Dispositivo Térmico Plasmonico Portátil para Quantificação Precisa de Ensaios de Fluxo Lateral

Resumo

Teste em ponto de cuidado (POCT) é amplamente usado para diagnóstico precoce e monitoramento de doenças. Ensaio de fluxo lateral (EFL) é ferramenta comercial de sucesso para POCT. Contudo, EFL frequentemente sofre de falta de quantificação e sensibilidade analítica. Para resolver essas desvantagens, desenvolvemos anteriormente um EFL térmico usando nanopartículas de ouro plasmonicas para contraste térmico em dispositivo portátil. Embora essa metodologia melhore significativamente sensibilidade analítica comparada à detecção visual convencional, problemas de quantificação permanecem. Neste estudo, otimizamos condições de operação do dispositivo usando modos de sensoriamento térmico por condução e radiação permitindo quantificação de EFL. Limite de detecção de tiras contendo apenas nanopartículas diminuiu 5 vezes (modo condução) e 12 vezes (modo radiação) comparado à detecção visual tradicional. Efeito da temperatura ambiente foi estudado para ambos métodos mostrando que modo radiação foi mais afetado pela temperatura ambiente que modo condução. Para validar método de sensoriamento térmico, biomarcador gonadotrofina coriônica humana (HCG) foi quantificado usando nossas tiras EFL, obtendo limite de detecção de 2,8 mIU/mL usando método de detecção por radiação.

Introdução

Detecção precoce e diagnóstico rápido são importantes para triagem e tratamento de doenças. A maioria dos testes médicos é demorada e requer preparação complicada de amostras clínicas, grandes instrumentos e profissionais de laboratório bem treinados. Esses requisitos dificultaram muito tratamento médico em áreas com recursos limitados. Teste em ponto de cuidado (POCT) utiliza equipamento simples e minimiza tempo para obter resultados clinicamente relevantes, permitindo clínicos e pacientes tomarem decisões rapidamente. POCT tem vantagens óbvias, como tempo curto de detecção, processamento rápido de amostras, instrumentação simples e baixos requisitos de operação. Assim, surgimento do POCT pode ajudar diagnóstico precoce e rápido de doenças, particularmente em áreas com recursos limitados, melhorando condições médicas. Contudo, baixa sensibilidade analítica, procedimentos operacionais complicados e altos custos de equipamento geralmente impedem aplicação dessa técnica. Portanto, trabalho adicional é urgentemente necessário para encontrar aplicações POCT com a maioria das características ideais, minimizando desvantagens.

Para resolver alguns desses problemas, ensaio de fluxo lateral (EFL) é excelente candidato como ferramenta de teste em POCT. EFL é biossensor de tira baseado em papel usado para identificar analitos alvo em uma dada amostra. EFL é realizado em tira baseada em papel, compreendida por almofada de amostra, almofada de conjugado, almofada de absorção e membrana de nitrocelulose onde detecção ocorre. Entre vantagens do EFL, vale mencionar sua rapidez e ensaio de etapa única, custo-efetividade, operação fácil, pequeno volume de amostra e longa vida de prateleira sob diferentes condições ambientais. EFL convencional fornece resultados "sim ou não" por inspeção de mudanças de cor na linha de teste a olho nu, método de detecção mais popular para esses ensaios. Assim, esse tipo de abordagem tende a sofrer de falta de precisão e julgamento subjetivo. Não obstante, como é fácil integrar EFL com dispositivos eletrônicos, abordagem de detecção viável é desenvolver leitores de tira para obter resultados quantitativos precisos. Dispositivos de carga acoplada (CCD) ou sensores de semicondutor complementar de óxido metálico (CMOS) são geralmente aplicados para capturar imagens em leitores de tira. Software de processamento de imagem é frequentemente adotado para alcançar resultados quantitativos. Nesses leitores ópticos, informação óptica obtida de reflexão, transmissão ou espalhamento de luz de fonte externa é registrada para permitir quantificação. Em leitores colorimétricos, intensidade de cor, como valor de cinza ou coordenadas RGB, é coletada das linhas de teste e controle para analisar tiras EFL. Uma desvantagem dessa abordagem é que corante pode perder cor ao longo do tempo por fotodano, meios mecânicos ou outros processos de degradação, resultando em baixa repetibilidade e precisão. Naqueles sistemas que recorrem a leitores de fluorescência, fluoróforos orgânicos são expostos a comprimento de onda de excitação específico que induz emissão do fluoróforo presente nas tiras em comprimento de onda maior. Essa luz emitida é então coletada para detecção quantitativa. Problema que não pode ser ignorado é que fluoróforos orgânicos usualmente usados nessas aplicações sofrem de fotobranqueamento e degradação química, causando atenuação do sinal ao longo do tempo, requerendo manuseio e armazenamento especiais.

