ELISA Plasmonico Habilitado por Smartphone para Detecção Ultra-Sensível de Mioglobina no Ponto de Atendimento

Resumo

Mioglobina sérica sobe dentro de 1-2 h após infarto agudo do miocárdio (IAM), tornando-a biomarcador crítico precoce. Apresentamos imunoensaio plasmonico que explora mudanças de ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) mediadas por enzima de nanobastões de ouro (AuNRs) para quantificar mioglobina com faixa linear 0,1-1000 ng mL⁻¹ e limite de detecção (LOD) 0,057 ng mL⁻¹. Leitor inovador, construído a partir do sensor de luz ambiente (ALS) de smartphone e acessório impresso em 3D, traduz deslocamentos LSPR em leitura simples, baixo custo (~$2) adequado para ambientes com recursos limitados. Concentrações de mioglobina medidas por este método correlacionaram fortemente com resultados ELISA convencionais, sublinhando sua relevância clínica para triagem rápida de IAM.

Introdução

IAM permanece causa líder de mortalidade mundial, com 1,5 milhões casos EUA e 500.000 casos China anualmente. Detecção precoce depende de biomarcadores que sobem rapidamente; mioglobina sérica pico 6-9 h pós-infarto e detectável já a 1-2 h. ELISA convencional, embora confiável, requer infraestrutura laboratorial e pessoal qualificado, limitando utilidade em cenários ponto-de-atendimento (POC).

Imunoensaios plasmonicos combinam especificidade ELISA com amplificação óptica de nanoestruturas metálicas, permitindo leitura a olho nu e alta sensibilidade. Nanobastões de ouro, com seu LSPR ajustável, são particularmente atraentes para transdução de sinal em biossensores. Contudo, interpretação quantitativa tradicionalmente demanda espectrômetros ou leitores de microplaca, restringindo implantação em campo. Aqui, desenvolvemos ELISA plasmonico baseado em AuNRs para mioglobina, pareado com leitor acionado por smartphone que aproveita ALS do telefone para capturar intensidade de luz transmitida, oferecendo ferramenta diagnóstica portátil, barata.

Materiais e Métodos

Materiais

Mioglobina humana (Abcam, UK), anticorpos monoclonais anti-mioglobina (mAb1, mAb2, produção interna), nanobastões de ouro (AuNRs), glicose oxidase (GOx), peroxidase raiz-forte (HRP), e outros reagentes de fornecedores padrão. Amostras de soro coletadas do Hospital Chinês Ultramarino Guangzhou.

Aparelhagem

Espectros LSPR registrados com leitor microplaca Synergy H1; absorbância ELISA medida a 450 nm em leitor MK3. AuNRs caracterizados por MET PHILIPS TECNAI-10. Leitor smartphone montado em chassi impresso 3D (parte 1: 100×40×40 mm, parte 2: 76×13×12 mm) alimentado por duas baterias 1,5 V. LED 850 nm alinhado com ALS permitiu medição luz transmitida via app Light Meter (Android; compatível iOS).

Síntese de AuNRs

Crescimento mediado por semente produziu AuNRs com razão de aspecto ajustada por concentrações AgNO₃ e CTAB. Bastões finais incubados 12 h sob agitação antes do uso.

Protocolo Imunoensaio Plasmonico

Placas 96-poços revestidas overnight com mAb1, bloqueadas com BSA, armazenadas a -20 °C. mAb2 marcado com GOx (GOx-Ab2) adicionado a poços contendo concentrações variadas de mioglobina, seguido por glicose e AuNRs na presença de HRP e CTAB. Corrosão de AuNRs por H₂O₂ gerou deslocamento azul no pico LSPR e absorbância reduzida a 850 nm, proporcional à quantidade de mioglobina. Intensidade luz transmitida registrada por leitor smartphone, gerando curva calibração. Amostras de soro diluídas dez vezes e processadas identicamente.

Análise de Dados

Regressão linear realizada usando Origin 9.0; todos ensaios triplicados para assegurar reprodutibilidade.

Resultados e Discussão

Princípio do Ensaio

GOx em mAb2 converte glicose em ácido glicônico e H₂O₂. H₂O₂, na presença de HRP e Br⁻, corrói AuNRs, deslocando pico LSPR para comprimentos de onda menores e baixando absorbância 850 nm. Extensão de deslocamento ou perda intensidade reflete diretamente concentração de mioglobina.

Otimização

HRP ótimo (1,5 µM) e CTAB (6,25 µM) maximizaram deslocamento LSPR. Tempo corrosão 30 min com 100 µM H₂O₂ produziu sinais estáveis. Níveis H₂O₂ maiores induziram deslocamento azul pronunciado e mudança morfológica de bastões retangulares a elípticos, confirmando mecanismo corrosão.

Desempenho Leitor Smartphone

Leitor baseado em ALS mediu intensidade luz transmitida a 850 nm com <1% variância relativo a leitor microplaca comercial, atingindo 99,1% correlação (R²=0,991). Acessório inteiro custa aproximadamente $2.

Sensibilidade Analítica

Usando deslocamento LSPR, ensaio quantificou mioglobina 0,1-1000 ng mL⁻¹ com LOD 57,8 pg mL⁻¹. Quando lido por smartphone, faixa linear idêntica, com LOD 64,1 pg mL⁻¹. Medidas soro clínico mostraram forte concordância com ELISA (R²=0,98), validando potencial diagnóstico do método.

Comparação com ELISA

ELISA tradicional rendeu faixa linear 25-1000 ng mL⁻¹ e LOD 22,7 ng mL⁻¹. Ensaio plasmonico portanto oferece ~400× menor LOD e faixa dinâmica mais ampla, tornando-o superior para detecção precoce IAM.

Conclusões

Demonstramos ELISA plasmonico de nanobastões de ouro que detecta mioglobina sérica com sensibilidade sem precedentes (LOD=0,057 ng mL⁻¹) e leitor smartphone direto. Plataforma contorna instrumentação complexa, oferecendo solução viável, baixo custo para diagnóstico POC de IAM em ambientes com recursos limitados.