Desenvolvimento de dose de hipertermia de nanopartículas Cs0.33WO3 irradiadas por NIR para células de câncer hepático HepG2

Resumo

A hipertermia é um dos métodos mais amigáveis para o paciente para curar doenças cancerígenas devido à sua não invasão, efeitos colaterais e toxicidade minimamente induzidos e fácil implementação, levando ao desenvolvimento de novos métodos terapêuticos, como sistema de dose de disparo fototermal. Esta pesquisa aqui interroga as variáveis dos efeitos fototérmicos do Cs _0,33 WO ₃ nanopartículas (NPs), a duração da irradiação, densidade de potência óptica e concentração de NP, sobre a linha de células de câncer de fígado HepG2 in vitro, levando à formulação de uma dose térmica irradiada no infravermelho próximo (NIR). Expressamente, os NPs com tamanhos de características particuladas de 120 nm foram sintetizados através de uma série de reação de oxidação-redução (REDOX), recozimento térmico e processos de moagem úmida, e a subsequente caracterização de propriedades físicas, composicionais, ópticas e fototérmicas foram examinadas usando dinâmica espalhamento de luz (DLS), espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDS), microscopias eletrônicas de varredura e tunelamento (SEM e TEM), difração de raios-X (XRD) e fotospectroscopia de infravermelho próximo visível (VIS – NIR). A citotoxicidade dos NPs e seus parâmetros de irradiação foram obtidos para as células HepG2. Ao incubar as células com os NPs, o estado de endocitose foi verificado, e a dependência da taxa de sobrevivência celular nos parâmetros variáveis da dose fototérmica foi determinada, mantendo a temperatura média do prato de cultura contendo células em temperatura corporal humana em torno de 36,5 ° C.

Introdução

Globalmente, no ano de 2018, as doenças oncológicas ferozes ceifaram cerca de 10 milhões de vidas e acrescentaram cerca de 18 milhões de novos casos [1]. Até agora, embora a quimioterapia, radiação, remoção cirúrgica ou combinação personalizada desses três sejam responsáveis por uma melhora na taxa de sobrevida de 5 anos ligeiramente acima de 40% dos pacientes com câncer tratados [2, 3], a natureza tóxica e deletéria dos produtos químicos e iônicos o bombardeio inevitavelmente causa inúmeros efeitos colaterais como queda de cabelo, cardiotoxicidade, infertilidade, anormalidades cromossômicas e muitos mais [4, 5]. Essas conseqüências que afetam a vida têm impulsionado fortemente o desenvolvimento de uma medicina terapêutica amigável ao paciente, incluindo compostos incorporados a NPs.

A nanotecnologia com base no sistema de material peculiar, estruturas, forma e estequiometria atômica em escala de tamanho abaixo de 100 nm produz propriedades químicas, físicas e bioquímicas sem precedentes aprimoradas pelo fenômeno de quantização e já encontrou aplicações pré-clínicas e in vitro em muitos ramos da ciências biomédicas [6, 7]. Apesar das desvantagens da quimioterapia, os NPs que servem como transportadores de entrega melhoram a seletividade da liberação do medicamento no tumor doente, facilitam a captação do medicamento pelas células tumorais e reduzem amplamente a toxicidade cumulativa no tecido saudável [8, 9]. Além disso, a qualidade da imagem produzida por uma série de modalidades de imagem baseadas em NP é bastante aprimorada com maior sensibilidade, resolução espacial mais fina e melhor penetração de profundidade para revelar a bio-distribuição, monitorar a ingestão de drogas, localizar tumor e avaliar a eficácia do tratamento [10]. Além da função diagnóstica, os NPs quando aproveitados com propriedades físicas inerentes, como ablação por radiofrequência (RF) ou hipertermia fototermicamente processada, podem induzir ainda mais danos no local desejado com maior eficiência [11,12,13], dos quais a segunda é comumente preferível em vez de sua dosagem específica para o local, menor grau de dor, baixos efeitos colaterais e risco muito reduzido de queimadura do tecido.