Recentemente, sensoriamento térmico é gradualmente aplicado a detecção EFL. Sensoriamento térmico consiste no uso de transdutor de calor no qual calor gerado aumenta na presença do analito, permitindo detectar esse sinal térmico pelo transdutor. Polo et al. exploraram conceito de sensoriamento impulsionado por aquecimento plasmonico pela detecção de biomarcador de câncer antígeno carcinoembrionário (CEA) usando fonte de luz infravermelho próximo (IVP) para induzir geração de calor usando propriedades plasmonicas de nanopartículas de ouro anisotrópicas. Qin et al. propuseram método usando contraste térmico para quantificar EFL usando laser verde como fonte de luz, mostrando melhora de 32 vezes em sensibilidade analítica. Em 2016, leitor de contraste térmico similar foi desenvolvido por Wang que aumentou 8 vezes sensibilidade analítica em quantificação EFL. Fonte de luz usada para induzir geração de calor pelo transdutor pode ser sintonizada para comprimentos de onda específicos para prevenir ser afetada por presença de outras moléculas que não absorvem nesses comprimentos, garantindo especificidade de detecção. Uso de fontes de luz na região IVP do espectro eletromagnético permite prevenir absorção de luz pela maioria das moléculas de origem biológica, particularmente sangue. Essas vantagens mostram que sensoriamento térmico plasmonico com fonte de luz IVP é método promissor de detecção EFL. Contudo, em pesquisas anteriores, nenhum dispositivo POCT foi desenvolvido empregando tiras EFL junto com fonte de luz IVP.

Aqui, desenvolvemos dispositivo portátil baseado em sensoriamento térmico plasmonico que melhora sensibilidade analítica em EFL sem modificação extra das tiras. Sinal foi amplificado colocando ressonância plasmonica em pleno jogo sob irradiação de laser IVP. Comprimento de onda do laser no protótipo está dentro do pico de ressonância de plasmon de superfície localizada (LSPR) das nanopartículas (que atuam como transdutores luz-calor em nossa configuração), gerando calor na linha de teste. Então, geração de calor é detectada por sensor térmico localizado no dispositivo que mede calor gerado por emissão infravermelha (radiação) ou por condução de calor. Quantidade de calor gerado é proporcional ao número de nanopartículas na linha de teste e potência de irradiação. Nenhuma operação adicional é necessária.

Transferência térmica tem três formas principais: condução, convecção e radiação. Para estudar desempenho de detecção de diferentes formas de transferência térmica, testamos modo condução (contato) e modo radiação (não-contato) por dois tipos de sensores. Protótipo completo é compacto e usa tecnologia de sistema embarcado e componentes de montagem superficial. Principais fatores que influenciam capacidade de detecção foram investigados para otimizar condições de operação. Para verificar capacidade de detecção do dispositivo portátil, tiras EFL diretamente carregadas com nanopartículas na membrana foram quantificadas e comparadas com detecção visual convencional. Como nosso método de detecção é dependente de temperatura, efeito da temperatura ambiente na detecção de sinal térmico também foi estudado e curva de calibração obtida para modo condução. Finalmente, biomarcadores gonadotrofina coriônica humana (HCG) foram quantificados como modelo para verificar capacidades de detecção do sensoriamento térmico.

