Projetando Lipossomas Sensíveis ao pH Carregados com Nanopartículas Aptamer-Gold Encapsulam Morin para o Tratamento do Câncer

Resumo

Este estudo propõe a síntese de um tipo de nanopartícula anticâncer, aptâmeros e lipossoma sensível ao pH Morin modificado com nanopartícula de Au (Apt-Au), que exibe propriedades de direcionamento. Os tumores são difíceis de curar porque seu microambiente difere daquele do tecido normal; seu pH é inferior ao do tecido normal, o que geralmente impede a eficácia dos medicamentos. Assim, as drogas responsivas ao pH têm atraído muita atenção. Nanopartículas de ouro (AuNPs) mostram potencial como carreadores de drogas devido ao seu tamanho pequeno, boa biocompatibilidade, fácil modificação de superfície e forte penetração celular. Apt-Au @ MSL exibe excelentes propriedades de monodispersidade e de direcionamento a tumor e pode ser liberado em ambiente parcialmente ácido por meio de diálise. Nós rastreamos nosso modelo de célula cancerosa pelo ensaio MTT e descobrimos que as células SGC-7901 podem suprimir a proliferação de forma eficaz. Os resultados in vivo demonstram que a administração de Apt-Au @ MSL pode inibir o crescimento do tumor em modelos de ratinho com xenoenxerto. A coloração H&E e o ensaio TUNEL confirmaram ainda que Apt-Au @ MSL pode promover a apoptose tumoral. Apt-Au @ MSL pode induzir a apoptose, desencadeando a superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS) e regulando a diafonia de sinal múltiplo. Ambos os testes de bioquímica do sangue e coloração H&E sugeriram que esses materiais exibem toxicidade aguda desprezível e boa biocompatibilidade in vivo. Com sua função poderosa, Apt-Au @ MSL pode ser usado como um material anticâncer baseado em alvo para o futuro tratamento clínico do câncer.

Introdução

Uma das causas de morte mais prevalentes [1], o câncer, pode levar a perdas econômicas substanciais e danos aos seres humanos. Esforços consideráveis ​​têm sido direcionados ao desenvolvimento de medicamentos inteligentes para o tratamento do câncer [2]. Devido à sua capacidade de proteger os medicamentos até que atinjam o local de destino, as nanopartículas de polímero podem melhorar a distribuição de medicamentos terapêuticos [3]. Para garantir que o agente terapêutico seja entregue ao sítio ativo, são utilizadas nanopartículas altamente reativas. Essas nanopartículas podem ser projetadas para variar nas propriedades do material sob diferentes estímulos biológicos. Nanopartículas reativas são projetadas usando diferentes estímulos, incluindo estímulos externos (por exemplo, temperatura e luz) e estímulos biológicos (por exemplo, condições de pH ou redox). NPs responsivos ao pH têm atraído interesse de pesquisa devido às mudanças no pH após a endocitose das nanopartículas. Os materiais que respondem ao pH também chamam a atenção porque a função responsiva ao pH pode ser facilmente integrada a uma variedade de estruturas poliméricas para projetar um conjunto de nanopartículas que respondem ao pH. As nanopartículas podem responder ao pH pela alteração da química da superfície, mudança no tamanho ou forma das partículas e quebra ou liberação de substâncias. Esta mudança nas propriedades das nanopartículas pode ser usada para regular a captação celular e a liberação controlada. Portanto, nanopartículas responsivas ao pH fornecem uma estratégia poderosa para o projeto de sistemas de distribuição terapêutica.

O hidrato de morina (3,5,7,2 ′, 4′-pentahidroxiflavona) (Fig. 1) é uma substância ativa natural isolada de fitoterápicos ou plantas chinesas [4]. É um composto de progesterona e um metabólito secundário do fenol nas plantas. Morin é amplamente distribuído na natureza e exerce bons efeitos antioxidantes, anticâncer [5] e antiinflamatórios significativos. O potencial de Morin para várias aplicações tem atraído considerável interesse [6], mas tal potencial é significativamente limitado pela baixa solubilidade em água e biodisponibilidade da substância [7].

Estrutura química do hidrato de morin

Os lipossomas (ocos) compostos por lecitina e ceramida, entre outros, possuem uma estrutura em bicamada composta por moléculas lipídicas anfifílicas [8]. Os lipossomas fornecem características desejáveis, como biocompatibilidade, funcionalidade, efeitos colaterais reduzidos e capacidade de encapsular grandes quantidades de medicamento [9, 10]. Eles podem transportar com eficiência agentes hidrofílicos e hidrofóbicos e protegê-los de condições externas, transportando-os com sucesso para as regiões de tecido-alvo [11]. A eficácia melhorada é incorporada no projeto para facilitar a liberação desencadeada por pH do material anticâncer dentro do interstício tumoral por meio de lipossomas sensíveis ao pH [12,13,14,15]. Esses lipossomas sensíveis ao pH são lipossomas especiais que liberam drogas em ambientes de tecido e se desestabilizam rapidamente em ambientes ácidos, como endossomos de tecido canceroso [16,17,18].