Até agora, os sistemas de materiais NP capazes de induzir hipertermia após fotoirradiação incluem ouro (Au), tungstato de césio (CsWO ₃ ), óxido de ferro, sulfeto de cobre, grafeno e tubo de carbono e demonstraram a aplicabilidade de impor danos letais às células cancerosas pelo aumento da temperatura extracelular ou intracelular in situ [14,15,16,17,18]. Assim como a ablação de RF aprimorada por NP, o nível de densidade de potência incidente de fontes fotônicas é uma questão crítica para a segurança clínica e conforto do paciente [11], e é manifestado que o limite máximo de exposição para pele humana na faixa de VIS e O comprimento de onda NIR entre 400 a 980 nm é de 0,2 a 0,726 W / cm ² de acordo com a International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection (ICNIRP) publicada em 2013 [19]. No entanto, a maioria das densidades de potência óptica relatadas nos estudos anteriores com células cancerígenas in vitro estavam bem além do limite de segurança para o tecido da pele, o que pode ser um problema grave quando se trata de tratar tecidos biológicos internos com um baixo limiar de fotoirradiação para vulnerabilidade. Por exemplo, a densidade de potência óptica NIR de NPs de ouro (Au) que demonstrou destruição efetiva de células cancerosas varia de 2 a 80 W / cm ² quando irradiado por não mais do que 10 min (min) [13, 14, 20,21,22]. Da mesma forma, uma variedade de outros sistemas de materiais como óxidos de grafeno [18], platina de ferro (FePt) [23] e NaYF ₄ :Nanocristais de Yb, Er [24] exigiram não menos que 150 mW / cm ² para uma implantação instrumental.

Sendo um material relativamente menos explorado para experimentos in vitro, alguns estudos relataram a aniquilação de células de câncer cervical (Hela) por CsWO irradiado por NIR ₃ NPs com pelo menos 0,72 W / cm ² [15, 25, 26] que está nas proximidades do limite de exposição do tecido da pele do comprimento de onda NIR definido pelo ICNRP e pode causar efeitos deletérios para tecidos saudáveis sob uma duração prolongada de exposição [19]. Além disso, a temperatura do meio de cultura gerada pela combinação da dose de tratamento da concentração de NP, duração da fotoexposição e intensidade óptica, nos estudos anteriores, era bem acima de 40 ° C, o que é intolerável para células humanas saudáveis e as taxas de mortalidade de células cancerosas não foram delineadas em grandes detalhes.

CsWO ₃ NP é excepcionalmente absorvente na faixa de comprimento de onda NIR de 800 nm a 2.400 nm [27] e é funcionalmente adequado para aplicação biomédica. Apesar de sua eficácia comprovada na eliminação de células cancerosas, a citotoxicidade ainda é amplamente desconhecida e o fornecimento de uma fórmula de dosagem de concentração de NP de baixa citotoxicidade, curta duração de irradiação e densidade de potência óptica dentro do limite de foto-exposição de segurança para o tecido da pele é ainda faltando.

O estudo de pesquisa neste documento tenta avaliar in vitro a viabilidade de aniquilar células de câncer hepático HepG2 cultivadas em uma placa de Petri com um diâmetro de 5,2 cm, utilizando concentração de NP não citotóxica e densidade de potência óptica bem dentro do limite de fotoexposição do tecido da pele, mantendo o temperatura do meio de cultura de células à temperatura normal do corpo humano de 36,5 ° C. Em detalhes, Cs _0,33 WO ₃ NPs com um tamanho médio de recurso centrado em torno de 120 nm foram sintetizados usando uma sequência de processos redox, recozimento térmico e moagem úmida, e caracterizados com sua morfologia de superfície, cristalinidade e propriedades ópticas e fototérmicas temporais. Além disso, os efeitos fototérmicos dos parâmetros de dose variável, duração da irradiação, concentração dos NPs e densidade de potência óptica da irradiação NIR operando no comprimento de onda central de 980 nm, na taxa de sobrevivência das células cancerosas HepG2, foram examinados e julgados como planejar uma combinação de dose de tratamento de segurança.

Métodos

Nesta pesquisa, a 102ª geração da linha celular de câncer hepático HepG2 derivada de tumor primário humano foi cultivada como um modelo experimental para avaliar a citotoxicidade imposta pelo Cs caseiro irradiado por NIR _0,33 WO ₃ NPs e avaliar as eficácias terapêuticas de várias doses térmicas bem dentro do limite de segurança para a exposição do tecido da pele e em uma concentração não tóxica de NP.