Materiais e Métodos

Materiais e Reagentes

Tampão fosfato salino (PBS) foi comprado da Lonza®. N-(3-Dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida cloreto (EDC) e polietilenoglicol heterobifuncional (HS-PEG-COOH, PM = 5000 g/mol (5 kDa)) foram comprados da SIGMA®. Tween 20, Triton X100, albumina sérica bovina (BSA), trealose, polivinilpirrolidona (PVP), N-hidroxisulfossuccinimida (S-NHS), hidróxido de sódio, cloreto de sódio, cloreto de ouro(III) hidratado e hormônio HCG foram comprados da Aladdin®. Sacarose, tetraborato de sódio decaidratado, ácido bórico, iodeto de potássio e tiossulfato de sódio pentaidratado foram comprados da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Boridreto de sódio foi comprado da Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd. Anticorpos anti-αHCG, anti-βHCG e anti-camundongo secundários, membrana de nitrocelulose (NC-a110), almofada de amostra (fibra de vidro BX108), almofada de conjugação (fibra de vidro BX101) e superfícies de policloreto de vinila (PVC) foram comprados da JieyYiBiotech™. Ácido 4-morfolinaetansulfônico (MES) foi comprado da Shanghai Majorbio. Etanol puro foi comprado da Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd.

Síntese de Nanopartículas (Nanoprismas de Ouro, AuNPrs)

Nanopartículas usadas neste estudo foram obtidas usando variação de nosso protocolo previamente reportado que foi posteriormente melhorado. Brevemente, volume de 220 mL de 0,5 mM Na₂S₂O₃ foi suplementado com 20 μL de 0,1 M KI. Então, 110 mL da solução supracitada foi gradualmente adicionada a solução contendo 2 mM HAuCl₄ ao longo de 30 s e incubada à temperatura ambiente por tempo total de 4 min, momento em que solução foi suplementada com 110 mL da solução restante Na₂S₂O₃+KI ao longo de 30 s e incubada por mais 4 min. Finalmente, 100 mL de Na₂S₂O₃ sem KI foi adicionado à solução resultante e incubado por 60 min à temperatura ambiente obtendo nanopartículas finais em forma de prisma. Todas as etapas de incubação descritas anteriormente foram realizadas sem agitação. Após síntese, nanopartículas foram estabilizadas com PEG (PEGilação). Quantidade de PEG adicionada às nanopartículas foi preparada na razão 1:2 (NPs para PEG) do peso total de ouro usado na síntese. PEG foi diluído em 1 mL água Milli-Q, e volume determinado de NaBH₄ foi então adicionado para atingir razão molar 1:1 de PEG para NaBH₄. Volume total da solução PEG para NaBH₄ foi completamente adicionado aos AuNPrs e ajustado a pH 12 com 2 M NaOH sob mistura suave. Finalmente, solução foi sonicada por 60 min a 60 °C e então centrifugada por 15 min a 4400 G à temperatura ambiente para separar AuNPrs de PEG em excesso e materiais não reagidos. Pellets foram ressuspensos em água Milli-Q e centrifugados três vezes por 9 min a 4400 G à temperatura ambiente. Amostras finais foram diluídas a um quarto de seu volume original para permitir decantação à temperatura ambiente por várias semanas. Após esse tempo, camada superior da solução (contendo fração maior de subprodutos nanométricos de ouro menores e mais leves) pôde ser removida dos AuNPrs que sedimentam no fundo. Concentração de nanopartículas foi obtida medindo absorbância (OD) a 400 nm por espectroscopia UV-Vis e aplicando fator de conversão (ε) de 11,3 mL mg⁻¹ cm⁻¹. Este valor foi obtido experimentalmente correlacionando concentração de ouro obtida por ICP com OD a 400 nm por UV-Vis dos produtos finais da síntese.