Para maior seletividade e eficácia do tratamento do tumor, os lipossomas sensíveis ao pH devem ser modificados para formar nanopartículas direcionadas ao tumor [19]. Os aptâmeros de DNA foram recentemente desenvolvidos como sensores de imagem e biossensibilização altamente seletivos e sensíveis, bem como agentes potenciais para terapias direcionadas ao câncer [20]. Foi demonstrado que o aptâmero de DNA de fita simples AS1411 funciona como um agente quimioterápico por causa de sua alta afinidade de ligação para núcleos de células cancerosas [21]. Este aptâmero (Apt) foi combinado com Au NPs para fabricar um nanoconstruto de dois componentes de Au NPs carregados com Apt que podem interagir com núcleos de células cancerosas. Alguns estudos também demonstraram que o projeto de híbridos de nanopartículas de lipossoma pode fornecer uma caixa de ferramentas rica para a fabricação de tais modalidades multifuncionais [22]. Um sistema vesicular de lipossoma-Au NP híbrido que consiste em lipossomas catiônicos e NPs de Au foi projetado para melhorar a penetração da droga no interstício do tumor e aumentar a atividade anticâncer [23, 24].

Nanopartículas de ouro (Au NPs) têm sido consideradas boas transportadoras de drogas e podem ser modificadas com moléculas bio-relacionadas para aumentar a especificidade direcionada ao câncer [25]. Com a modificação da superfície de Au NPs, o aptâmero do grupo sulfidrila pode ser usado para modificar a superfície de Au NPs, que pode ser direcionado pela ligação covalente Au-S, e o grupo sulfidrila apropriado na superfície do nanogold pode ser anexado a a superfície nanogold [26]. De uma perspectiva de engenharia e aplicação, os nanomateriais de ouro ligados a ligantes fornecem uma plataforma poderosa para facilitar a identificação, detecção e tratamento direcionados.

No presente estudo, usamos lipossomas sensíveis ao pH que encapsulam Morin e montamos Au-Apt que foi modificado na superfície dos lipossomas (Apt-Au @ MSL, Fig. 3a). Morin, que é caracterizada por baixa solubilidade em água e biodisponibilidade, foi transformada. A morfologia, o tamanho e outras propriedades do Apt-Au @ MSL preparado foram caracterizados. A nova nanopartícula mostrou propriedades direcionadas ao tumor e alta atividade anticâncer. A atividade anticancerígena de Apt-Au @ MSL foi explorada in vitro e in vivo (Fig. 2).

Diagrama esquemático proposto de nosso Apt-Au @ MSL projetado contendo Morin para entrega de drogas às células cancerosas com propriedade direcionada ao tumor.

Materiais e métodos

Materiais

L-α-Fosfatidilcolina (PC), colesterol (Chol), hemisuccinato de colesteril (CHEMS), Morin (≥ 99,99%), citrato de sódio (99,9%), HAuCl ₄ · 3H ₂ O (≥ 99,9%), polivinilpirrolidona (PVP, peso 40.000), NaOH (≥ 98,0%) e HCl (37%) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Co. (EUA). O aptâmero AS1411 com uma modificação de dissulfeto foi sintetizado por TaKaRa (Dalian, China) com a seguinte sequência:5′-HS-T- (C6-S-S-C6) -TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3 ′. Brometo de azul de tiazolil tetrazólio (MTT), iodeto de propídio (PI), calceína e Alexa Fluor 488 Anexina V foram adquiridos na Sigma-Aldrich Chemical. Todas as soluções aquosas foram preparadas em água bidestilada. Todos os outros reagentes foram os melhores disponíveis comercialmente.

Síntese de Au NPs

Até 1 mL de HAuCl ₄ · 4H ₂ O (1%) foi dissolvido em 25 mL de água Milli-Q (pH =5,5), e 50 mg de PVP foram adicionados à solução. A solução obtida foi vertida em um frasco de três gargalos (150 mL) e foi tratada por irradiação de micro-ondas (MW) por 5 min com agitação mecânica. Subsequentemente, 1,5 mL de solução de citrato de sódio (1%) foram rapidamente adicionados à solução e irradiados com MW por 3 min. A solução foi recolhida por centrifugação a 10.000 rpm durante 5 min.

Síntese de NPs Apt-Au

A ligação dissulfeto dos aptâmeros foi clivada usando tris (2-carboxietil) fosfina. Após 30 min, a solução de aptâmero (100 μL, 100 μM) foi adicionada a 10 mL de solução 5 nM de Au NPs e, em seguida, incubada por 24 h para formar Au-Apt NPs. Após 1 dia, salgamos a solução da mistura com 2,5 mL de uma solução 500 mM de NaCl duas vezes, separados por 4 h [27].

Preparação de lipossomas sensíveis ao pH

Lipossomas compostos de ovo PC para CHEMS para Chol na razão molar de 33:13:5 e 5% de Morin foram preparados por hidratação de filme. Egg PC, CHEMS, Chol e 2 mg de Morin foram dissolvidos em 8 mL de CHCl ₃ , e os solventes orgânicos foram removidos a 40 ° C com um evaporador rotativo. Para Morin-lipossomas, o filme lipídico fino resultante foi hidratado usando PBS a 2% (p / v) e depois sonicado usando uma sonda de banho de gelo por 15 min. O lipossoma final foi sintetizado e estabilizado no sistema coloidal. Para os lipossomas sensíveis ao pH Apt-Au @ Morin (Apt-Au @ MSL), o filme lipídico foi hidratado com NPs Au-Apt de 475 μg / mL em dextrose a 5% seguido por sonicação [23].