Síntese de Cs _0,33 WO ₃ NPs

O painel esquerdo da Fig. 1 ilustra o fluxograma diagramático do procedimento de síntese para óxido de césio e tungstênio (Cs _0,33 WO ₃ ) Material NP. Em resumo, os precursores químicos, ((NH ₄ ) ₂ WO ₄ ) (Alfa Aesar, 99,9% de pureza) e CsCl (Alfa Aesar, 99,9% de pureza) foram dissolvidos separadamente em 100 ml de água DI e, em seguida, misturados a 25 ° C sob agitação constante a 250 ciclos por minuto (rpm) utilizando um girador magneticamente acionado por uma hora (h). Depois de feita a agitação, a temperatura da proveta contendo a solução da mistura foi ajustada para 180 ° C e cozida até o conteúdo de água da solução ter evaporado completamente. O pó branco seco resultante foi o precursor final do Cs _0,33 Material WO3. Com o resfriador ligado, o barco de quartzo contendo pó precursor foi carregado no centro de um tubo de alta temperatura do forno e a pressão dentro do tubo do forno foi levada a 0,08 torr. Posteriormente, o precursor é aquecido a 500 ° C de temperatura juntamente com a introdução de um influxo de uma combinação de gases, H ₂ e N ₂ , em uma proporção de 90 a 10 centímetros cúbicos padrão por minuto (SCCM) para facilitar a reação redox. Após 1 h, a entrada de H ₂ o gás é desligado, o fluxo de N ₂ o gás é ajustado para 100 SCCM e a temperatura do forno é elevada para 800 ° C para recozimento térmico por uma hora. Após a conclusão dos processos, o resfriador e o forno de temperatura controlada foram desligados e o barco de quartzo foi resfriado até atingir a temperatura ambiente e removido do tubo do forno. O pó azul escuro resultante obtido do barco de quartzo é o tamanho Cs de mícron (µ) _0,33 WO ₃ em pó. Para reduzir ainda mais o tamanho da característica dos grânulos de pó, 150 g de uma solução de mistura composta por 15 g do pó µ, 3,8 g de um agente dispersante à base de copolímero para prevenir a agregação de partículas, 10 μl de agente antiespumante e DI água foi preparada, despejada em uma tigela de amostra que continha 600 g de grânulos de zircônia e foi montada na câmara de um equipamento de nanogrinder (Justnanotech Co., Taiwan). Com a velocidade e a temperatura definidas para 2.400 rodadas por minuto (RPM) e 15 ° C, os NPs são produzidos moendo o µpowder com 0,1 mm ZrO ₂ contas por 4 h, e com 0,05 mm de ZrO ₂ contas por mais 4 h. A duração total de cada processo de moagem não excede 4 h para evitar viscosidade excessiva do fluido, bem como qualquer alteração errática dos tamanhos físicos do material. A solução final após o processo de moagem foi peneirada em um filtro de poro de 0,22 μm para todas as caracterizações e experimentos subsequentes. A versão fluorescente do Cs _0,33 WO ₃ NPs (fNPs) foi feito usando o seguinte protocolo. Uma solução feita de 2 ml de fluoresceína na concentração de 28 mg / ml e 2 ml de Cs _0,33 WO ₃ Solução de NP a 1,5 mg / ml foi preparada em um béquer e colocada na tigela de um agitador ultrassônico por 15 min. Posteriormente, a solução de NP e o dispersante foram misturados na proporção de 1:1,25 e submetidos a agitação ultrassônica por 15 min. A solução resultante foi então lavada com D.I. água e centrifugado a 10.000 rpm por 15 min. e repetido duas vezes antes de qualquer uso.