Conjugação de Nanopartículas com Anticorpo Anti-HCG

Brevemente, 3 mL de solução contendo 0,5 mg/mL de nanopartículas PEGiladas foi lavada três vezes com tampão MES 0,1 M pH 5,5 por centrifugação por 9 min a 6000 rpm em microfuga mini-spin à temperatura ambiente. Nanopartículas lavadas finais foram ressuspensas em 1 mL volume final do mesmo tampão (0,1 M MES pH 5,5), e 4 mg de EDC e S-NHS foram adicionados à solução. Amostras foram então incubadas por 20 min sob mistura suave, centrifugadas por 9 min a 6000 rpm, e lavadas com tampão MES. Então, 20 μL de estoque de anticorpo (200 μg) foi adicionado à amostra e incubado 3 h a 37 °C seguido por segunda incubação durante noite a 4 °C (sem agitação). No dia seguinte, nanopartículas conjugadas foram centrifugadas (9 min a 6000 rpm) e lavadas duas vezes com tampão borato 5 mM pH 9. Então, 25 mg de BSA foi adicionado à solução. Após 1 h incubação à temperatura ambiente sob agitação suave, amostra foi lavada (9 min a 6000 rpm) com tampão borato suplementado com Tween 20 (5 mM pH 9) e finalmente armazenada a 4 °C até uso posterior por no máximo 4–5 dias.

Após preparação das nanopartículas, montagem das tiras de teste foi realizada (descrita no ESI).

Carregamento de Nanopartículas na Membrana das Tiras

Para carregar nanopartículas na membrana das tiras, concentração do estoque original de nanopartículas PEGiladas (sem anticorpo) foi adquirida e série de diluições realizada em água Milli-Q, resultando em faixa de concentrações de 0 (água Milli-Q pura sem nanopartículas) até 10 OD/mL para concentração máxima, correspondendo a 0,9 mg/mL segundo fator de conversão previamente caracterizado por ICP-AES. Por simplicidade e extrapolação, valores OD foram preferidos sobre concentração de peso. Assim, 2 μL de cada uma das diluições supracitadas foi adicionado com micropipeta diretamente na membrana de nitrocelulose das tiras e deixado secar à temperatura ambiente por ~ 2 h. Tiras secas foram armazenadas à temperatura ambiente antes dos testes de irradiação.

Para detecção de antígeno HCG nas tiras, série de diluições do analito (HCG) foi realizada em PBS. Cada tira foi corrida carregando 5 μL de AuNPr conjugado com anticorpo anti-HCG na almofada de conjugado, e 50 μL da diluição requerida contendo HCG. Tiras foram secas de forma similar ao teste anterior.

Desenvolvimento do Dispositivo Portátil

Dispositivo portátil (Fig. 1a e Arquivo adicional 1: Figura S1) foi montado usando tecnologia de sistema embarcado e componentes de montagem superficial, pois são de pequeno tamanho e custo-efetivos. Composição do protótipo mostrada na Fig. 1b. Placa-mãe (Arquivo adicional 1: Figura S1) é módulo central do dispositivo, função de processar dados e controlar resto dos componentes. Este módulo é principalmente composto pelo MCU STM32F407, que possui grande memória e operação de baixa potência. Circuito de conversão de tensão foi projetado na placa-mãe para fornecer alimentação de tensão correta para cada módulo no dispositivo.

