Um dispositivo portátil baseado em sensor térmico plasmônico para detecção e quantificação de ensaio de fluxo lateral

Resumo

O teste point-of-care (POCT) é amplamente utilizado para o diagnóstico precoce e monitoramento de doenças. O ensaio de fluxo lateral (LFA) é uma ferramenta comercial de sucesso para POCT. No entanto, o LFA freqüentemente sofre de uma falta de quantificação e sensibilidade analítica. Para resolver essas desvantagens, desenvolvemos anteriormente um LFA térmico usando nanopartículas de ouro plasmônico para contraste térmico em um dispositivo portátil. Embora esta metodologia melhore significativamente a sensibilidade analítica em comparação com a detecção visual convencional, problemas de quantificação ainda permanecem. Neste estudo, otimizamos as condições de operação do dispositivo utilizando os modos de sensoriamento térmico por condução e radiação, permitindo a quantificação do LFA. O limite de detecção das tiras contendo apenas nanopartículas foi reduzido em 5 vezes (modo de condução) e 12 vezes (modo de radiação) em comparação com a detecção visual tradicional. O efeito da temperatura ambiente foi estudado para ambos os métodos de detecção mostrando que o modo de radiação foi mais afetado pela temperatura ambiente do que o modo de condução. Para validar o método de sensoriamento térmico, o biomarcador de gonadotrofina coriônica humana (HCG) foi quantificado usando nossas tiras de LFA, obtendo um limite de detecção de 2,8 mIU / mL ao usar o método de detecção de radiação.

Introdução

A detecção precoce e o diagnóstico rápido são importantes para o rastreamento e tratamento da doença. A maioria dos testes médicos consome muito tempo e exige preparação complicada de amostras clínicas, grandes instrumentos e profissionais de laboratório bem treinados [1]. Esses requisitos têm dificultado muito o tratamento médico em áreas com recursos limitados. O teste de ponto de atendimento (POCT) utiliza equipamentos simples e minimiza o tempo necessário para obter resultados clinicamente relevantes, permitindo que médicos e pacientes tomem decisões rapidamente. O POCT tem algumas vantagens óbvias, como curto tempo de detecção, rápido processamento de amostra, instrumentação simples e baixos requisitos de operação [2, 3]. Assim, o surgimento de POCT pode ajudar no diagnóstico precoce e rápido de doenças, especialmente em áreas com recursos limitados, melhorando assim as condições médicas. No entanto, baixa sensibilidade analítica, procedimentos operacionais complicados e altos custos de equipamentos geralmente dificultam a aplicação desta técnica. Portanto, mais trabalho é urgentemente necessário para encontrar aplicações POCT com a maioria das características ideais, enquanto minimiza as desvantagens.

Para resolver alguns desses problemas, o ensaio de fluxo lateral (LFA) é um ótimo candidato como ferramenta de teste no POCT. LFA é um biossensor de tira de ponto de atendimento baseado em papel usado para identificar analitos alvo em uma determinada amostra [4, 5]. O LFA é realizado em uma tira à base de papel (Esquema 1b), que é composta de uma almofada de amostra, almofada de conjugado, almofada de absorção e uma membrana de nitrocelulose onde ocorre a detecção. Dentre as vantagens do LFA, vale mencionar sua rapidez e ensaio em uma única etapa, custo-benefício, fácil operação, pequeno volume de amostra e longa vida útil em diferentes condições ambientais [6, 7]. O LFA convencional fornece resultados “sim ou não” pela inspeção das mudanças de cor na linha de teste a olho nu, o método mais popular de detecção para esses tipos de ensaios. Assim, este tipo de abordagem tende a sofrer com a falta de precisão e julgamento subjetivo [8]. No entanto, uma vez que é fácil integrar o LFA com dispositivos eletrônicos, uma abordagem de detecção viável é desenvolver leitores de tiras para obter resultados quantitativos precisos. Dispositivos de carga acoplada (CCD) ou sensores semicondutores de óxido metálico complementar (CMOS) são normalmente aplicados para capturar imagens em leitores de tiras. O software de processamento de imagens é freqüentemente adotado para obter resultados quantitativos. Nestes leitores ópticos, as informações ópticas obtidas a partir da reflexão, transmissão ou espalhamento da luz de uma fonte externa são gravadas para permitir a quantificação [9,10,11,12]. Em leitores colorimétricos, a intensidade da cor, como valor de cinza ou coordenadas RGB, é coletada das linhas de teste e controle para analisar as tiras LFA [13,14,15,16,17]. Uma desvantagem dessa abordagem é que o corante pode perder sua cor com o tempo por fotodano, meios mecânicos ou outros processos de degradação, resultando em repetibilidade e precisão insatisfatórias. Naqueles sistemas que recorrem a leitores de fluorescência [18, 19], os fluoróforos orgânicos são expostos a um comprimento de onda de excitação específico que induz a emissão do fluoróforo presente nas tiras em um comprimento de onda maior. Essa luz emitida é então coletada para obter uma detecção quantitativa. O problema que não pode ser ignorado é que os fluoróforos orgânicos usualmente utilizados nessas aplicações sofrem fotobranqueamento e degradação química, que causam uma atenuação do sinal ao longo do tempo, exigindo manuseio específico e armazenamento especial [7].

