas particulares em cada etapa de suas vias de absorção e transporte dentro do corpo. No caso de sobrecarga oral de ferro e sua administração intravenosa/intramuscular, as vias fisiológicas de circulação de ferro são geralmente sobrecarregadas, resultando em aumento rápido de ROS [14].

Nanopartículas baseadas em ferro (Fe-based NPs) têm sido amplamente estudadas como ferramenta promissora para propósitos biomédicos. O uso mais extensivo dessas nanoestruturas está relacionado com suas propriedades magnéticas; assim, elas têm sido principalmente testadas como agentes de contraste para técnicas de diagnóstico clínico voltadas a imagem de tumores ou acúmulo em tecidos particulares [15]. Recentemente, nanoestruturas também têm sido estudadas como uma nova forma mais eficaz de entrega de substâncias bioativas ao organismo. Carreadores NP podem revelar biodisponibilidade consideravelmente aumentada para o organismo vivo, comparadas com substâncias em forma bruta, o que está principalmente relacionado com seu tamanho menor [16, 17]. Em um dos estudos, a eficácia de NPs contendo ferro foi comparada com sulfato ferroso (suplemento padrão para tratamento de anemia) em ratos anêmicos. Baseando-se em análises de sangue, os resultados obtidos mostraram aumento da biodisponibilidade de ferro após dose única oral de NPs com ferro em animais anêmicos. No caso de doses múltiplas de nanopartículas e sulfato ferroso, os resultados obtidos foram semelhantes [18]. Outro estudo descreveu resultados obtidos de nanomateriais baseados em Fe como agentes alternativos de entrega de ferro em humanos e modelo de roedor. Os autores enfatizaram particularmente a segurança superior do nanoFe comparado com formas solúveis de ferro, que resultou em ausência de acúmulo de ferro na mucosa intestinal e promoção de microbiota benéfica [19]. Resultados promissores semelhantes foram obtidos no estudo em ratos anêmicos tratados com NPs baseadas em Fe revestidas com vitamina C, que permitiram evitar a rota padrão de absorção de Fe do trato gastrointestinal. Os resultados obtidos indicaram recuperação dos animais testados da doença anêmica junto com melhora de seus parâmetros sanguíneos em curto tempo, comparado com método padrão de terapia de deficiência de ferro [20].

Materiais e Métodos

Síntese de Nanopartículas

Nanopartículas de óxido de zinco dopadas com ferro (ZnO:Fe NPs) foram sintetizadas usando técnica hidrotérmica de micro-ondas. O método é bem estabelecido, relativamente barato, bioamigável e industrialmente escalável, capaz de introduzir diferentes íons estrangeiros como dopantes funcionais [21,22,23,24,25], em uma variedade de óxidos [26,27,28]. A concentração de ferro nas nanopartículas atuais foi definida em 5% molar. A síntese foi conduzida a partir de nitratos(V): Zn(NO₃)₂·6H₂O (99%, Sigma–Aldrich) e Fe(NO₃)₃·9H₂O (96%, Carl Roth). Testamos vários fornecedores e escolhemos os que oferecem o produto mais uniforme que não continha níveis mensuráveis de resíduos não solúveis. Compostos foram dissolvidos em água destilada: 17,63 g de nitrato de zinco(V) e 1,25 g de nitrato de ferro(III)(V). A solução clara foi então alcalinizada usando solução aquosa de amônia 25% (Carl Roth) para pH 8. O resíduo vermelho resultante foi lavado usando funil Büchner, com ~ 1 L de água destilada e filtrado a vácuo. O precipitado foi colocado em vaso de Teflon de 100 ml, preenchido com água até 80% do volume e então fechado na câmara do reator Ertec Magnum II. O processo hidrotérmico de micro-ondas foi conduzido a 4 MPa por 20 min. Após a reação, o produto vermelho pálido foi coletado e seco durante a noite a 60 °C.