Ilustração esquemática de procedimentos experimentais para síntese de material, incubação celular com NPs e ensaio fototérmico nas células cancerosas. BCL, TEn e PD são a abreviatura de lente bi-côncava, invólucro térmico e placa de Petri, respectivamente; a seta vermelha indica a localização para a medição do perfil do feixe

Caracterização do material

Posteriormente, a caracterização de Cs _0,33 WO ₃ NPs incluindo tamanhos de recursos estatísticos dos NPs, estrutura cristalina, morfologia estrutural, formato do contorno, VIS – NIR fotoabsorvância foi conduzida usando análise de potencial zeta (ZS90, Malvern, Reino Unido), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Alemanha), SEM (SU-5000, Hitachi, Japão) em conjunto com espectrometria dispersiva de energia embutida (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japão), espalhamento de luz dinâmico (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, EUA) , Espectrômetro UV – VIS – NIR (V-750, Jasco, Japão), respectivamente. Os espectros de XRD foram adquiridos por varredura de raios-X nas amostras dentro de um intervalo angular de 20 ° a 80 ° na taxa de varredura de 4 ° por minuto. O sinal de difração dependente do ângulo de varredura da amostra foi determinado e comparado com o espectro de XRD padrão de Cs _0,32 WO ₃ do Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS), cartão nº 83-1334. Para confirmar a dependência temporal da propriedade fototérmica do NP, um aparato experimental simples composto de laser NIR de comprimento de onda de 980 nm e uma sonda de medição de temperatura foi instalado para sondar o estado de temperatura gerado pela solução irradiada por NIR. As soluções de exame incluem o D.I. solução de NPs diluída em água e a mistura de solução de NPs em meios de cultura de células. O diâmetro do feixe óptico para amostras nas placas de Petri foi expandido para cobrir toda a superfície da placa de Petri, produzindo 0,05 W / cm ² na densidade de potência óptica estimada, caso contrário permaneceu intacta em 2 W / cm ² . Uma configuração óptica mostrada no painel direito da Fig. 1 é utilizada para realizar a irradiação NIR. No coração do sistema óptico está um feixe de laser NIR direcionado para uma lente bi-côncava que expande o diâmetro do feixe de 4 mm para 5,2 cm, o equivalente ao diâmetro da superfície de uma placa de Petri colocada em uma placa quente ajustada para 36,8 ° C, que é uma temperatura fisiológica para o crescimento celular; além disso, a placa de Petri é cercada por um invólucro cilíndrico de plástico para ajudar a equilibrar a temperatura do ambiente e do meio. Arquivo adicional 1:A Fig. S1 ilustra o mapeamento da intensidade óptica do feixe de laser NIR medido na saída da abertura do feixe que é indicada por uma seta vermelha ao lado do feixe de laser na Fig. 1. O perfil do feixe apresenta distribuição 3D de intensidade óptica e verifica a uniformidade do campo de luz em toda a abertura da placa de Petri.

Ensaios de citotoxicidade e fototérmicos

Para iniciar os ciclos de cultura celular, 500 ml de solução de meio composta por 440 ml de mistura de nutrientes Ham F-12 e meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco (HDMEM), 50 ml de soro fetal bovino (FBS), 5 ml de L-glutamina e 5 ml de P / S (Penicilina-Estreptomicina), que foi esterilizado por um filtro de malha com tamanho de poro de 0,22 μm, foi preparado. As células contendo placas de petri, de 10 cm ou 5,2 cm de diâmetro, correspondentemente preenchidas com 8 ml e 2 ml do meio foram usadas para cultura primária e subcultura e incubadas em uma incubadora condicionada com 5% de CO ₂ e à temperatura de 37 ° C. A observação do crescimento celular e a renovação do meio de cultura foram feitas uma vez a cada dois dias.

Para obter as taxas de sobrevivência para os casos de ensaios de células que incluem (1) controle sem entrada externa, (2) irradiação NIR única, (3) incubação com NPs e (4) incubação com NPs ao lado de uma irradiação NIR subsequente, o O meio de cultura na placa de cultura foi sugado e 0,4 ml de tripsina é adicionado à placa de cultura e colocado na incubadora por cerca de 10 min. Uma vez que a separação das células das paredes do prato é confirmada, 10 μl do meio contendo células foram retirados do prato de cultura e adicionados a 10 μl de solução de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga, e uma remoção do remanescente flutuante NPs foi feita através de vários tempos de lavagem com solução tampão de fosfato (PBS). Em seguida, a contagem das células foi realizada através do preenchimento de uma placa de contagem com 10 μl da solução celular tingida por meio de um orifício de injeção, sendo as células observadas no plano focal de um estereomicroscópio e contadas por contador manual; cada ponto de dados apresentado em todas as figuras relativas à taxa de sobrevivência celular foi uma média de três ensaios experimentais ( N =3) mais a margem do desvio padrão.