Conceito de sensoriamento térmico plasmônico. a O modelo do dispositivo portátil e os componentes principais (parte superior) com dois modos de detecção diferentes (parte inferior). b LFA sob configuração de sensor térmico

Recentemente, o sensoriamento térmico é gradualmente aplicado à detecção de LFA. A detecção térmica consiste na utilização de um transdutor de calor em que o calor gerado é aumentado na presença do analito, permitindo detectar este sinal térmico pelo referido transdutor. Polo et al. [20] exploraram o conceito de sensoriamento conduzido por aquecimento plasmônico pela detecção de antígeno carcinoembrionário de biomarcador de câncer (CEA) usando uma fonte de luz infravermelha próxima (NIR) para induzir a geração de calor usando as propriedades plasmônicas de nanopartículas de ouro anisotrópicas. Qin et al. [21] propuseram um método usando contraste térmico para quantificar o LFA usando um laser verde como fonte de luz, que mostrou uma melhora de 32 vezes na sensibilidade analítica. Em 2016, um leitor de contraste térmico semelhante [22] foi desenvolvido por Wang que aumentou a sensibilidade analítica de 8 vezes na quantificação de LFA. A fonte de luz que é utilizada para induzir a geração de calor pelo transdutor pode ser ajustada em comprimentos de onda específicos para evitar que seja afetada pela presença de outras moléculas que não absorvem nesses comprimentos de onda, garantindo a especificidade da detecção. O uso de fontes de luz localizadas na região NIR do espectro eletromagnético permite evitar a absorção da luz pela maioria das moléculas de origem biológica, principalmente do sangue [23]. Essas vantagens mostram que o sensor térmico plasmônico com fonte de luz NIR é um método de detecção de LFA promissor. No entanto, em pesquisas anteriores, nenhum dispositivo POCT foi desenvolvido empregando tiras de LFA junto com uma fonte de luz NIR.

Aqui, desenvolvemos um dispositivo portátil baseado em sensor térmico plasmônico (Esquema 1a) que melhora a sensibilidade analítica em LFA sem modificação extra das tiras. O sinal foi amplificado colocando a ressonância do plasmon em plena ação após a irradiação do laser NIR. O comprimento de onda do laser no protótipo encontra-se dentro do pico de ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) das nanopartículas (que atuam como transdutores de luz para calor em nosso ambiente), gerando calor na linha de teste. Em seguida, a geração de calor é detectada por um sensor térmico localizado no dispositivo que mede o calor gerado por emissão infravermelha (radiação) ou por condução de calor. A quantidade de calor gerada é proporcional ao número de nanopartículas na linha de teste e ao poder de irradiação [24]. Nenhuma operação adicional é necessária.

A transferência térmica tem três formas principais:condução, convecção e radiação. Para estudar o desempenho de detecção de diferentes formas de transferência térmica, testamos o modo de condução (contato) e o modo de radiação (sem contato) por dois tipos de sensores (Esquema 1a e Arquivo Adicional 1:Figura S1). Todo o protótipo é compacto e usa tecnologia de sistema embarcado e componentes montados em superfície. Os principais fatores que influenciam a capacidade de detecção foram investigados para otimizar as condições de operação. Para verificar a capacidade de detecção do dispositivo portátil, as tiras de LFA carregadas diretamente com nanopartículas na membrana foram quantificadas e comparadas com a detecção visual convencional. Como nosso método de detecção é dependente da temperatura, o efeito da temperatura ambiente na detecção do sinal térmico também foi estudado e uma curva de calibração foi obtida para o modo de condução. Finalmente, biomarcadores de gonadotrofina coriônica humana (HCG) foram quantificados como um modelo para verificar as capacidades de detecção de sensoriamento térmico.