Caracterização

A espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis, S-3100 Photodiode Array, Scinco Co., Ltd., Coréia) e a espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) foram conduzidas (Nicolet iS50, EUA, Thermo Fisher Scientific). A morfologia do Apt-Au @ MSL foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, HT7700, Tokyo Japan, Hitachi). A porcentagem de liberação de Morin foi detectada por espectroscopia UV-vis. A morfologia dos lipossomas Morin e Apt-Au @ MSL também foi observada por microscopia eletrônica de varredura (SEM, S-4800, Hitachi, Japão). Medidas de dispersão dinâmica de luz (DLS) e potencial zeta foram usadas para caracterizar as propriedades ópticas e os tamanhos dos lipossomas Morin e Apt-Au @ MSL em um analisador de potencial Brookhaven ZetaPALS.

Cultura de células

As linhas de células de câncer humano, SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 e Hs68, foram adquiridas na American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas em RPMI com 10% de soro fetal bovino a 37 ° C e 5% CO ₂ .

Estudo de atividade anticâncer in vitro

SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 e Hs68 foram semeados em placas de 96 poços (2,0 × 10 ³ células / poço) e depois cultivadas com Apt-Au @ MSL em concentrações variáveis ​​(0, 5, 10, 15, 20 e 30 μg / mL). Au NPs e Morin foram designados como grupos de controle. O grupo em branco consistia em células não tratadas. As placas de 96 poços foram incubadas em uma incubadora umidificada. Após a incubação, 9,6 mL de solução de MTT (5 mg / mL) foram adicionados a cada poço e posteriormente incubados por 2 h. Cada grupo foi testado em triplicado, e IC ₅₀ os valores foram derivados dos valores médios de DO dos testes em triplicado versus curvas de concentração de fármaco. O brilho de cada grupo foi obtido por microscopia confocal de fluorescência [28].

A adesão celular foi monitorada usando um sistema eletrônico de detecção de células em tempo real (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) a cada 10 min por 75 h. Para determinar a adesão celular, cada poço na placa foi semeado com células (1,0 × 10 ⁴ células / poço) com um meio fresco para um volume final de 200 μL e, em seguida, incubado em uma solução Apt-Au @ MSL em concentrações variáveis ​​(10, 20 e 30 μg / mL) em 10 h incubado por 12 h [29] . O grupo em branco consistia em células não tratadas e os grupos de controle consistiam nos grupos Morin e Morin-lipossoma.

Microscopia de fluorescência

As células SGC-7901 foram cultivadas em placas de 48 poços durante a noite a 37 ° C, 5% de CO ₂ . As células foram então tratadas com soluções Apt-Au @ MSL (10 e 30 μg / mL) em diferentes concentrações por 12 h. Os grupos de controle consistiram nos grupos Morin e Morin – lipossoma. Posteriormente, o meio foi removido. O grupo em branco consistia em células não tratadas. As células foram lavadas com PBS três vezes. As células foram coradas e então medidas por co-coloração de células vivas e mortas (o ensaio LIVE / DEAD). Após a co-coloração com Calceína-AM / PI por 30 min, as células foram lavadas com PBS duas vezes para remover o excesso de corante, e as imagens de fluorescência foram obtidas por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) (para calceína-AM, Ex =488 nm e Em =515 nm; PI Ex =535 nm e Em =615 nm [30]).

Análise de morte celular apoptótica

Para medir os efeitos anticâncer de Apt-Au @ MSL, cada poço em uma placa de seis poços foi semeado com células SGC-7901 (1,0 × 10 ⁵ células / poço) e, em seguida, incubados em soluções Apt-Au @ MSL em concentrações variáveis ​​(5, 10, 20 e 30 μg / mL) por 12 h. O grupo em branco consistia em células não tratadas e os grupos de controle consistiam nos grupos Morin e Morin-lipossomas. Após o tratamento, as células foram coletadas e lavadas com PBS duas vezes. As células foram coradas com PI e Anexina V – FITC e então analisadas usando um analisador CytoFLEX (Beckman Coulter) (para PI, Ex =535 nm e Em =615 nm; Anexina V – FITC, Ex =488 nm e Em =525 nm ) [31].

Estudos sobre destruição de paredes

Para estudar a destruição da parede celular no ensaio anticâncer, as células SGC-7901 foram cultivadas em placas de seis poços a 37 ° C e 5% de CO ₂ . As células cultivadas sem o material foram usadas como o grupo em branco. Depois que as células foram cultivadas com Apt-Au @ MSL em concentrações variáveis ​​(5, 10, 20 e 30 μg / mL) por 12 h, elas foram tratadas com solução de Tripsina-EDTA 0,25%. Todas as células (incluindo as células flutuantes no meio) foram coletadas com 2.000 r / min por 5 min. As células coletadas foram fixadas posteriormente em solução de dialdeído glutárico a 2,5% por 4 h [32]. As células fixadas foram desidratadas em uma série de gradiente de acetona por 20 min. As células foram finalmente submetidas a uma série de procedimentos, montados em grades de cobre e observados por TEM (HT-7700, Hitachi, Japão).