Para se preparar para a avaliação da citotoxicidade do NP e seus efeitos fototérmicos sobre a taxa de sobrevivência celular, o meio na placa de 5,2 cm foi removido e preenchido novamente com a quantidade adequada de solução de NP no novo meio para fazer uma matriz de concentração de teste, 2 mg / ml, 1,5 mg / ml, 1 mg / ml e 0,5 mg / ml, e então incubados por um dia antes do experimento.

Antes do ensaio fototérmico, a avaliação da citotoxicidade foi realizada para examinar a resposta das células a uma matriz de concentração de NP e foi realizada como segue. O meio contendo as células e NPs foi retirado da incubadora e aspirado. Um mililitro de PBS pré-aquecido foi usado para lavar as células cancerosas e sugar o CsWO flutuante remanescente ₃ NPs que não sofreram endocitose, cujo procedimento é repetido várias vezes para garantir que qualquer potencial mortalidade celular não seja causada pelo aumento de temperatura induzido por NP no novo meio. Após o tratamento fototérmico, o procedimento de contagem foi então implementado para a citotoxicidade e ensaio fototérmico nas células.

Resultados

A absorbância óptica e propriedades fototérmicas do Cs _0,33 WO ₃ nanomateriais são altamente dependentes da estrutura cristalina, temperatura pós-recozimento, estequiometria atômica e tamanhos de características particuladas [28, 29].

Para caracterizar a morfologia da superfície do Cs _0,33 WO ₃ µpó, imagens SEM com aumento de 10.000X foram adquiridas para confirmação visual da estrutura icônica do hexágono colunar indicada por uma seta vermelha na Fig. 2a. Além disso, as imagens TEM exibem a forma do contorno e os tamanhos dos recursos do grânulo de pó µ na Fig. 2b, onde o tamanho do recurso é de cerca de 1 μm ou menos. A geometria em forma de bastão dos NPs e o histograma de distribuição DLS de tamanho de característica em nanoescala centrado em torno de 120 nm também foram verificados e são apresentados na Fig. 2c e a imagem TEM de inserção correspondente. Além disso, a caracterização cristalina do µpowder e NPs com XRD é apresentada na Fig. 2d. Como pode ser observado a partir do espectro de XRD do pó no painel superior, os planos icônicos de cristalização ao longo de (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220 ), (222), (204), (400) e (224) coincidem bem com o espectro padrão de Cs _0,32 WO ₃ do Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS), cartão nº 83-1334. Quando o tamanho do recurso µpowder reduz até 120 nm, as intensidades de todos os picos de difração são reduzidos monotonicamente, e alguns picos característicos que indicam forte absorção de NIR, como os planos (102) e (220), são diminuídos invisivelmente no espectro. Da mesma forma, a identificação dos constituintes atômicos, césio (Cs), tungstênio (W) e oxigênio (O), mostrados na Fig. 2e, não apenas confirma sua presença atômica, mas também autentica a razão das porcentagens atômicas de Cs para W, 0,315 , assemelhando-se muito à estequiometria inicialmente projetada.

Caracterização física e material. a SEM e b Imagens TEM do µpowder, c Histograma de distribuição DLS do tamanho do recurso NP, d Espectros de XRD de µpowder e NPs de 120 nm, e e Espectro EDS com porcentagem da composição atômica é apresentado. As barras de escala em a , b , c são 1,5 μm, 200 nm e 100 nm, respectivamente