Materiais e métodos

Materiais e Reagentes

A solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi adquirida na Lonza®. Hidrocloreto de N- (3-dimetilaminopropil) -N-etilcarbodiimida (EDC) e polietilenoglicol heterobifuncional (HS-PEG-COOH, MW =5000 g / mol (5 kDa)) foram adquiridos na SIGMA®. Tween 20, Triton X100, albumina de soro bovino (BSA), trealose, polivinil-pirrolidona (PVP), N -hidroxissulfosuccinimida (S-NHS), hidróxido de sódio, cloreto de sódio, hidrato de cloreto de ouro (III) e hormônio HCG foram adquiridos de Aladdin®. Sacarose, tetraborato de sódio deca-hidratado, ácido bórico, iodeto de potássio e tiossulfato de sódio penta-hidratado foram adquiridos de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. O boro-hidreto de sódio foi adquirido de Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd. Anti-αHCG, anti-βHCG e anti - anticorpos secundários de rato, membrana de nitrocelulose (NC-a110), almofada de amostra (fibra de vidro BX108), almofada de conjugação (fibra de vidro BX101) e superfícies de cloreto de polivinila (PVC) foram adquiridas de JieyYiBiotech ™. O ácido 4-morfolinometanossulfônico (MES) foi adquirido em Shanghai Majorbio. Etanol puro foi adquirido de Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd.

Síntese de nanopartículas (nanoprismas de ouro, AuNPrs)

As nanopartículas usadas neste estudo foram obtidas usando uma variação de nosso protocolo relatado anteriormente [25] que foi posteriormente aprimorado [26]. Resumidamente, um volume de 220 mL de 0,5 mM Na ₂ S ₂ O ₃ foi suplementado com 20 μL de KI 0,1 M. Em seguida, 110 mL da solução acima mencionada foram gradualmente adicionados a uma solução contendo HAuCl 2 mM ₄ ao longo de 30 s e incubado em temperatura ambiente por um tempo total de 4 min, momento em que a solução foi suplementada com 110 mL do Na ₂ remanescente S ₂ O ₃ Solução + KI ao longo de 30 se incubado por mais 4 min. Finalmente, 100 mL de Na ₂ S ₂ O ₃ sem KI foi adicionado à solução resultante e incubado por 60 min em temperatura ambiente obtendo as nanopartículas em forma de prisma finais. Todas as etapas de incubação descritas anteriormente foram realizadas sem agitação. Após a síntese, as nanopartículas foram estabilizadas com PEG (PEGylation). A quantidade de PEG adicionada às nanopartículas foi preparada na proporção de 1:2 (NPs para PEG) do peso total de ouro utilizado na síntese. O PEG foi diluído em 1 mL de água Milli-Q e um determinado volume de NaBH ₄ foi então adicionado para alcançar a proporção molar de 1:1 de PEG para NaBH ₄ . Todo o volume do PEG para NaBH ₄ solução foi completamente adicionado ao AuNPrs e ajustado para pH 12 com NaOH 2 M sob mistura suave. Finalmente, a solução foi sonicada por 60 min a 60 ° C e então centrifugada por 15 min a 4400 G em temperatura ambiente para separar os AuNPrs do excesso de PEG e materiais que não reagiram. Os peletes foram ressuspensos em água Milli-Q e centrifugados três vezes durante 9 min a 4400 G à temperatura ambiente. Estas amostras finais foram diluídas para um quarto do seu volume original para permitir a sua decantação à temperatura ambiente durante várias semanas. Após este tempo, a camada superior da solução (contendo uma fração principal de subprodutos de ouro nanométricos menores e mais leves) poderia ser removida dos AuNPrs que sedimentam no fundo. A concentração de nanopartículas foi obtida medindo sua absorbância (OD) a 400 nm por espectroscopia UV-Vis e aplicando um fator de conversão (ε) de 11,3 mL mg ⁻¹ cm ⁻¹ . Este valor foi obtido experimentalmente pela correlação da concentração de ouro obtida por ICP com a DO em 400 nm por UV-Vis dos produtos finais da síntese.