Caracterização de Nanopartículas

A caracterização do produto foi conduzida usando microscopia eletrônica de varredura (SEM), fotoluminescência (PL) e espectroscopia de catodoluminescência (CL), e análise elementar dispersiva de energia (EDX). Medidas SEM foram conduzidas com microscópio Hitachi SU-70 de alta resolução (1 nm), equipado com detector de radiação característica e sistema de catodoluminescência GATAN Mono CL3 em modos de elétrons secundários (SE) e transmissão (TE). Os espectros de emissão e excitação de fotoluminescência foram registrados usando espectrofluorímetro Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3, equipado com lâmpada de xênon como fonte de excitação e fotomultiplicador Hamamatsu R928P. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta foram medidos com sistema de caracterização de partículas DelsaMax Pro. Análise termogravimétrica (TGA) foi conduzida usando termogravímetro NETZSCH STA 449 F1 Jupiter sob fluxo de argônio. Medidas SEM foram conduzidas após deposição das nanopartículas em malha de cobre 400 revestida com policarbonato Agar. A amostra foi suspensa em água destilada usando processador ultrassônico Sonics VCX500, e então uma gota da suspensão foi colocada na malha e seca. A amostra foi preparada após sedimentação de 2 h de partículas mais pesadas.

Modelo In Vitro

Para o estudo atual, a linhagem celular Caco-2 (células de adenocarcinoma de cólon caucasiano) foi usada, como modelo de células epiteliais do trato gastrointestinal. A linhagem celular foi obtida da European Collection of Authenticated Cell Cultures — ECACC (Sigma–Aldrich, Cat. No. 86010202). As células foram semeadas a 0,5 × 10⁶ células/ml em placas de 6 ou 96 poços e mantidas no Meio de Modificação de Dulbecco do Eagle — DMEM (Gibco), suplementado com 10% soro fetal bovino — FBS (Gibco), 1% aminoácidos não essenciais — NEAA (Gibco), 1% penicilina-estreptomicina-neomicina — PSN (Gibco), e 0,2% bicarbonato de sódio (Gibco) a 37 °C e 5% CO₂. Quando confluência de 95–100% foi observada, o meio de cultura celular foi removido e suspensão de ZnO:Fe NPs em meio de crescimento fresco foi adicionada. As células foram incubadas com quatro diferentes concentrações de ZnO:Fe NPs (1,0; 0,1; 0,01; e 0,001 mg de ZnO:Fe NPs/ml) por 24 h a 37 °C e 5% CO₂.

Análises de Viabilidade Celular

A viabilidade celular foi avaliada para Caco-2 usando dois métodos: ensaio XTT e coloração com azul de tripano. Todos os reagentes necessários para o ensaio XTT foram fornecidos do kit comercial (Cell Proliferation Kit II, Roche). Após a incubação de células cultivadas em placa de 96 poços com diferentes concentrações de ZnO:Fe NPs, as células foram incubadas com 50 µl de mistura de marcação XTT por 4 h a 37 °C e 5% CO₂. Subsequentemente, a concentração de formazan foi avaliada com método espectrofotométrico. A absorbância foi medida a 470/650 nm e os resultados foram correlacionados com o número de células viáveis. No experimento seguinte, o resultado de absorbância mais alto foi assumido como 100% de viabilidade das células. Resultados finais foram calculados baseados em quatro replicatas experimentais separadas (n = 4).

Para realizar a coloração com azul de tripano, após as células cultivadas em placas de 6 poços serem incubadas com diferentes concentrações de ZnO:Fe NPs, as células foram coletadas (0,05% tripsina e 0,2% EDTA por 10 min), centrifugadas e o pellet foi ressuspenso em 1 ml de meio de crescimento. Cem microlitros de solução estéril de azul de tripano 0,4% foram misturados com 100 µl de suspensão celular. Dez microlitros da amostra foram carregados no slide de contagem e analisados usando Software JuLi Br Couting (NanoEnTek) para avaliar o número de células viáveis. Resultados finais foram calculados baseados em três replicatas experimentais separadas (n = 3).

Modelo Animal

Para propósitos deste estudo preliminar, camundongos Balb-c adultos, machos (n = 6) foram mantidos individualmente sob condições de vida padrão e controladas (período luz-escuro 12/12 h, 25 °C, umidade 30%) com alimento e água padrão (fornecidos ad libitum). Todos os procedimentos foram aceitos pelo Comitê Ético Local, acordo n. WAW2/59/2017. Após 7 dias de aclimatação, uma suspensão de ZnO:Fe NPs em água (10 mg/ml; 0,3 ml/camundongo) foi administrada por gavagem oral (IG) a animais do grupo experimental (n = 4). Camundongos do grupo controle receberam 0,3 ml de água potável por IG (n = 2). Durante o experimento, não notamos nenhuma mudança comportamental nos animais testados nem anormalidades teciduais. Após 24 h, camundongos de ambos os grupos experimental e controle foram sacrificados em câmara CO₂-O₂ (CO2 Box, Bioscape, Merazet) com subsequente coleta de tecidos. Metade das amostras recém-coletadas foram congeladas a −20 °C para espectrometria de absorção atômica (AAS). A segunda metade dos tecidos foi fixada em formalina tamponada 4% e transferida para etanol 70% (após 24 h). Subsequentemente, as amostras foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol, incluídas em parafina (Leica TP1020, Leica EG1150) e lâminas microscópicas finas de 6 µm (ou 4 µm para exames histopatológicos) foram preparadas com micrótomo (Leica RM2255).