No topo da caracterização do material, os espectros de absorbância óptica dos NPs e a modulação fototérmica de curso de tempo na temperatura foram medidos e são apresentados na Fig. 3. Em (a, b), a dependência da absorbância do NIR e os perfis de aumento de temperatura induzidos pelo NIR solução de NP irradiada como uma função da concentração de NP são representados, onde o gráfico de temperatura de curso de tempo de 1 mg / ml, por exemplo, atinge 40 ° C e permanece constante por pelo menos 1 h, confirmando a estabilidade fototérmica e durabilidade dos materiais . Da mesma forma, o perfil de temperatura de curso de tempo na Fig. 3c ilustra 5 ciclos repetitivos em 190 min, verificando a capacidade de resposta fototérmica do material NP. Na Fig. 3d, os perfis temporais de temperatura do meio de cultura e do meio de cultura NP-incorporado, retirados da incubadora, colocados na placa de aquecimento e submetidos à irradiação NIR, estabilizam em cerca de 37 ° C ao longo de 10 min., E a temperatura da solução de NP puro com irradiação NIR sobe de 24,6 ° C até 33,6 ° C após 10 min. Assim, considerando a funcionalidade fototérmica do NP, a irradiação NIR para o experimento seguinte foi conduzida por 10 min, 30 min e 60 min, mantendo a robustez dos NPs durante a sessão experimental e sendo potencialmente aplicável a estudos pré-clínicos.

Propriedades ópticas e fototérmicas. a Os espectros de absorbância óptica e os perfis de temperatura ao longo do tempo da solução NP irradiada por NIR em b , c uma cuvete e em d uma placa de Petri é retratada. Ex simboliza os perfis de caixas expandidas por viga; Concentração de NP de 1,5 mg / ml e densidade de potência óptica de 50 mW / cm ² foram usados em ( d ); a duração da irradiação NIR por ciclo em c é de 15 min

Posteriormente, a dose não tóxica dos parâmetros experimentais, incluindo a duração da irradiação NIR e a concentração de NP, foi determinada irradiando as células por 1 he 2 h a 50 mW / cm ² e através da interação direta com os NPs de 0,5 mg / ml, 1 mg / ml, 1,5 mg / ml e 2 mg / ml em concentração, que são representados nas Fig. 4a, b, respectivamente. A taxa de sobrevivência celular permanece bem acima de 95% ao longo de 2 h de irradiação NIR, confirmando a não toxicidade das células para uma exposição de longo prazo ao fóton de 980 nm, e também, a concentração não tóxica de NP abaixo de 1,5 mg / ml foi determinado.

Ensaio de citotoxicidade de parâmetros experimentais. A taxa de sobrevivência de células HepG2 quando administradas com a a duração da irradiação NIR, b São apresentados NPs de 120 nm de várias concentrações. A duração da incubação NP foi de um dia; o desvio padrão de três ensaios experimentais ( N =3) para cada ponto de dados é indicado

O objetivo de dosar as células cancerosas a 1,5 mg / ml ou menos, que quase não tem efeito prejudicial às células HepG2, é examinar os efeitos da dose fototérmica nas células cancerosas sem a implicação da toxicidade inerente do NP. Para examinar se os NPs irradiados com NIR podem ser uma solução viável para eliminar as células cancerosas, as células foram incubadas com NPs a 1,5 mg / ml por um dia e, posteriormente, impostas à radiação NIR por 1 h. Como pode ser visto nas imagens ópticas de campo claro (BF) da Fig. 5d – f, o número de células é claramente reduzido quando o tempo de exposição dura 1 h (e) ou 2 h (f). Quantitativamente, a taxa de sobrevivência diminui monotonicamente de 84,2% para 58,4% à medida que a duração da irradiação aumenta de 10 min. a 1 h, e uma linha de tendência linear se encaixa bem entre os pontos de dados dispersos, o que prevê 20% da taxa de sobrevivência quando a irradiação dura 2 h. Além disso, a Fig. 5h indica que para 1 h de irradiação, a taxa de sobrevivência diminui de 73 para 58% à medida que a densidade de potência óptica aumenta de 12,5 para 50 mW / cm ² , averiguando a funcionalidade dos NPs irradiados com NIR como um gatilho fototérmico na destruição de células cancerosas.