Conjugação de nanopartículas com anticorpo anti-HCG

Resumidamente, 3 mL de uma solução contendo 0,5 mg / mL de nanopartículas PEGuiladas foram lavados três vezes com tampão MES 0,1 M pH 5,5 por centrifugação durante 9 min a 6000 rpm em uma microcentrífuga mini-spin à temperatura ambiente. As nanopartículas lavadas finais foram ressuspensas em volume final de 1 mL do mesmo tampão (tampão MES 0,1 M, pH 5,5), e 4 mg de EDC e S-NHS foram adicionados à solução. As amostras foram então incubadas por 20 min sob mistura moderada, centrifugadas por 9 min a 6000 rpm min e lavadas com tampão MES. Em seguida, 20 μL de estoque de anticorpo (200 μg) foram adicionados à amostra e incubados 3 h a 37 ° C, seguido por uma segunda incubação durante a noite a 4 ° C (sem agitação). No dia seguinte, as nanopartículas conjugadas foram centrifugadas (9 min a 6000 rpm) e lavadas duas vezes com tampão borato 5 mM pH 9. Em seguida, 25 mg de BSA foram adicionados à solução. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente sob agitação moderada, a amostra foi lavada (9 min a 6000 rpm) com tampão borato suplementado com Tween 20 (5 mM pH 9) e finalmente armazenado a 4 ° C até uso posterior por não mais do que 4 -5 dias.

Após a preparação das nanopartículas, foi realizada a montagem das tiras teste (descrito no ESI).

Carregando nanopartículas na membrana das tiras

Para carregar as nanopartículas na membrana das tiras, a concentração do estoque original de nanopartículas PEGuiladas (sem anticorpo) foi adquirida e uma série de diluições foram realizadas em água Milli-Q, resultando em uma faixa de concentrações de 0 (água Milli-Q pura sem nanopartículas) até 10 DO / mL para a concentração máxima, que corresponde a 0,9 mg / mL de acordo com o fator de conversão previamente caracterizado pelo ICP-AES. Por uma questão de simplicidade e extrapolação, os valores de DO foram preferidos em relação à concentração em peso. Assim, 2 μL de cada uma das diluições acima mencionadas foram adicionados com uma micropipeta diretamente na membrana de nitrocelulose das tiras e deixados para secar em temperatura ambiente ao longo de ~ 2 h. As tiras secas foram armazenadas à temperatura ambiente antes dos testes de irradiação.

Para a detecção do antígeno HCG nas tiras, uma série de diluições do analito (HCG) foi realizada em PBS. Cada tira foi executada carregando 5 μL de AuNPr conjugado com anticorpo anti-HCG na almofada de conjugado e 50 μL da diluição necessária contendo HCG. As tiras foram secas de maneira semelhante ao teste anterior.

Desenvolvimento do dispositivo portátil

O dispositivo portátil (Fig. 1a e Arquivo Adicional 1:Figura S1) foi montado usando tecnologia de sistema embarcado e componentes de montagem em superfície, por serem pequenos e econômicos. A composição do protótipo é mostrada na Fig. 1b. A placa-mãe (arquivo adicional 1:Figura S1) é o módulo central do dispositivo, cuja função é processar os dados e controlar o restante dos componentes. Este módulo é composto principalmente pelo MCU STM32F407, que possui uma grande memória e operação de baixo consumo de energia. Um circuito de conversão de voltagem foi projetado na placa-mãe para fornecer o fornecimento de voltagem correto para cada módulo do dispositivo.

Detalhes do dispositivo portátil. a Dispositivo portátil baseado em sensor térmico plasmônico. b Diagrama de composição de hardware ① placa-mãe, ② laser e módulo de detecção e ③ interface de usuário. c Cartucho para tiras

Cinco interfaces foram aplicadas na placa-mãe para a conexão com outros módulos. O sensor de temperatura foi conectado à placa-mãe por meio de uma interface IIC para receber os sinais de temperatura transmitidos pelo sensor. Para medições precisas de temperatura, escolhemos sensores de temperatura com saída digital. O sensor para o modo de condução foi um sensor semicondutor (ADT7420, Analog Devices) com resolução de temperatura de 16 bits (0,0078 ° C) e baixo consumo de energia (700 μW). No modo radiação, utilizamos um termômetro infravermelho (MLX90614, Melexis) com resolução de temperatura de 17 bits e consumo de energia de 3,9 mW. A interface entre o módulo de controle do laser e a placa-mãe consistia em um circuito de controle de relé para garantir o gerenciamento preciso do diodo laser enquanto protegia a placa-mãe de altas correntes. O módulo de laser consistia em três componentes:(1) o componente de controle do laser (arquivo adicional 1:Figura S1), (2) um diodo de laser (Thorlabs, M9-A64-0200) que fornecia uma fonte de luz com um comprimento de onda de 1064 nm e uma saída de potência óptica máxima de 200 mW, e (3) uma lente asférica (Thorlabs, 354330-C) montada no módulo de laser para convergir a luz emitida pelo diodo laser em uma área de 1 mm × 2,5 mm. Esses componentes permitiram iluminar com precisão a linha de teste na tira. Uma tela de toque LCD (TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 pixels) foi utilizada para fornecer uma interface gráfica do usuário. A interface 4 da placa foi deixada para download e depuração do programa. Uma interface USB foi montada no dispositivo, que serviu como uma porta de carregamento para a bateria e uma porta de comunicação entre o dispositivo e um computador externo opcional. O protótipo era alimentado por uma bateria de lítio de 10.000 mAh. Os programas no MCU foram compilados pelo software IAR (versão 7.50.2.10505). A interface gráfica do usuário foi projetada usando o software USART HMI.