Cinco interfaces foram aplicadas na placa-mãe para conexão com outros módulos. Sensor de temperatura foi conectado à placa-mãe através de interface IIC para receber sinais de temperatura transmitidos pelo sensor. Para medição de temperatura precisa, escolhemos sensores de temperatura com saída digital. Sensor para modo condução foi sensor semicondutor (ADT7420, Analog Devices) com resolução de temperatura de 16 bits (0,0078 °C) e baixo consumo de potência (700 μW). Em modo radiação, utilizamos termômetro infravermelho (MLX90614, Melexis) com resolução de temperatura de 17 bits e consumo de potência de 3,9 mW. Interface entre módulo de controle de laser e placa-mãe consistiu em circuito de controle de relé para garantir gerenciamento preciso do diodo laser enquanto protege placa-mãe de alta corrente. Módulo de laser consistiu em três componentes: (1) componente de controle de laser (Arquivo adicional 1: Figura S1), (2) diodo laser (Thorlabs, M9-A64-0200) fornecendo fonte de luz com comprimento de onda de 1064 nm e potência óptica máxima de saída de 200 mW, e (3) lente asférica (Thorlabs, 354330-C) montada no módulo de laser para convergir luz emitida pelo diodo laser em área de 1 mm × 2,5 mm. Esses componentes permitiram iluminar precisamente linha de teste na tira. Tela LCD touch screen (TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 pixel) foi utilizada para fornecer interface gráfica de usuário. Interface 4 da placa foi deixada para download e debug de programa. Interface USB foi montada no dispositivo, servindo como porta de carregamento para bateria e porta de comunicação entre dispositivo e computador externo opcional. Protótipo foi alimentado por bateria de lítio de 10.000 mAh. Programas no MCU foram compilados por software IAR (versão 7.50.2.10505). Interface gráfica de usuário foi projetada usando software USART HMI.

Projeto do Gabinete do Protótipo e Cartucho de Tira de Teste

Para garantir que dispositivo seja amigável ao usuário e portátil, gabinete impresso em 3D e cartucho foram projetados, melhorando capacidade anti-interferência e estabilidade do dispositivo. Resina de cor branca foi usada como material para ambos gabinete e cartucho. Software Solidworks 2018 foi usado para projeto.

Gabinete paralelepípedo (Arquivo adicional 1: Figura S2a) e placa base retangular (Arquivo adicional 1: Figura S2b) foram projetados para dispositivo de acordo com forma dos componentes internos. Gabinete paralelepípedo forneceu posição de montagem fixa para tela LCD e módulo de controle de diodo laser. Fenda retangular no lado do gabinete foi usada para inserir cartucho de tira de teste. Placa base foi provida de base de montagem de bateria e placa-mãe, permitindo componentes serem fixados à placa base sem mover. Todas as partes de detecção foram fixadas na placa base. Estrutura de suporte para tanto sensor quanto cartucho de tira foi assentada na placa base, trazendo-os em contato próximo. Trilho de ajuste fino foi provido para diodo laser e lente permitindo fixar e ajustar distância. Tamanho do gabinete completo foi 133 mm × 108 mm × 73 mm.

Cartucho especial (Fig. 1c, 15 mm × 4 mm × 70 mm) foi projetado para proteção de tiras de teste. Cartucho tinha três janelas, uma para carregamento de amostra e duas mais para visualização de linha de teste e linha de controle, respectivamente. Janela da linha de teste foi projetada ligeiramente menor que largura da tira de teste para garantir que laser não consiga passar através da tira de teste e afetar detecção do sensor. Entalhe de apoio foi esculpido na parte traseira do cartucho permitindo sensor condutivo tocar totalmente parte de trás das tiras na posição da linha de teste enquanto garante que sensor de radiação possa detectar temperatura propriamente.

Algoritmo para Sensoriamento Térmico e Cálculo de Parâmetros

Como laser iluminou nanopartículas, calor foi gerado na linha de teste causando mudanças detectáveis de temperatura. Essa geração de calor (Q, W/m³) depende da concentração de nanopartículas (C, OD/mL), área de iluminação (A, m²) e intensidade do laser (I, W/m²), segundo fórmula: Q = CIA. Sinal térmico (temperatura) foi coletado quando laser iluminou tiras. Como área de iluminação e intensidade do laser foram mantidas constantes, sinal térmico muda com quantidade de nanopartículas ligadas na linha de teste. Para quantificação da geração de calor, dois métodos foram comparados. Primeiro usou mudanças de temperatura para quantificar sinal térmico. Variação de temperatura (ΔT) foi calculada para determinação: ΔT = T_end − T₀, onde T_end é temperatura final (máxima) atingida no final da irradiação e T₀ é temperatura ambiente inicial registrada pelo sensor antes do início da irradiação. Outro método usou cálculo quantitativo da área sob curva (AUC). Este método divide curva em trapézios segundo frequência de amostragem de 10 Hz seguido pela computação da adição de todos trapézios. Sinal térmico foi alcançado dividindo área pelo tempo de detecção (t_det): AUC = Σ(ΔT_i + ΔT_i-1) × 0,1 ÷ 2; T_auc = AUC ÷ t_det. Ao aplicar ambos métodos na detecção, análise AUC deu melhor repetibilidade da quantificação. Portanto, análise AUC foi selecionada para seu uso na quantificação final de calor.