Ensaio de Western Blot

A expressão da proteína de células SGC-7901 foi detectada por análise de Western blot. Células SGC-7901 (4,0 × 105 células / poço) foram inoculadas em uma placa de cultura de 9 cm e 20 μg / mL de Apt-Au @ MSL por 1, 6, 12 e 24 h. As células foram colhidas após o tratamento e suspensas em um tampão de lise celular em gelo por 1 h. A mistura foi colocada em uma centrífuga a 11.000 g a 4 ° C durante 10 min, e o sobrenadante contendo proteína celular total foi recolhido. A concentração total de proteína no sobrenadante foi determinada usando o método BCA. A proteína foi então ressuspensa no tampão de carregamento e fervida a 100 ° C durante 10 minutos. As amostras contendo quantidades iguais de proteína (40 μg / via) foram submetidas a SDS-PAGE (géis de tricina a 10%). Em seguida, foram transferidos para membranas de nitrocelulose (NC) a 100 V por 1,5 h e bloqueados com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris com Tween-20 a 0,1% (TBST) por 1 h. Em seguida, a membrana NC foi incubada com os anticorpos primários e o segundo anticorpo, respectivamente. As bandas da proteína alvo foram visualizadas na membrana usando os reagentes de detecção de Western blotting ECL. A β-actina foi usada como um controle interno de carga e transferência de proteínas iguais. A expressão das proteínas foi quantificada pelo software Quantity-One, e a taxa de expressão foi marcada sob a banda [33].

Modelo Animal

Camundongos nus machos BALB / c (~ 17 g) foram adquiridos do Model Animal Research Center da Universidade de Nanjing e criados em um ambiente axênico (animais livres de patógenos específicos). Modelos de tumor foram estabelecidos por injeção subcutânea de suspensão de células (células SGC-7901, 100 μL, 1 × 10 ⁶ / mL) no ombro dos ratos nus. Imagens brilhantes do tumor foram geradas 15 dias após a injeção subcutânea das células tumorais. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados pelo Anhui Agricultural University Laboratory Animal Center (Número da licença:SYXK 2016-007). Um paquímetro foi usado para determinar o diâmetro longitudinal máximo (comprimento) e diâmetro transversal máximo (largura) de cada tumor. O volume do tumor foi então calculado usando a fórmula comprimento x largura ² × 0,5 [34].

Estudo Anticâncer In Vivo

Os testes de acompanhamento foram realizados quando o volume do tumor atingiu 50 mm ³ . Os camundongos divididos aleatoriamente em cinco grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos intravenosos:PBS (100 μL), Morin, Morin-lipossomas, Au-Apt e Apt-Au @ MSL. Os camundongos foram injetados por via intravenosa na cauda na dose de 2 mg / kg do material para tratamento. Os tamanhos dos tumores dos camundongos foram medidos após 24 dias. O peso corporal e a sobrevivência dos camundongos também foram determinados. Os camundongos foram sacrificados e os tecidos tumorais e de órgãos dos camundongos foram coletados para coloração H&E [35, 36].

Após bloqueio e permeabilização, as lâminas de tumor foram lavadas com PBS, coradas com ensaio TUNEL e submetidas a contracoloração DAPI. Imagens de fluorescência foram obtidas por CLSM. Para imagens DAPI, Ex =358 nm e Em =461 nm, e para o ensaio TUNEL, Ex =450–500 nm e Em =515–565 nm [37].

Ensaio de avaliação de toxicidade

Para avaliar a toxicidade do tratamento com Apt-Au @ MSL em órgãos vitais, os ratos nos quatro grupos de tratamento foram sacrificados após 30 dias. Os órgãos importantes (fígado, baço, rins, coração, pulmões e tumor) dos camundongos de todos os grupos foram coletados e corados com H&E. Amostras de sangue também foram coletadas e a glicemia foi medida. Além disso, os pesos dos ratos foram determinados [38].