Ensaio fototérmico. A taxa de sobrevivência de células HepG2 quando administradas com a concentração de NP de 1,5 mg / ml ao lado da irradiação NIR. As respectivas barras de escala no a - c topo e d - f as linhas inferiores das imagens ópticas BF são 200 μm e 100 μm. O desvio padrão de três ensaios experimentais ( N =3) para cada ponto de dados é indicado

Além disso, a incerteza sobre se tal ação fototérmica ocorria de forma intracelular ou extracelular foi resolvida preparando os fNPs, realizando o mesmo procedimento de lavagem e incubação e observando qualquer presença intracelular dos fNPs. A Figura 6 ilustra imagens confocais de BF (b, e) e fluorescência (a, d) e seus compostos sobrepostos (c, f) das células incubadas com e sem os fNPs. Evidentemente, as células sem incubação de fNPs como controle exibem fluorescência verde desprezível, que é principalmente atribuída à autofluorescência celular, ficando em nítido contraste com o experimental, onde a distribuição de fluorescência verde é onipresente em todo o citoplasma encontrado na imagem. As intensidades médias de fluorescência nas imagens das amostras de controle e experimentais também foram quantificadas e são apresentadas no histograma da Fig. 6g, onde a fluorescência dos fNPs submetidos à endocitose é pelo menos nove vezes mais forte que o controle.

Imagens ópticas confocais. O a , d fluorescência, b , e BF e c , f imagens ópticas compostas das células HepG2 incubadas com e sem os fNPs, como os grupos experimentais e de controle correspondentes, são apresentadas no a - c topo e d - f linhas inferiores ao lado de g um histograma das intensidades médias de fluorescência. Barras de escala representam 20 μm; o comprimento de onda de excitação do laser é 488 nm

Discussão

O conceito de hipertermia terapêutica usando ondas eletromagnéticas na cura de doenças cancerígenas remonta ao início de 1900 e teve sucesso na redução de algumas formas de doenças malignas, mas, no entanto, diminuiu devido à utilidade de agentes antibacterianos indutores de febre e à falta de acessibilidade ao tumor local de interesse in situ [30]. Só na década de 1980, o interesse foi reavivado com vários estudos in vitro que descobriram muitos aspectos das alterações metabólicas, alteração da microcirculação tumoral e acidólise após o tratamento da hipertermia, produzindo efeitos letais nas células cancerosas [31]. Mecanicamente, além da citotoxicidade direta na qual as células cancerosas sofrem necrose com uma apoptose decrescente quando a temperatura aplicada é> 42 ° C, a taxa de fluxo sanguíneo reduzida em associação com menor capacidade de resfriamento e baixo pH (<6,8) tornam as células cancerosas mais suscetíveis a aquecimento e, consequentemente, uma maior taxa de morte de células [32, 33]. No entanto, clinicamente, devido à desvantagem centenária da localização imprecisa não específica, a hipertermia só encontrou maior eficácia terapêutica quando aplicada concomitantemente com quimio ou radioterapia [34, 35].

Os materiais baseados em NP que permitem direcionamento e monitoramento precisos e têm uma ampla gama de propriedades físicas, como carga de superfície, fluorescência, conversão fototérmica, se encaixam perfeitamente no nicho de tal imprecisão na aplicação de hipertermia. No entanto, apesar da utilidade comprovada de muitos materiais NP irradiados com NIR em estudos de células cancerígenas, o limite de segurança da fotoexposição muitas vezes não é bem examinado como no caso de CsWO ₃ NPs. CsWO ₃ NPs, no entanto, como mostrado na Fig. 4b, tem citotoxicidade relativamente baixa a 1,5 mg / ml quando comparada a um punhado de materiais NP populares, como Ag, Au, grafeno, cujos limites estão na escala de 1 μg / ml [ 18, 36, 37], ainda requer 0,7 W / cm ² para uma destruição efetiva de células Hela, apesar de sua forte absorção de NIR na faixa de comprimento de onda de 800 nm a 2400 nm [15, 25, 26].

Este estudo de pesquisa pretende conceber um eficaz desencadeado por irradiação NIR, Cs _0,33 WO ₃ Fórmula de dosagem térmica baseada em NP para células cancerosas HepG2 in vitro em função da concentração de NP, duração da irradiação e densidade de potência óptica bem dentro do limite de exposição NIR para o tecido da pele.