Acúmulo de Ferro Avaliado pela Coloração de Perl

Lâminas de microscopia de baço, fígado e cérebro foram coradas com o método de Perl (azul da Prússia) para a presença de ferro. As amostras foram desparafinizadas e reidratadas até água destilada, então colocadas em uma solução de trabalho com partes iguais de 5% ferricianeto de potássio (Sigma–Aldrich) e 5% ácido clorídrico (Sigma–Aldrich) e coradas por 30 min. Subsequentemente, as seções foram enxaguadas em água e contra-coradas com vermelho nuclear-rápido (Sigma–Aldrich) por 5 min, enxaguadas em água, e montadas sob lamínulas com Permount (Fisher Scientific). Imagens das amostras coradas foram tiradas usando microscópio Olympus BX60 e software de aquisição de imagem Cell^P. De cada amostra testada, 16 imagens escolhidas aleatoriamente foram selecionadas para exames posteriores com MicroImage v.4.0 (Olympus) de acordo com protocolo de análise de imagem caseiro [29]. Para exames de baço, apenas a polpa vermelha dentro do tecido foi levada em conta durante as análises. O teor de ferro foi calculado como razão da área e intensidade de manchas positivas para ferro (cor azul) para a área de núcleos celulares dentro de uma imagem.

Concentração de Ferro em Tecidos Testados Medida com Espectrometria de Absorção Atômica

Amostras de tecido previamente coletadas, armazenadas a −20 °C, e subsequentemente descongeladas foram preparadas para avaliação quantitativa adicional da concentração de ferro com método de espectrometria de absorção atômica (AAS), de acordo com o protocolo descrito em detalhes antes [24]. Brevemente, os tecidos foram pesados e mantidos por > 16 h na solução contendo 5 ml de ácido nítrico 65% e 1 ml de peróxido de hidrogênio 30% (Merck). Subsequentemente, as amostras foram mineralizadas no sistema de micro-ondas Ethos 900 (Milestone, EUA) em solução líquida e avaliadas com AAS (Perkin-Elmer) para teor de ferro.

Análise Estatística

Dados obtidos no estudo foram apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Para avaliação estatística do acúmulo de ferro obtido com coloração de Perl, ANOVA one-way com teste post hoc de comparações múltiplas Tukey-Kramer foram realizados para todos os grupos. Para avaliar diferença significativa entre grupos controle e experimental das análises AAS, um teste t não pareado foi usado. Diferenças significativas entre grupos controle e experimental em experimentos in vitro foram avaliadas usando ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Dunnett. Análises estatísticas foram calculadas com GraphPad InStat 3.10. Para todos os testes, os resultados obtidos foram considerados estatisticamente significativos com P ≤ 0,05 e P ≤ 0,01 e P ≤ 0,001 como altamente e extremamente significativos.

Resultados

Caracterização de Nanopartículas

Imagens de microscopia eletrônica de varredura (SEM) de nanocristais ZnO:Fe cristalizados no processo hidrotérmico de micro-ondas são mostradas na Fig. 1. O pó seco armazenado após a síntese foi disperso em água usando banho ultrassônico, e então depositado na malha de cobre 400. A suspensão resultante do tratamento ultrassônico foi deixada por 2 h para aglomeração e sedimentação de grãos grandes. Na comumente são vistos cristais de ZnO com forma de prismas hexagonais alongados. Os cristais são alongados na direção de crescimento dos planos c — [001]. A interseção dos prismas é claramente vista na imagem: hexágonos têm 50–100 nm de tamanho. Basicamente, as nanopartículas são aglomeradas e formam estruturas maiores. Na Fig. 1b, mostra-se tal estrutura de cristais ZnO:Fe fortemente aglomerados e agrupados. A amostra também é composta de grãos não uniformes cuja distribuição de tamanho contém entre centenas de nanômetros e micrômetros. Não há indicação clara de existência de fase separada diferente de ZnO, sugerindo ausência de cristalização de fase baseada em ferro (ex: óxido de ferro) [30].