Resultados e discussão

Caracterização

O presente estudo teve como objetivo desenvolver um novo lipossoma que possua as vantagens das nanopartículas (NPs de Au carregadas com Apt) e possa ser usado efetivamente como um agente anticâncer. As propriedades básicas dos novos lipossomas são importantes para a realização de estudos posteriores. Apt-Au @ MSL foi sintetizado conforme descrito em um estudo anterior [23], com pequenas modificações, e então caracterizado usando vários métodos (Fig. 3). A Figura 3b apresenta os resultados da espectroscopia UV-vis, que mostra o pico característico e pode monitorar a formação de Au NPs. Picos característicos foram observados no espectro UV-vis de Au NPs em aproximadamente 530 nm. Especificamente, a análise de espectros de UV-vis exibiu forte absorvância de UV, que foi influenciada pela modificação de superfície do Apt. Os mesmos resultados foram observados. Os picos característicos foram deslocados após os lipossomas sensíveis ao pH serem revestidos com Morin. O pico característico do Apt-Au @ MSL fabricado estava localizado a 362 e 550 nm. Esses resultados indicaram que a síntese foi concluída com sucesso. Para posterior caracterização, a espectroscopia FT-IR foi conduzida para verificar os resultados da síntese. O desvio para o vermelho dos picos característicos de Morin – lipossomas e Apt-Au @ MSL indicou ainda o sucesso da modificação de Morin (Fig. 3c). Realizamos o ensaio de liberação de Morin em PBS em diferentes níveis de pH para determinar a sensibilidade ao pH de Apt-Au @ MSL. Esses três valores de pH simulam o ambiente neutro da circulação sanguínea, o ambiente levemente ácido do tumor e o ambiente ácido do corpo intracelular. A porcentagem de liberação de Morin foi detectada por espectroscopia UV-vis. Em pH 5,0, cerca de 54% do Morin foi liberado em 24 h, e a liberação contínua foi observada nas 96 h seguintes; entretanto, em pH 7,4, apenas cerca de 10% de Morin foi liberado em 24 h. Estes resultados mostram que Apt-Au @ MSL exibe boa estabilidade em condições fisiológicas normais, evitando o vazamento do medicamento; entretanto, a droga é liberada rapidamente no corpo nuclear. Este comportamento de liberação da droga pode efetivamente melhorar o efeito do tratamento (Fig. 3d). TEM e SEM foram conduzidos para elucidar as estruturas do lipossoma e Apt-Au @ MSL (Fig. 3f). TEM foi conduzido para elucidar as estruturas dos AuNPs. Como mostrado na Fig. 3g, os AuNPs têm um tamanho de partícula de cerca de 10 nm, que é consistente com o tamanho da modificação nos lipossomas (Fig. 3g). Os resultados SEM na Fig. 3e indicam que os lipossomas brutos formam apenas vesículas unilamelares com um diâmetro não uniforme de cerca de 120 nm, que é consistente com o tamanho determinado por DLS. Em contraste, Apt-Au @ MSL mostra que a morfologia de vesículas híbridas é atribuída à modificação Au-Apt. O diâmetro de 150 nm também foi consistente com o tamanho determinado por DLS (Fig. 3i). Notavelmente, a investigação de TEM das interações entre os lipossomas sensíveis ao pH e Au-Apt revelou que os NPs Au estavam associados quase exclusivamente com a bicamada lipídica vesicular e localizados na periferia das vesículas (Fig. 3h). As medições do potencial ζ são apresentadas na Fig. 3j, e os potenciais zeta de Au NPs e Au-Apt são negativos. O resultado mostra que tanto Au NPs (- 57,1 ± 0,3 mV) e Au-Apt têm carga negativa (- 31,7 ± 0,2 mV). Apt-Au @ MSL foi modificado com Morin-lipossomas carregados positivamente e o potencial alterado para 36,4 ± 0,3 mV. A adsorção de carga positiva e negativa é o mecanismo pelo qual os lipossomas Au-Apt e Morin se ligam. Além disso, a Fig. 3k representa a mudança na taxa de encapsulamento da partícula ao longo do tempo, indicando a estabilidade da partícula ao longo de um período de tempo. Como mostrado na Fig. 3k, a taxa de encapsulamento da partícula dificilmente muda dentro de 24 h, indicando que a partícula exibe boa estabilidade ao longo de um período de tempo. A curva padrão de concentração de Morin versus a absorvância de UV-Vis de Morin foi preparada para estudar a taxa de encapsulação de Morin-lipossoma e Apt-Au @ MSL. Os resultados revelaram que a eficiência de aprisionamento de Morin – lipossoma e Apt-Au @ MSL pode chegar a 90,2% e 89,6%, conforme mostrado na Tabela S1 e Fig. S1

Imagens de caracterização. a Ilustração esquemática da síntese de Apt-Au @ MSL. b Espectros de absorção ultravioleta de Morin, Au NPs, Au-Apt, Morin – lipossoma e Apt-Au @ MSL. c Espectrômetros FT-IR de Morin, Morin – lipossoma e Apt-Au @ MSL. d O comportamento de liberação de Morin de Apt-Au @ MSL em diferentes condições de pH. e Imagem SEM do lipossoma Morin. f Imagem SEM do Apt-Au @ MSL. g Imagem TEM do Au NPs. h Imagem TEM do Apt-Au @ MSL. eu Diâmetros de Morin – lipossoma e Apt-Au @ MSL determinados pelo menos três vezes via DLS. j ζ-Potencial de Au NPs, Apt-Au e Apt-Au @ MSL. k Taxa de eficiência de aprisionamento (EE%) de Morin – lipossoma e Apt-Au @ MSL