Para avaliar desempenho dos diferentes métodos de detecção, avaliamos LOD da quantificação. Em cada experimento, medimos uma concentração para quatro amostras (quatro tiras, n = 4). Considerando desvio padrão (σ₀) do grupo branco e sensibilidade (S) que é inclinação da curva padrão em faixa linear, avaliamos LOD como: LOD = 3σ₀/S.

Procedimento do Ensaio

Procedimento completo do ensaio compreendeu três etapas principais: (1) coleta de dados, (2) detecção e aquisição de resultado, e (3) exibição e armazenamento de resultado. Primeiro, tira de teste foi carregada no cartucho e inserida no dispositivo. Medição foi realizada simplesmente tocando botão de detecção e digitando informações do paciente (opcionalmente, código anônimo pode ser inserido). Informação foi transmitida para unidade de microcontrolador (MCU) e armazenada. Então, MCU ativou sensor de temperatura e diodo laser para iniciar teste. Enquanto isso, dados de temperatura recebidos pelo MCU foram enviados para LCD para exibição e plotagem em tempo real. Após detecção, MCU calculou valor AUC e representou resultado na tela.

Resultados e Discussão

Caracterização das Nanopartículas

Espectros UV-Vis de nanoprismas conjugados mostrados na Fig. 2a, indicando que pico máximo está a 1130 nm. Absorbância de AuNPr no comprimento de onda do laser (1064 nm) é 92% da absorbância máxima a 1130 nm. Imagens MEV e MET (Fig. 2b, c) foram coletadas para visualizar morfologia das nanopartículas, confirmando maioria de formas triangulares.

Otimização das Condições de Medição no Dispositivo

Em sensoriamento térmico, tempo de detecção e distância do diodo laser à linha de teste são principais fatores que influenciam resposta do sinal. Dois fatores foram estudados para otimizar condições de medição. Para otimização do tempo de irradiação, irradiamos tiras por 10 min e registramos mudanças de temperatura por ambos sensores respectivamente. Como visto na Fig. 3a, temperatura continuou subindo dentro de 10 min, mas aumento de temperatura começou atingindo platô após 120 s. Este resultado corresponde a pesquisa prévia onde tendência similar foi observada em mudanças de sinal térmico com tempo. Considerando requisitos de POCT e consumo de potência, tempo de detecção do dispositivo foi definido para 120 s.

Otimização da distância foi então realizada. Figura 3b mostrou que sinal térmico diminuiu com aumento de distância entre diodo laser e linha de teste. Razão pode ser que potência do laser atingindo linha de teste foi atenuada conforme distância aumenta área efetiva irradiada. Para ganhar máxima resposta de sinal, distância foi definida para 7 mm.

Efeito da Temperatura Ambiente no Sensoriamento Térmico

Como sensoriamento térmico é intimamente relacionado a temperatura, foi necessário pesquisar como temperatura ambiente influencia sensoriamento térmico. Temperatura ambiente variou de 27,5 a 40 °C usando incubadora. Total de 4 amostras foram medidas em cada ponto de temperatura com intervalo de 2,5 °C. Curvas de temperatura ambiente versus sinal térmico foram medidas para branco e tiras de 1 OD/mL respectivamente por ambos métodos de sensoriamento térmico. Parâmetros de curva de ajuste da temperatura ambiente mostrados na Tabela 1. Figura 4a mostra que em modo condução, inclinações das curvas foram geralmente consistentes para diferentes concentrações, indicando que mudanças na temperatura ambiente tiveram mesmo efeito em diferentes concentrações. Como resultado, curva de efeito ambiente pode ser usada para calibrar resultados quantitativos. Em modo radiação, inclinações das curvas (Fig. 4b) correspondentes às duas concentrações foram consistentes entre si, mas ambas curvas mostraram tendência descendente. Resultados sugerem que modo condução é mais confiável quando medindo amostras sob condições com alta variabilidade de temperatura.