Análise termogravimétrica (TGA) e calorimetria exploratória diferencial (DSC) foram realizadas sob fluxo de argônio de temperatura ambiente a 800 °C e os resultados obtidos são mostrados na Fig. 2. A primeira perda de massa ocorreu até 200 °C e causou uma diminuição da massa da amostra em 4,78% em relação à sua massa inicial. A segunda perda foi registrada entre 200 e 400 °C e seu valor é cerca de 7,36%. Não houve outras diminuições de massa até 800 °C. A primeira estava relacionada à evaporação de moléculas de água adsorvidas na superfície e a segunda provavelmente causada por uma redução de grupos hidroxila. A curva DSC mostra pico endotérmico a 118,3 °C (−0,6175 mW/mg, evaporação de água) e pico exotérmico a 283,1 °C (0,4356 mW/mg, decomposição de grupos hidroxila). Pequeno efeito relacionado à decomposição indicou que quase a cristalização completa de nanopartículas ZnO:Fe ocorreu no processo hidrotérmico de micro-ondas.

A Figura 3 mostra espectros de fotoluminescência à temperatura ambiente de ZnO:Fe NPs. O espectro de emissão (Fig. 3a) consiste em duas características: luminescência de borda de banda estreita de baixa intensidade (NBE) e luminescência de nível profundo (DLE) muito intensa e ampla. A primeira tem pico em ~ 380 nm enquanto a segunda em 600 nm. O domínio da intensidade DLE no espectro sugere que os nanocristais obtidos eram fortemente defeituosos no nível cristalográfico [31,32,33]. O espectro de excitação (Fig. 3b) indica o mecanismo de emissão de níveis profundos na lacuna de banda de ZnO:Fe.

O espectro de catodoluminescência de ZnO:Fe NPs é mostrado na Fig. 4; razão de intensidade DLE/NBE ≈ 25. A banda NBE tem pico em ca. 380 nm, a banda DLE contém quatro componentes com picos em ~ 570, 625, 653 nm e muito fraco em 770 nm. Segundo McCluskey e Jokela [34], a banda de 570 nm está relacionada a vacâncias de oxigênio, enquanto as outras foram atribuídas a vacâncias de zinco na rede do tipo wurtzita [35].

A quantidade de ferro na amostra foi determinada usando duas técnicas: espectroscopia de absorção atômica (AAS) e espectroscopia de raios X dispersiva de energia (EDX). No caso de AAS, a suspensão preparada similarmente à usada no experimento com roedores foi analisada para indicar 3,98% atômico de Fe no ZnO:Fe. Pelo método EDX, o pó seco foi analisado na malha de cobre para encontrar concentração de ferro de 4,5% at. em relação aos íons de zinco.

As propriedades da suspensão foram medidas usando métodos DLS e TEM, com distribuição de diâmetros das nanopartículas mostrada na Fig. 5. A distribuição é bimodal: para uma população, o diâmetro mais frequente estava com pico entre 20 e 100 nm (TEM) assim como entre 50 e 200 nm (DLS). A segunda população contém menor quantidade de objetos maiores 100–500 nm (TEM) e ca. 150–500 nm (DLS). O caráter bimodal das nanopartículas é claramente observado por ambos os métodos mostrados. Alta dispersão de tamanhos na população maior indica que ela corresponde a nanopartículas aglomeradas. Estatísticas mostradas para diâmetros acima de 100 nm indicam muitas maneiras diferentes que as nanopartículas ZnO:Fe estão aglomerando. As nanopartículas em suspensão aquosa eram negativamente carregadas como revelado pelo potencial zeta abaixo de 0 V. Valor de aproximadamente −40 mV também indicou que a suspensão aquosa final era estável e as nanopartículas não tinham afinidade por aglomeração.

Avaliação Toxicológica In Vitro de Nanopartículas ZnO:Fe

Ambas as análises de viabilidade celular (XTT e Azul de Tripano) revelaram absorbância diminuída de células Caco-2 incubadas com ZnO:Fe NPs, que correlacionou diretamente com o número de células viáveis. Mudanças estatisticamente significativas foram observadas apenas após exposição de 24 h de células incubadas às maiores concentrações de NPs (1,0 e 0,1 mg/ml), enquanto níveis fisiológicos de concentração de NPs (0,01 e 0,001 mg/ml) não tiveram efeito significativo nas culturas celulares (Figs. 6 e 7).