Projeto da caixa do protótipo e cartucho da tira de teste

A fim de garantir que o dispositivo seja amigável e portátil, uma concha impressa em 3D e um cartucho foram projetados, melhorando a capacidade anti-interferência e a estabilidade do dispositivo. Resina de cor branca foi usada como material tanto para a caixa quanto para o cartucho. O software Solidworks 2018 foi usado para o projeto.

Uma caixa cubóide (arquivo adicional 1:Figura S2a) e uma placa de fundo retangular (arquivo adicional 1:Figura S2b) foram projetadas para o dispositivo de acordo com a forma dos componentes internos. A caixa cubóide forneceu uma posição de montagem fixa para a tela LCD e o módulo de controle de diodo laser. Uma fenda retangular na lateral da caixa foi usada para inserir o cartucho de tiras de teste. A placa inferior foi fornecida com uma bateria e uma base de montagem da placa-mãe, o que permitiu que os componentes fossem fixados na placa inferior sem se moverem. Todas as peças de detecção foram fixadas na placa inferior. Uma estrutura de suporte para o sensor e o cartucho de fita foi instalada na placa inferior, colocando-os em contato próximo. Uma faixa móvel de ajuste fino foi fornecida para o diodo laser e a lente, permitindo a fixação e o ajuste da distância. O tamanho de todo o invólucro era 133 mm × 108 mm × 73 mm.

Um cartucho especial (Fig. 1c, 15 mm × 4 mm × 70 mm) foi projetado para a proteção das tiras de teste. O cartucho possuía três janelas, uma para o carregamento da amostra e mais duas para a visualização da linha teste e linha controle, respectivamente. A janela da linha de teste foi projetada um pouco menor que a largura da tira de teste para garantir que o laser não possa passar através da tira de teste e afetar a detecção do sensor. Um entalhe de apoio foi criado na parte de trás do cartucho, permitindo que o sensor condutor toque totalmente a parte de trás das tiras na posição da linha de teste, garantindo que o sensor de radiação possa detectar a temperatura corretamente.

Algoritmo para detecção térmica e cálculo de parâmetros

Como o laser iluminou as nanopartículas, o calor foi gerado na linha de teste, o que causou mudanças de temperatura detectáveis. Esta geração de calor ( Q , W / m ³ ) depende da concentração de nanopartículas ( C , OD / mL), a área de iluminação ( A , m ² ), e a intensidade do laser ( I , W / m ² ) [22], de acordo com a seguinte fórmula:
$$ Q =CIA $$ (1)
O sinal térmico (temperatura) foi coletado quando o laser iluminou as tiras. Como a área de iluminação e a intensidade do laser foram mantidas constantes, o sinal térmico muda com a quantidade de nanopartículas ligadas na linha de teste. Para quantificação da geração de calor, dois métodos foram comparados. O primeiro utilizou as mudanças de temperatura (Arquivo Adicional 1:Figura S3) para quantificar o sinal térmico. A variação de temperatura (∆ T ) foi calculado para a determinação:
$$ \ Delta T ={T} _ {\ mathrm {end}} - {T} _0 $$ (2)
onde T _fim é a temperatura final (máxima) alcançada no final da irradiação e T ₀ é a temperatura ambiente inicial registrada pelo sensor antes do início da irradiação. Outro método utilizou o cálculo quantitativo da área sob a curva (AUC, Arquivo Adicional 1:Figura S3). Este método divide a curva em trapézios de acordo com uma frequência de amostragem de 10 Hz seguida do cálculo da adição de todos os trapézios. O sinal térmico foi obtido dividindo a área pelo tempo de detecção ( t _det ):
$$ \ mathrm {AUC} =\ sum \ limits_ {i =1} ^ n \ left (\ Delta {T} _i + \ Delta {T} _ {i-1} \ right) \ vezes 0,1 \ div 2 $$ (3) $$ {T} _ {\ mathrm {auc}} =AUC \ div {t} _ {\ mathrm {det}} $$ (4)
Ao aplicar os dois métodos na detecção, a análise AUC deu uma melhor repetibilidade da quantificação (Arquivo adicional 1:Figura S4). Portanto, a análise AUC foi selecionada para seu uso na quantificação de calor final.