Quantificação das Nanopartículas

Detecção por Sensoriamento Térmico

Para obter curvas de quantificação padrão, dois métodos de sensoriamento térmico foram usados respectivamente para detectar tiras de teste contendo nanopartículas na faixa de 0 a 10 OD/mL. Essas tiras contendo diferentes concentrações de nanopartículas foram detectadas pelo dispositivo portátil mencionado. Configuração de ambos sensores no dispositivo apresentada no Arquivo adicional 1: Figura S5a e S5b. Quatro amostras foram testadas para cada concentração a temperatura ambiente de 27,5 °C. Dispositivo aplicou método AUC para calcular sinal térmico na linha de teste. Portanto, quantificação do sinal térmico foi proporcional à quantidade de nanopartículas na linha de teste. Curvas de quantificação (Fig. 5a) foram geradas por regressão linear dos dados obtidos do sinal térmico contra concentração das nanopartículas e representadas pelas fórmulas na Tabela 2.

Tabela 2 mostra que sensibilidade do modo radiação foi 15 vezes maior que modo condução. LOD de modos condução e radiação foram 0,053 OD/mL e 0,023 OD/mL respectivamente. Em sensoriamento térmico, modo radiação melhorou limite de detecção (LOD) em 2 vezes comparado com modo condução. Estabilidade de tiras EFL também foi testada. Modo de sensoriamento térmico condutivo requer transferência de calor entre dois sólidos. Quando temperatura da linha de teste subiu rapidamente, leva tempo (tempo de relaxamento) para sensor atingir mesma temperatura da linha de teste. Como resultado, temperatura do sensor foi menor que temperatura real na linha de teste no final da detecção. Por outro lado, modo radiação não requer transferência de calor para sensor, pois sensor detecta diretamente onda IV irradiada pela linha de teste para obter sua temperatura atual. No modo condução de detecção, parte do calor foi dissipada devido à presença de bons condutores térmicos que funcionaram como dissipador de calor, enquanto na detecção por radiação, apenas ar e a própria tira intervieram na dissipação de calor. Essas razões explicam que sensibilidade do método condutivo é menor que método de radiação.

Ao testar tiras com concentração de 10 OD/mL, encontramos marca de queima usando modo radiação (não-contato). Uma possível razão é que na medição não-contato, baixa condutividade térmica do ar permite calor ser retido na linha de teste e dissipar menos eficientemente, aumentando temperatura local efetiva e eventualmente causando combustão da membrana.

No modo contato de detecção, contudo, sensor com grande condutividade térmica atuou como meio e dissipador de calor. Assim, calor foi conduzido ao sensor de forma que nenhuma combustão ocorreu na linha de teste.