Teste de atividade anticâncer de Apt-Au @ MSL

In Vitro

Morin exibe atividade antitumoral superior, mas tem baixa biodisponibilidade devido à sua baixa solubilidade em água. Após Morin ser encapsulado por lipossomas sensíveis ao pH e transformado em um material solúvel em água, a superfície do lipossoma foi modificada usando Au-Apt para obter o efeito antitumoral direcionado. A Figura 4a mostra a atividade anticâncer de Apt-Au @ MSL por ensaio de MTT in vitro. A concentração do medicamento é definida pela concentração de Morin. O grupo tratado com Morin não apresentou atividade anticâncer aparente, em comparação com o grupo em branco. No entanto, o grupo tratado com Morin encapsulado por lipossomas sensíveis ao pH exibiu atividade anticâncer aumentada. O resultado sugere que a atividade antitumoral dos lipossomas do Morin era superior à do Morin bruto. Simultaneamente, descobrimos que a atividade antitumoral do lipossoma modificado por Apt (Apt-Au @ MSL) foi melhorada. A Tabela 1 lista o IC ₅₀ valores de Morin, Morin – lipossomas, Apt-Au @ MSL e cisplatina. Morin, Morin – lipossomas e Apt-Au @ MSL exibiram uma ampla gama de atividade anticâncer em células tumorais. Eles mostraram uma preferência distinta por células SGC-7901 com alta potência e baixa toxicidade para células humanas normais. O IC ₅₀ valor de Apt-Au @ MSL foi 15,6 ± 1,5 μg / mL para as células SGC-7901. Esses resultados foram confirmados por testes RTCA. As células SGC-7901 foram cultivadas com Apt-Au @ MSL em diferentes concentrações; o grupo em branco foi tratado com PBS, e o grupo controle consistiu de Morin e Morin – lipossomas. A adesão e o espalhamento foram monitorados usando iCELLigence (Fig. 4b). Os resultados foram muito semelhantes aos obtidos pelo teste de MTT. A atividade antitumoral de Apt-Au @ MSL foi significativamente maior do que a de Morin e Morin-lipossomas. Apt-Au @ MSL pode inibir a proliferação de células SGC-7901 com um aumento na concentração. Alterações na morfologia celular após o tratamento com Apt-Au @ MSL também foram observadas por microscopia de fluorescência. Conforme mostrado na Fig. 4c, as células SGC-7901 sem Apt-Au @ MSL mantêm a integridade estrutural da célula. Em contraste, a integridade celular é comprometida após as células serem tratadas com Apt-Au @ MSL em diferentes concentrações.

a Viabilidade celular de células SGC-7901 incubadas com diferentes materiais (Morin, Au-Apt, Morin-lipossoma e Apt-Au @ MSL) em diferentes concentrações (0, 5, 10, 15, 20 e 30 μg / mL). A célula tratada por PBS foi definida como um grupo em branco. b A curva de proliferação celular das células SGC-7901 foi detectada pelo sistema RT-CES. Os diferentes compostos foram adicionados às 10 h. As concentrações de a , b , e c são diferentes Apt-Au @ MSL (10, 20 e 30 μg / mL), respectivamente. c As imagens de células brilhantes nas diferentes concentrações (0, 2,5, 5, 10, 20 e 30 μg / mL)

Análise de morte celular apoptótica

A análise quantitativa da apoptose foi realizada por citometria de fluxo usando coloração com Anexina-FITC. As células foram coradas com PI e Anexina V – FITC e, em seguida, analisadas com um citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter). A anexina V foi usada para detectar células apoptóticas precoces ligadas à fosfatidilserina exposta e a marcação com PI foi usada para corar as células apoptóticas tardias. A taxa de apoptose foi de 1,57% para os grupos em branco. As células tratadas com Morin apresentaram uma proporção de apoptose de 3,51%. Apt-Au @ MSL em diferentes concentrações exibiu uma capacidade de indução mais elevada com razões de apoptose de 7,44%, 10,75%, 15,53% e 40,77% (Fig. 5). A apoptose intensificada também confirmou a excelente atividade anticancerígena induzida por Apt-Au @ MSL. A proporção de apoptose das células SGC-7901 aumentou com o aumento da concentração de Apt-Au @ MSL.

Análise de citometria de fluxo baseada em coloração com anexina V-FITC / PI de apoptose de SGC-7901 após tratamento com diferentes métodos. A concentração de a , b , c , e d é 5, 10, 20 e 30 μg / mL, respectivamente

Estudo de atividade anticâncer por ensaio de fluorescência

O efeito antitumoral em células SGC-7901 induzido por Apt-Au @ MSL foi avaliado intuitivamente por ensaios de fluorescência LIVE / DEAD. Depois que as células foram incubadas com Morin, Morin – lipossomas e Apt-Au @ MSL em diferentes concentrações, elas foram co-coradas com o kit LIVE / DEAD por 30 min no escuro. Na Fig. 6, as células do grupo em branco mostram que todas as células verdes de fluorescência representam células vivas. Os grupos de controle, incluindo Morin e Morin – lipossomas, mostram o número de células fluorescentes vermelhas. No entanto, as células que foram tratadas com Apt-Au @ MSL em diferentes concentrações exibiram claramente um grande número de células apoptóticas. Com o aumento da concentração, as células vivas diminuíram gradualmente. A porcentagem de células mortas aumentou predominantemente e a densidade celular diminuiu. O resultado confirmou que Apt-Au @ MSL pode efetivamente promover a apoptose tumoral.