Para avaliar o desempenho dos diferentes métodos de detecção, avaliamos o LOD da quantificação. Em cada experimento, medimos uma concentração para quatro amostras (quatro tiras, n =4). Considerando o desvio padrão (σ ₀ ) do grupo em branco e da sensibilidade ( S ), que é a inclinação da curva padrão na faixa linear, avaliamos o LOD como abaixo:
$$ \ mathrm {LOD} =\ frac {3 {\ sigma} _0} {s} $$ (5)

Procedimento de ensaio

Todo o procedimento do ensaio compreendeu três etapas principais:(1) coleta de dados, (2) detecção e aquisição de resultados e (3) exibição e armazenamento dos resultados. Primeiro, a tira de teste foi carregada no cartucho e inserida no dispositivo. A medição foi realizada simplesmente tocando no botão de detecção e digitando as informações do paciente (opcionalmente, um código anônimo pode ser inserido). As informações foram transmitidas para a unidade microcontrolada (MCU) e armazenadas. Em seguida, o MCU ativou o sensor de temperatura e o diodo laser para iniciar o teste. Enquanto isso, os dados de temperatura recebidos pelo MCU foram enviados ao LCD para exibição em tempo real e plotagem. Após a detecção, o MCU calculou o valor AUC e representou o resultado na tela.

Resultados e discussão

Caracterização das Nanopartículas

Os espectros de UV-Vis de nanoprims conjugados são mostrados na Fig. 2a, indicando que o pico máximo está em 1130 nm. A absorbância do AuNPr no comprimento de onda do laser (1064 nm) é de 92% por cento da absorbância máxima em 1130 nm. Imagens SEM e TEM (Fig. 2b, c) foram coletadas para visualizar a morfologia das nanopartículas, confirmando a maioria das formas triangulares.

Caracterização dos nanoprims de ouro. a Espectros UV-Vis das nanopartículas. Imagens representativas das nanopartículas não conjugadas visualizadas por b SEM e c TEM

Otimização das condições de medição no dispositivo

No sensoriamento térmico, o tempo de detecção e a distância do diodo laser à linha de teste são os principais fatores que influenciam na resposta do sinal [27, 28]. Os dois fatores foram estudados para otimizar as condições de medição. Para a otimização do tempo de irradiação, irradiamos as tiras por 10 min e registramos as mudanças de temperatura por ambos os sensores respectivamente. Como pode ser visto na Fig. 3a, a temperatura continuou a subir em 10 min, mas o aumento na temperatura começou a atingir um patamar após 120 s. Este resultado está de acordo com pesquisas anteriores nas quais uma tendência semelhante foi observada nas mudanças do sinal térmico com o tempo [28]. Considerando os requisitos de POCT e consumo de energia, o tempo de detecção do dispositivo foi ajustado para 120 s.

Otimização de sensoriamento térmico. a Mudanças de temperatura em irradiação de 10 min. b Sinal térmico em diferentes distâncias de irradiação

A otimização da distância foi então realizada. A Figura 3b mostrou que o sinal térmico diminuiu com o aumento da distância entre o diodo laser e a linha de teste. A razão pode ser que a potência do laser atingindo a linha de teste foi atenuada conforme a distância aumenta a área irradiada efetiva. Para obter a resposta máxima do sinal, a distância foi ajustada em 7 mm.

O efeito da temperatura ambiente na detecção térmica

Como o sensoriamento térmico está intimamente relacionado à temperatura, foi necessário pesquisar como a temperatura ambiente influencia o sensoriamento térmico. A temperatura ambiente variou de 27,5 a 40 ° C usando uma incubadora. Um total de 4 amostras foram medidas em cada ponto de temperatura com um intervalo de 2,5 ° C. As curvas de temperatura ambiente versus sinal térmico foram medidas para o branco e tiras de 1 DO / mL, respectivamente, por ambos os métodos de sensoriamento térmico. Os parâmetros da curva de ajuste da temperatura ambiente são mostrados na Tabela 1. A Figura 4a mostra que no modo de condução, as inclinações da curva foram geralmente consistentes para diferentes concentrações, indicando que as mudanças na temperatura ambiente tiveram o mesmo efeito em diferentes concentrações. Como resultado, a curva de efeito do ambiente pode ser usada para calibrar resultados quantitativos. No modo radiação, as inclinações das curvas (Fig. 4b) correspondentes às duas concentrações eram consistentes entre si, mas ambas as curvas apresentavam tendência de queda. Os resultados sugerem que o modo de condução é mais confiável ao medir amostras em condições com uma variabilidade de alta temperatura.