O experimento começa com a síntese dos NPs, onde um procedimento sintético passo a passo, incluindo reação redox, processo de recozimento e método de moagem úmida é descrito na Fig. 1. A reação redox incorpora grandes elementos ternários, Cs, neste caso, em anéis de estrutura octaédrica de WO ₆ em um ambiente físico adequado, permitindo a formação de estrutura cristalina peculiar e incorporação de elétron livre no composto molecular metálico, que é a razão intrínseca para a forte conversão fototérmica na absorção de NIR [26, 27]. Além disso, os processos subsequentes de recozimento e moagem úmida ajudaram a refinar a formação cristalina e reduzir o tamanho do recurso de partículas que aumentam ainda mais a conversão fototérmica NIR. Posteriormente, a solução NP sintetizada procedeu com uma série de caracterização física e material que verifica um tamanho médio de feição de 120 nm, uma otimização crítica da absorção de NIR e autentica a composição atômica (Fig. 2). Além disso, a medição correspondente do potencial zeta para 0,5 mg / ml, 1 mg / ml e 1,5 mg / ml são - 53,2 mV, - 54,3 mV, - 60,1 mV. Geralmente, o processo de endocitose é a principal via de entrada para a maioria dos tipos de NP, e a taxa de captação de NPs catiônicos e iônicos para células não fagocíticas é maior do que entidades neutras, embora o primeiro tenha um desempenho melhor do que o posterior [38]. Além disso, muitos relatórios anteriores encontraram NPs carregados negativamente menos tóxicos para células não fagocíticas [39, 40], o que é um mérito benéfico quando um acúmulo excessivo de NP intracelular para dose fototérmica acompanhada de uma baixa toxicidade é considerado.

To set up a tone for the photothermal assay upon the HepG2 cells, the assessment of the NPs' robustness as a photothermal heater, its long-term stability at saturated temperature in equilibrium with the ambient environment over an hour and the repeatability for 5 consecutive cycles within 3 h were demonstrated (Fig. 3b, c). Also, to quantify the effectiveness of the NP's hyperthermia per se in dosing the cancer cells by ruling out the influence of ambient temperature (nominally at 25 °C), a calibration of the experimental apparatus was implemented by setting a hotplate to 37 °C, atop which all cell assays were carried out, and the temporally photothermal characteristics of the pure culture medium and NP-incorporated culture medium remained at 37.1 °C (Fig. 3d). Thereafter, the dependence of cytotoxicity on the duration of irradiation and NP concentration was examined separately and is presented in Fig. 4 indicating less than 5% of cell killing for over 2 h of NIR-irradiation and 1.5 mg/ml as the pivotal point toward lethal concentration. By fixing the NP concentration at 1.5 mg/ml, which was used throughout the rest of photothermal assay, the thermal dose for medical hyperthermia was defined as functions of variable dosing duration and optical power density. Figure 5 illustrates the action of cell killing with low (a–c) and high (d–f) magnification when NIR-irradiation for 0 h, 1 h and 2 h was implemented, the seemingly reduced number in the cells reflects well the quantitative analysis of cell survival rate as shown in (g), and the linear trend line predicts 80% of cell death for 2 h of irradiation. Likewise, the decrease in cell survival rate upon the incremental optical power density is also demonstrated in (h). Lastly, as clearly depicted by the BF, fluorescence and superimposed composite images in Fig. 6, in which a histogram of fluorescence analysis was presented, the endocytosis of the fNPs was verified.

Conclusão

In summary, this study presents material synthesis and characterization of Cs_0.33 WO₃ NPs, examines in vitro cytotoxicity assays of the direct NPs interaction, and separately, with NIR irradiation, and proves the endocytosis of the NPs as well as effectiveness of the NIR-irradiated NPs upon destructing the HepG2 cancer cells. Moreover, this study suggests a combinative dose of the NIR-irradiated Cs_0.33 WO₃ NPs solution for the HepG2 cancer cells, 1.5 mg/ml of NP concentration, the duration of irradiation between 30 min. to 1 h, and optical power densities of NIR irradiation under 50 mW/cm² which is well below the safety NIR exposure limit for skin tissue while allowing cancer cell mortality rate close to 40% and may be potentially applicable to the development of patient-friendly and personalized medicine. Such studies in a clinical setting will require additional measures like surface modification with molecules that recognize surface receptors of specific cancer cell types.