Imagens microscópicas de fluorescência de SGC-7901 incubadas com concentração diferente de Apt-Au @ MSL e coloração breve subsequente. O grupo em branco era PBS. O Morin e o Morin – lipossoma foram definidos como grupo de controle

Estudo de integridade celular

Para confirmar a influência da captação e transporte do Apt-Au @ MSL para a célula SGC-7901, realizamos o ensaio TEM. A mudança na morfologia celular foi observada por TEM. Imagens TEM foram conduzidas para observar a estrutura interna das células e fornecer uma referência para mecanismos anticâncer. Como mostrado na Fig. 7, as imagens em branco das células SGC-7901 sem tratamento exibiram mudanças significativas na morfologia e aparência das paredes celulares claras. No grupo de controle (Morin e Morin – lipossomas), a morfologia celular apresentou dano parcial e a região nuclear se contraiu. No entanto, mudanças significativas na parede celular e na estrutura interna também foram observadas após a exposição ao Apt-Au @ MSL. O citoplasma vazou e a estrutura nuclear tornou-se obscura. Muitos fragmentos de células foram formados em torno de células ocas. Além disso, as paredes celulares se desintegraram ou foram destruídas. Perfis inteiros tornaram-se obscuros, as células foram danificadas e o citoplasma vazou. As setas vermelhas representam a área Au NP. Conforme a concentração de Apt-Au @ MSL aumentou, mais regiões de Au NP apareceram no núcleo. Esta ocorrência sugeriu a liberação de Morin após Apt-Au @ MSL entrar no interior da célula, daí o aparecimento de uma grande quantidade de Au NPs. These aforementioned results suggest that antitumor activity was associated with compromised cell integrity and nuclear structure.

TEM images of SGC-7901 cells treated with different concentration of Apt-Au-MSL (10, 20, and 30 μg/mL). The blank group was PBS. The Morin and Morin–liposome were set as control group. The red square is the enlarge area. The red arrow point to Au NPs

Molecular Mechanism Induced by Apt-Au@MSL

To explore the molecular mechanism of Apt-Au@MSL-induced apoptosis, we detected the expression levels of caspases and PARP. Activation of caspase-3, -8, and -9 was first detected with specific substrates. As shown in Fig. 8a, Apt-Au@MSL treatment induces dose-dependent activation of caspase-3, -8, and -9. Caspase-9 promotes mitochondria-mediated apoptosis more than does caspase-8, indicating that the mitochondria-mediated apoptosis signaling pathway is dominant. Western blot analysis further confirmed the existence of Apt-Au@MSL-induced apoptosis at the protein level. Figures 8b and c show that after cells are treated with Apt-Au@MSL, activation of caspases and cleavage of PARP shows time and dose dependence (Figs. 8b, c). In Fig. 8d, e, the Western blot analysis confirmed our results. In conclusion, Apt-Au@MSL inhibits the growth of SGC-7901 cells mainly by inducing apoptosis.

Apt-Au@MSL induced apoptosis in SGC-7901 cells. a SGC-7901 cells were treated with indicated concentrations of Apt-Au@MSL for 24 h. Then, the total protein was extracted and incubated with synthetic Apt-Au@MSL substrates for measuring caspase activities. Dose-dependent (b ) and time-dependent (c ) effects of Apt-Au@MSL on PARP and caspases expression. d , e Quantitative analysis of PARP, caspase-7, caspase-9, and caspase-3 expressions. Data are means ± SD, *P <0,05, ** P  < 0.01

Apt-Au@MSL Inhibits Tumor Growth

In Vivo

The in vivo antitumor activities of Apt-Au@MSL were evaluated using an SGC-7901 tumor xenograft model. A comparison of the images of the tumors with those of the control group (Morin and Morin–liposomes) showed that mice treated with Apt-Au@MSL markedly reduced the weight and size of the tumor (Fig. 9a). The relative tumor volume curves and the mice weight curves indicate that the Apt-Au@MSL in vivo exhibits a higher anticancer efficiency (Fig. 9b) than those of the other treatment groups. No significant difference in average tumor volume was indicated between the control group (Morin and Morin–liposomes) and the blank group. The tumor volume of the Apt-Au@MSL group was only nearly a tenth of the blank group and nearly a sixth of the control group. The result indicated that raw Morin and Morin–liposomes at 40 mg/kg exerted no effect on the growth rate of tumors. However, Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth. The body weight of mice in the different groups (PBS, Morin, Morin–liposomes, and Au-Apt groups) showed no marked fluctuation (Fig. 9c) during the treatment period. This result suggested that the treatment was tolerated and caused no acute side effects. Notably, we found that the mice with Apt-Au@MSL treatment showed markedly prolonged survival (Fig. 9d). The surviving mice in this group behaved normally, showing no apparent sign of unhealthy condition. These results demonstrated that the administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models.

a In vivo applications of Apt-Au@MSL and photographs of the mice tumor taken 24 days. A dosage of 2 mg/kg was administrated intravenously for all mice (n = 6–8). b Tumor weight of mice in different groups after 24 days. c Tumor volume index for the different treatment groups. The tumor sizes were measured at the indicated time points. d Survival rate of the mice in different group after tumor inoculation. Data are means ± SD (n  = 6-8). The intravenous injection of PBS was set as blank group (100 μL); the treated by Morin and Morin–liposome were set as control group. In vivo therapeutic effects of Apt-Au@MSL in SGC-7901-bearing mice. Data are means ± SD, *P <0,05, ** P  < 0.01