Efeito da temperatura ambiente. a O sinal térmico muda com a temperatura ambiente no modo de condução. b O sinal térmico muda com a temperatura ambiente no modo de radiação

Quantificação das Nanopartículas

Detecção de detecção térmica

Para obter as curvas de quantificação padrão, os dois métodos de sensoriamento térmico (arquivo adicional 1:Figura S5) foram usados ​​respectivamente para detectar tiras de teste contendo nanopartículas na faixa de 0 a 10 DO / mL. Essas tiras (arquivo adicional 1:Figura S6a) contendo diferentes concentrações de nanopartículas foram detectadas pelo dispositivo portátil mencionado (ver a seção “Materiais e Métodos”). A configuração de ambos os sensores no dispositivo é apresentada no Arquivo Adicional 1:Figura S5a e S5b. Quatro amostras foram testadas para cada concentração a uma temperatura ambiente de 27,5 ° C. O dispositivo aplicou o método AUC para calcular o sinal térmico na linha de teste. Portanto, a quantificação do sinal térmico foi proporcional à quantidade de nanopartículas na linha de teste. As curvas de quantificação (Fig. 5a) foram geradas por regressão linear dos dados obtidos do sinal térmico contra a concentração das nanopartículas e são representadas pelas fórmulas da Tabela 2.

Quantificação de nanopartículas. a Curvas de quantificação padrão em três métodos. b Resultados quantitativos em baixa concentração com curvas lineares

A Tabela 2 mostra que a sensibilidade do modo de radiação foi 15 vezes maior que a do modo de condução. O LOD dos modos de condução e radiação foram 0,053 OD / mL e 0,023 OD / mL, respectivamente. No sensoriamento térmico, o modo de radiação melhorou o limite de detecção (LOD) em 2 vezes em comparação com o modo de condução. A estabilidade das tiras de LFA também foi testada conforme descrito no arquivo adicional 1:Figura S7. O modo de detecção térmica condutiva requer a transferência de calor entre dois sólidos. Quando a temperatura da linha de teste aumenta rapidamente, leva algum tempo (tempo de relaxamento) para o sensor atingir a mesma temperatura da linha de teste. Como resultado, a temperatura do sensor foi inferior à temperatura real na linha de teste no final da detecção. Por outro lado, o modo de radiação não exigia transferência de calor para o sensor, pois o sensor detectava diretamente a onda de infravermelho irradiada pela linha de teste para obter sua temperatura atual. No modo de detecção por condução, parte do calor foi dissipado devido à presença de bons condutores térmicos que funcionavam como dissipador de calor, enquanto na detecção da radiação apenas o ar e a própria faixa intervinham na dissipação do calor. Esses motivos podem explicar que a sensibilidade do método de condução é menor que a do método de radiação.

Ao testar tiras com uma concentração de 10 DO / mL, descobrimos que havia uma marca de queimação usando o modo de detecção de radiação (sem contato). One possible reason for this phenomenon is that in the non-contact measurement, the low thermal conductivity of the air allows the heat to be retained in the test line and dissipate less efficiently, increasing the effective local temperature and eventually causing the combustion of the membrane.

In the contact mode of detection, however, the sensor with a large thermal conductivity acted as medium and heatsink. In this way, heat was conducted to the sensor so that no combustion occurred in the test line.