Comparação Entre Sensoriamento Térmico e Detecção Visual

Devido à sua popularidade para dispositivos portáteis e amplo uso, comparamos sensoriamento térmico com detecção visual para sua capacidade de detecção. Para detecção visual, fotos da tira foram tiradas por câmera digital de microscópio convencional. Tiras de teste foram montadas no cartucho para garantir consistência posicional da análise de imagem de forma similar ao sensoriamento térmico. Software Image J foi usado para analisar valor de cinza na linha de teste para diferentes concentrações de nanopartículas. Curva padrão do método de detecção visual foi plotada baseada nos resultados desta análise. Faixa linear entre valor de cinza e concentração de nanopartículas foi 0,2–10 OD/mL (R² foi 0,770 para faixa 0–0,2 OD/mL, então foram descartadas de análise posterior). Limite de detecção foi 0,268 OD/mL. Resultados indicaram que sensoriamento térmico pode reduzir LOD em 5 a 12 vezes comparado à detecção visual. Na pesquisa de Qin, encontraram que LOD para análise visual foi 100 vezes maior que contraste térmico. Como empregaram alta potência de laser e câmera infravermelha, ganharam maior diferença em LOD. Explicação razoável para melhora de LOD é que sensoriamento térmico consegue medir nanopartículas no topo e abaixo da superfície da membrana. Outra vantagem do sensoriamento térmico é que tem maior estabilidade que detecção visual. Sensoriamento térmico gera calor pelas nanopartículas em toda linha de teste. Detecção visual depende apenas da reação de cor das nanopartículas na superfície da linha de teste. Mesmo se concentrações de analito de duas tiras de teste são iguais, distribuição das nanopartículas na linha T no plano tangencial é diferente; assim, inspeção visual resultará em diferença nos resultados de detecção enquanto sensoriamento térmico é mais estável e reprodutível. Por outro lado, sensibilidade da detecção visual foi 2 vezes maior que sensoriamento térmico. Detecção visual é método direto para quantificar nanopartículas, enquanto sensoriamento térmico é medida indireta da concentração de nanopartículas medindo mudanças de temperatura, o que pode explicar parcialmente falta de sensibilidade. Figura 5b demonstra que faixa linear de detecção para sensoriamento térmico pode ser tão baixa quanto 0 OD/mL, com R² de 0,972 (condução) e 0,987 (radiação), sugerindo que sensoriamento térmico tem melhor potencial para aplicações em detecção precoce em POCT que quantificação de cor, já que analitos alvo estão em concentrações mais baixas.

Detecção Quantitativa de HCG

Finalmente, biomarcador HCG foi quantificado usando nosso sistema para validar sensoriamento térmico. Ambos modos condução e radiação foram aplicados para quantificar HCG. Potência óptica foi reduzida para 150 mW, prevenindo queima das tiras. Tiras com quatro diferentes concentrações foram testadas. Figuras 6a e b mostram que sinais térmicos foram lineares à concentração de HCG de 35 a 700 mUI/mL. Quando concentração foi estendida à faixa de 35–7000 mUI/mL, linearidade foi entre logaritmo da concentração e sinal térmico como na Fig. 6c, d. Em modo condução, LOD foi 64,2 mIU/mL que está em faixa similar à detecção visual. Contudo, LOD ideal do modo radiação foi 2,8 mIU/mL. Dados corresponderam com quantificação de nanopartículas. Comparado com outros dispositivos que aplicaram efeito fototérmico (LOD = 5,5 mIU/mL), nosso dispositivo em modo radiação reduziu LOD em quase 2 vezes. Esses resultados provaram que sensoriamento térmico é forma eficaz em detecção e quantificação EFL.

Conclusões

Método de sensoriamento térmico plasmonico para detecção EFL foi estabelecido. Dispositivo portátil baseado neste método foi desenvolvido aplicando diferentes sensores de temperatura (modos condução e radiação). Estudo da influência da temperatura ambiente demonstrou que tem impacto negativo no sensoriamento térmico e modo condução foi menos afetado que modo radiação. Em modo radiação, impacto foi mais significativo em altas concentrações. Ambos modos também foram testados para comparar capacidade de quantificação. Quando comparado com detecção visual tradicional, métodos de sensoriamento térmico mostraram melhora de 5 a 12 vezes em LOD para quantificação de nanopartículas. Modo radiação mostrou melhor desempenho que modo condução em tanto sensibilidade quanto LOD. Na validação do sensoriamento térmico, tiras EFL para detecção de HCG foram testadas e resultados demonstraram que modo radiação foi muito mais sensível que modo condução. Dessa forma, provamos que sensoriamento térmico é forma viável e eficaz para detecção precoce em plataformas EFL.

Em conclusão, sensoriamento térmico plasmonico pode realmente melhorar sensibilidade analítica e mostra futuro promissor em detecção EFL para aplicações de diagnóstico precoce. Dispositivo portátil descrito aqui forneceu duas abordagens de sensoriamento para satisfazer diferentes requisitos.