Distribuição de Ferro no Modelo Animal

Para avaliar a acessibilidade in vivo de ferro a partir de ZnO:Fe NPs, camundongos (n = 4) receberam oralmente suspensão de ZnO:Fe NPs e, após 24 h, os animais foram sacrificados com coleta adicional de tecidos cruciais. A avaliação quantitativa do teor de ferro dentro dos tecidos examinados foi analisada com método AAS para todos os órgãos coletados e calculada com software Micro Image (baseado em coloração de Perl) para tecidos de fígado, baço e cérebro. Apresentado na Fig. 8, os dados mostram um nível aumentado de teor de ferro (vs. controle) em coração, músculo esquelético, baço e tecidos do intestino delgado 24 h após administração oral de ZnO:Fe NPs (nenhum aumento estatisticamente significativo). No caso de osso, o nível médio de ferro dentro do grupo experimental foi apenas ligeiramente maior que no resultado do controle. O teor de ferro em tecidos de fígado e cérebro foi significativamente aumentado (P ≤ 0,01) 24 h após IG de ZnO:Fe NPs, vs. grupo controle (Fig. 8). Nos rins, tecidos adiposos viscerais e subcutâneos, e pulmões, os níveis de Fe caíram 24 h após administração de ZnO:Fe NPs.

A avaliação do teor de ferro corado com o método de Perl dentro do fígado revelou um nível extremamente significativo (P ≤ 0,001) aumentado de Fe em todos os animais experimentais vs. controle (Fig. 9b). Similarmente, resultados obtidos para a polpa vermelha do tecido do baço mostraram um aumento extremamente significativo (P ≤ 0,001) de teor de ferro em todos os animais experimentais vs. controle (Fig. 10b). Dados obtidos da análise de tecido cerebral indicaram nenhum aumento de Fe no grupo experimental 24 h após IG de ZnO:Fe NPs (Fig. 11b).

No caso do teor de ferro de cada animal dos grupos experimental e controle, os resultados foram coletados nas Figs. 9a, 10a e 11a. O nível mais alto e significativamente diferente (P ≤ 0,05 e P ≤ 0,01) de ferro dentro do tecido hepático foi detectado para camundongos – 2 (24 h 2), comparando com resultados do grupo controle (Fig. 9a). Níveis de manchas de ferro em polpas vermelhas do baço dentro do grupo experimental foram similares; no entanto, a maioria deles foi estatisticamente maior (P ≤ 0,05 ou P ≤ 0,01) que camundongo – 1 (CTRL 1) do grupo controle (Fig. 10a). Resultados obtidos para tecido cerebral foram similares entre cada animal dos grupos experimental e controle (Fig. 11a).

Seções de tecidos de fígado e baço coradas com o método de Perl também foram avaliadas qualitativamente. Aumento no número de depósitos de ferro (manchas azul claro) foi visível dentro de hepatócitos de seções de fígado do grupo experimental (Fig. 12).

Maior acúmulo geral de ferro (manchas azuis) dentro da polpa vermelha que na polpa branca do baço foi observado em ambos os grupos controle e experimental (Fig. 13). Após aplicação de ZnO:Fe NPs, o nível mais alto de ferro foi particularmente visível dentro da polpa vermelha, comparando com imagens do grupo controle (Fig. 13c, d). No grupo experimental, uma concentração aumentada de ferro também foi notável ao redor de vasos sanguíneos (Fig. 13b, d).