Comparison Between Thermal Sensing and Visual Detection

Due to its popularity for portable devices and wide use, we compared the thermal sensing with visual detection for its detection ability. For visual detection, the pictures of the strip were taken by a conventional microscope digital camera. The test strips were mounted in the cartridge to ensure the positional consistency of the image analysis in a similar fashion than with the thermal sensing. Software Image J was used to analyze the grey value in the test line for different concentrations of nanoparticles. A standard curve (Fig. 5a) of the visual detection method was plotted based on the results of this analysis. The linear range between the grey value and the concentration of nanoparticles was 0.2–10 OD/mL (R ² was 0.770 for the range of 0–0.2 OD/mL, so they were thus discarded from further analysis). The detection limit was 0.268 OD/mL. The results indicated that thermal sensing could reduce LOD by 5- to 12-fold compared to visual detection. In Qin’s research, they found that the LOD for visual analysis was 100-fold higher than thermal contrast [21]. Since they employed a high laser power and an infrared camera, they gained greater difference in LOD. One reasonable explanation for the LOD improvement is that thermal sensing is able to measure the nanoparticles on top and beneath the membrane surface. Another advantage of thermal sensing is that it has a higher stability than visual detection. Thermal sensing generates heat by the nanoparticles on the entire test line. Visual detection relies only on the color reaction of the nanoparticles on the surface of the test line. Even if the analyte concentrations of two test strips are the same, the distribution of the nanoparticles on the T-line in the tangent plane is different; thus, the visual inspection will result in a difference in the detection results while the thermal sensing is more stable and reproducible. On the contrary, the sensitivity of the visual detection was 2-fold higher than thermal sensing. Visual detection is a direct method for quantifying nanoparticles, while thermal sensing is an indirect measurement of the concentration of the nanoparticles by measuring the temperature changes, which may partially explain the lack of sensitivity. Figure 5b demonstrates that the linear range of detection for thermal sensing can be as low as 0 OD/mL, with the R ² of 0.972 (conduction) and 0.987 (radiation), suggesting that thermal sensing has a better potential for its applications in early detection in POCT than color quantification, since the target analytes are in lower concentrations.

Quantitative Detection of HCG

Finally, the biomarker HCG was quantified using our system in order to validate the thermal sensing. Both conduction and radiation modes were applied to quantify the HCG. The optical power was turned down to 150 mW, preventing the strips from burning. Strips (Additional file 1:Figure S6b) with four different concentrations were tested. Figure 6a and b show that the thermal signals were linear to the concentration of HCG from 35 to 700 mUI/mL. When the concentration was extended to the range of 35–7000 mUI/mL, the linearity was between the logarithm of the concentration and the thermal signal as in Fig. 6c, d. In conduction mode, the LOD was 64.2 mIU/mL which is in a similar range than the visual detection. However, the ideal LOD of the radiation mode was 2.8 mIU/mL. The data matched with the quantification of nanoparticles. Compared with other devices that applied photothermal effect (LOD =5.5 mIU/mL) [27], our device in radiation mode reduced the LOD by nearly 2-fold. Those results proved that thermal sensing is an effective way in LFA detection and quantification.

The standard curves of HCG. a A linear curve between the logarithm of the HCG concentration and the thermal signal in radiation mode. b A linear curve between the logarithm of the HCG concentration and the thermal signal conduction mode. c The quantification results of HCG in radiation mode. d The quantification results of HCG in conduction mode

Conclusões

A plasmonic thermal sensing method for LFA detection was established. A portable device based on this method was developed by applying different temperature sensors (conduction and radiation modes). The study of the influence of the ambient temperature demonstrated that it has a negative impact on the thermal sensing and conduction mode was less affected than radiation mode. In radiation mode, the impact was more significant at high concentrations. Both modes were also tested to compare the quantification ability. When compared with the traditional visual detection, the thermal sensing methods showed a 5- to 12-fold improvement in LOD for nanoparticle quantification. The radiation mode showed a better performance than conduction mode in both sensitivity and LOD. In the validation of thermal sensing, LFA strips for the detection of HCG were tested and the results demonstrated that the radiation mode was much more sensitive than the conduction mode. In this way, we proved that thermal sensing is a feasible and effective way for early detection in LFA platforms.

In conclusion, plasmonic thermal sensing can truly improve the analytical sensitivity and shows a promising future in LFA detection for early diagnostic applications. The portable device described herein provided two sensing approaches to satisfy different requirements.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados usados ​​e / ou analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis junto ao autor correspondente, mediante solicitação razoável.

Abreviações

AUC:

Area under the curve

AuNPrs:

Gold nanoprisms

BSA:

Albumina sérica bovina

CCD:

Dispositivo de carga acoplada

CMOS:

Complementary metal oxide semiconductor

HCG:

Human chorionic gonadotropin

LFA:

Lateral flow assay

LOD:

Limite de detecção

LSPR:

Ressonância de plasmon de superfície localizada

MCU:

Microcontroller unit

MES:

4-Morpholineethanesulfonic acid

NIR:

Próximo ao infravermelho

PBS:

Salina tamponada com fosfato

POCT:

Teste de ponto de atendimento

PVC:

Cloreto de polivinila

PVP:

Poly-vinyl-pyrrolidone

S-NHS:

N -Hidroxissulfosuccinimida

Efeito do aquecimento Joule na característica de chaveamento resistivo em células AlOx feitas por formação de oxidação térmica Matriz de nano-pontos padronizáveis ​​e de área grande da eletrólise do filme ITO para espectroscopia Raman aprimorada de superfície