Histological Analysis of Anticancer Activity

H&E staining of tumor tissue and organ samples was conducted after fixation and treatment. Treatment efficacy with respect to tumor cell death was also evaluated by H&E staining of tumor tissue from different groups. In Fig. 10a, the mice treated with Au-Apt, Morin, and Morin–liposomes show the same extent of thermal damage as that of the mice in the blank group. No apparent apoptosis was observed in the blank group. The tumor tissue sections consisted of tightly packed tumor cells. However, Apt-Au@MSL treatment exhibited the most significant damage to the tumor tissue, with moderate cell apoptosis in the tumor. The result suggested anticancer activity in the mouse models treated with Apt-Au@MSL. To further investigate the ratio of apoptotic cells in tumors tissue in vivo, TUNEL assay was performed for the detection of apoptotic cells. As shown in Fig. 10b, the apoptotic cells in tumors can be stained with green fluorescence to indicate apoptosis. The merged images show fewer green fluorescent regions in the blank group and the control group (Morin and Au-Apt), indicating the presence of fewer apoptotic cells. The cells of the mice treated with Morin–liposomes appear partly apoptotic. Moreover, a large number of green fluorescent regions were observed in the group treated with Apt-Au@MSL, indicating a large amount of apoptotic cells. The results were consistent with that of H&E staining, confirming that Apt-Au@MSL can promote tumor apoptosis in vivo.

a H&E staining analysis of the tumors in mice. Histological analysis of the tumors in mice following different treatments as PBS, Morin, Morin–liposome, Au-Apt, and Apt-Au@MSL group. b Apoptotic cells were detected by a TUNEL assay (green) and co-stained by nuclear staining DAPI (blue)

In Vivo Toxicity Evaluation

The potential in vivo toxicity is often a significant concern for the clinical application of anticancer medicine. To verify the applicability of Apt-Au@MSL in vivo, the mice were evaluated under different treatments (Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL). Blood biochemical assays were also conducted to examine possible changes in the biochemistry of mice after treatment. As shown in Fig. 11a, the blood glucose index for blood function of the Apt-Au@MSL groups was similar to those of the blank and control groups. No difference in body weight was found in each group. A steady increase was observed, indicating that the drug exhibited no toxicity (Fig. 11b). H&E staining of organ sections (Fig. 11c) showed no sign of damage or inflammation in the group treated with Apt-Au@MSL, compared with the blank and control group. This finding indicated that PBS, Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL were negligible side effects in vivo. These results, as well those of H&E staining, further indicate safety in the use of Apt-Au@MSL for tumor treatment.

In vivo toxicity evaluation. a Blood glucose data detected in the mouse toxicity model. b Weight of mice in different groups after 24 days. c Images of H&E-stained major organs. Each value represents the mean ± SD (n =3)

Conclusions

In conclusion, this study presents the synthesis of an antitumor nanomaterial, Apt-Au@MSL. Apt-Au@MSL exhibited excellent monodispersity and tumor-targeting properties. The polarity of Morin was modified, and the antitumor activity was enhanced. The pH of the solution was 5.0, and the release rate of Morin from Apt-Au@MSL was the maximum in the characterization experiments. Apt-Au@MSL showed that the morphology of hybrid vesicles was attributable to Au-Apt modification. The diameter of 150 nm was consistent with the size determined by DLS. We screened our model cancer cell by MTT assay and found that SGC-7901 cells could effectively suppress proliferation. O IC ₅₀ of Apt-Au@MSL was 15.6 ± 1.5 μg/mL for the SGC-7901 cells. Fluorescent flow cytometric assays confirmed that Apt-Au@MSL could be used as an effective anticancer material and induced apoptosis in vitro. The Apt-Au@MSL found in the internal cell, as shown in the TEM images, suggested that Apt-Au@MSL could target the cancer cell. The administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models, as determined from tumor weight testing. H&E staining and TUNEL assay further confirmed that Apt-Au@MSL could promote tumor apoptosis in vivo. Both blood biochemistry testing and H&E staining suggested that these materials exhibit negligible acute toxicity and good biocompatibility in vivo.

Disponibilidade de dados e materiais

The authors declare that the materials, data, and associated protocols are promptly available to the readers without undue qualifications in material transfer agreements. All data generated and analyzed during this study are included in this article.

Abreviações

Apt:

Aptamers

Apt-Au:

Aptamers and Au nanoparticle

MSL:

Morin pH-sensitive liposome

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

ROS:

Espécies que reagem ao oxigênio

Apt-Au@MSL:

Aptamers and Au nanoparticle-modified Morin pH-sensitive liposome

PC:

L-α-Phosphatidylcholine

Chol:

Cholesterol

CHEMS:

Cholesteryl hemisuccinate

PVP:

Polivinilpirrolidona

PI:

Propidium iodide

FT–IR:

Espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier

UV–Vis:

Ultraviolet–visible spectroscopy

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

PDI:

Polydispersity index

ATCC:

American Type Culture Collection

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

TUNEL:

TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling

H&E staining:

Hematoxylin-eosin staining

RTCA:

Real-time unlabeled cell analysis

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