Discussão

Como mencionado na seção "Introdução", a deficiência de ferro é um distúrbio nutricional considerável na população humana, bem como em outras espécies de mamíferos [3, 7, 8]. Consequentemente, a implementação de novas estratégias de suplementação de ferro mais eficientes e seguras parece ser altamente desejável. Os resultados apresentados atualmente vêm de estudos preliminares voltados a investigações detalhadas relacionadas com o uso potencial de NPs biodegradáveis de ZnO dopadas com Fe como nova estratégia para suplementação de ferro. Como foi confirmado anteriormente, NPs baseadas em zinco fabricadas internamente sofrem absorção muito eficiente após sua administração oral com distribuição rápida adicional para órgãos e tecidos principais no organismo vivo [22,23,24]. Além disso, relatamos que estas nanoestruturas demonstraram bio-segurança e biodegradabilidade dentro do corpo junto com rápida eliminação do organismo [36]. Empregada no estudo atual, a via oral de administração de NPs fornece uma maneira altamente eficiente de entrega rápida de nanoestruturas exógenas ao corpo, baseada no processo de persorção [37, 38]. Além disso, esta estratégia diminui a chance de eventuais efeitos tóxicos relacionados com a administração de substâncias dopadas com ferro, devido à existência de "mecanismos de segurança" fisiológicos relacionados à absorção de Zn e Fe do trato gastrointestinal. Estas vias fisiológicas cruciais de distribuição de ferro podem ser evitadas no caso de aplicação intravenosa/intramuscular de substâncias dopadas com ferro [14], o que pode resultar em aumento da possibilidade de ocorrência de efeitos colaterais tóxicos relacionados ao ferro. O exame das vias de internalização das nanopartículas, sua dinâmica e sistemas celulares envolvidos no processo está sendo estudado atualmente no âmbito de outra publicação. No artigo atual, decidimos mostrar o efeito geral de nossas nanopartículas no organismo vivo, focando no efeito do ferro.

A toxicidade de nanoestruturas pode estar relacionada com várias características do material, não apenas com composição química, mas também com, por exemplo, tamanho, forma ou sua capacidade de agregar [39]. No entanto, foi confirmado que NPs menores eram melhor absorvidas que maiores e a alta razão superfície-volume torna partículas de alguns metais excepcionalmente reativas e citotóxicas [40, 41]. Nanoestruturas eram capazes de entrar nas células e afetar seus componentes, o que alterava a viabilidade das células [42, 43]. Em uma das investigações anteriores sobre citotoxicidade de NPs de ZnO ou FeO, os autores não observaram efeitos tóxicos (baseados na capacidade das células examinadas de crescer e dividir), mesmo em altas doses de NPs [44]. Apresentado aqui é um estudo realizado em linhagem celular Caco-2, como modelo de células epiteliais do trato gastrointestinal, revelando baixa toxicidade dos nanomateriais usados. ZnO:Fe NPs em doses pequenas/fisiológicas (0,001 mg/ml e 0,001 mg/ml) não alteraram a viabilidade das células (Figs. 6 e 7). Após a incubação de células Caco-2 com altas doses de ZnO:Fe NPs, uma diminuição estatisticamente significativa de viabilidade foi observada. No entanto, IC50 (concentração inibitória máxima metade), como medida da eficácia de uma substância em inibir uma função biológica ou bioquímica específica, permaneceu surpreendentemente alto — em torno de 1 mg/ml (Figs. 6 e 7). A queda observada de viabilidade celular foi provavelmente associada com a deposição física de nanopartículas na superfície e estresse excessivo das células, em vez de efeito citotóxico relacionado às próprias nanopartículas. Em outro estudo, os autores concluíram diminuição do IC50 de células de linhagem cancerígena após incubação com NPs de ZnO e ZnO:Fe3O4 e efeito citotóxico relativamente baixo (e não dependente de dose) dos NPs examinados em células não cancerígenas [45]. Observações similares também foram relatadas para NPs de ZnO e platina [46, 47]. No entanto, exames adicionais sobre perfil de toxicidade crônica de tais compostos incluindo perfil de atividade antioxidante, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), e usando outras células e linhagens celulares devem ser realizados.

Obtidos no experimento in vivo, os resultados indicaram uma rápida distribuição de ZnO:Fe NPs para tecidos principalmente relacionados com a homeostase do ferro (Figs. 8, 9 e 10). Estudos similares, concernentes à biodisponibilidade de ferro da forma "nano", foram principalmente realizados em animais anêmicos ou examinados após período de depleção de ferro [18, 19, 48], onde nossos estudos preliminares foram realizados em camundongos sadios, mantidos normalmente. A comparação de dados apresentados no trabalho atual com estudos similares pode ser enganosa devido a diferenças em NPs empregadas, por exemplo, seu tamanho, forma e composto ou via, dose e frequência de sua administração a animais. Resultados de nível de ferro no fígado mostraram nível significativamente aumentado a 24 h após aplicação de ZnO:Fe NPs, comparando com controle (Figs. 8 e 9). Acúmulo de ferro foi visível em hepatócitos de tecido hepático (Fig. 12), onde o principal local de armazenamento do elemento ocorre [49]. Similarmente, estudos anteriores com NPs magnéticas de óxido de ferro injetadas intraperitonealmente em ratos também resultaram em 55% de acúmulo desses nanomateriais no fígado a 6 h após injeção [50]. Da mesma forma, o nível de ferro no baço no estudo atual foi claramente maior no grupo experimental que no controle (Figs. 8 e 10). Curiosamente, tendência de acúmulo de ferro foi detectada ao redor de vasos sanguíneos dentro do baço, o que pode indicar a transferência de ZnO:Fe NPs da corrente sanguínea geral para o tecido (Fig. 13b, d). Acúmulo primário de nanoestruturas dentro do fígado e baço após sua aplicação também pode ser atribuído à depuração via fagócitos mononucleares nestes tecidos, como também foi postulado anteriormente [50,51,52].

No caso de tecido cerebral, a medição do nível total de ferro (método AAS) mostrou nível significativamente maior do elemento em animais com ZnO:Fe NPs administrados anteriormente (Fig. 8), o que não foi confirmado por análise baseada em coloração de Perl (Fig. 11). Inconsistência entre ambos os métodos empregados no estudo pode estar relacionada com a sensibilidade da coloração de Perl. Este método histológico de visualização de ferro é dedicado a detectar agregados de ferro. Ferro contido na forma "nano", adicionalmente distribuído dentro do tecido sem depósitos fisiológicos destes elementos, pode não ser sensível o suficiente para colorir estes depósitos extremamente pequenos de ferro. A possibilidade de superar a barreira hematoencefálica com nanoestruturas fabricadas por nós já foi descrita [23, 24, 53]. Em outro estudo, com NPs superparamagnéticas de óxido de ferro maghemita administradas intraperitonealmente em camundongos, nenhum acúmulo de ferro no grupo experimental foi detectado, nem no cérebro ou tecidos cardíacos, o que é inconsistente com nossos resultados [52]. Outro estudo, focado em um padrão de distribuição de NPs magnéticas de óxido de ferro dentro de organismo vivo, indicou mecanismo de circulação similar de nanoestruturas como em nosso estudo — nível aumentado de Fe dentro do cérebro e coração após administração de NPs [51]. Nível aumentado de ferro em tecido cardíaco pode ser causado pela presença de ZnO:Fe NPs na corrente sanguínea geral e consequentemente seu nível mais alto dentro do tecido. Da mesma forma, nível mais alto de ferro dentro de músculo esquelético detectado em análises AAS é provavelmente relacionado com circulação sanguínea intensa dentro deste músculo e no caso de intestino delgado, o conteúdo melhorado de ferro é causado por resíduos de NPs administrados oralmente.

Conclusões

Em conclusão, realizamos o estudo preliminar sobre a distribuição de NPs biodegradáveis ZnO:Fe como uma perspectiva, nova estratégia de suplementação em deficiência de ferro. A deposição de ferro no corpo de camundongos após administração oral das nanoestruturas foi detectada dentro dos tecidos cruciais, onde o principal local de armazenamento do elemento ocorre. Assumimos que os resultados obtidos no estudo podem indicar as NPs biodegradáveis ZnO:Fe como bons carreadores de ferro exógeno no corpo vivo. No entanto, pesquisas adicionais são necessárias para compreender completamente os mecanismos exatos da deposição, eliminação e influência de ZnO:Fe NPs no corpo.

Disponibilidade de Dados e Materiais

As conclusões do seguinte estudo são baseadas nos dados apresentados neste manuscrito.

Abreviações

NPs:

Nanopartículas

ZnO:Fe NPs:

Nanopartículas de óxido de zinco dopadas com ferro

IG:

Intragástrica

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

PL:

Espectroscopia de fotoluminescência

CL:

Espectroscopia de catodoluminescência

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

Caco-2 cells:

Células de adenocarcinoma de cólon caucasiano

DMEM:

Modificação de Dulbecco do meio de Eagle

FBS:

Soro fetal bovino

NEAA:

Aminoácidos não essenciais

PSN:

Penicilina-estreptomicina-neomicina

EDTA:

Ácido etilenodiaminotetraacético

AAS:

Espectrometria de absorção atômica

SEM (em análise estatística):

Erro padrão da média